Un método mejorado para la rápida intubación de la tráquea en ratones

Resumen

En este artículo se presenta un método rápido y sencillo para la administración de bleomicina directamente en la tráquea ratón a través de la intubación. Las principales ventajas de este método son que es altamente reproducible, fácil de dominar, y no requiere equipo especializado ni largos tiempos de recuperación.

Resumen

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

Introducción

A pesar de algunas diferencias anatómicas y fisiológicas, ^{1 modelos} murinos continúan siendo de gran valor para el modelado de la biología humana y la patogénesis de la enfermedad. ² Desde un punto de vista de la cría, los ratones son fáciles de manejar, tienen un tiempo de reproducción de baja, una esperanza de vida acelerada, y son relativamente baratos a casa. Con el desarrollo de diversas cepas genéticas y estrategias (por ejemplo., Knock-out condicionales, ratones reportero, enfoques de linaje de trazado, etc.), así como la amplia gama de reactivos disponibles (por ejemplo., Anticuerpos, proteínas recombinantes, inhibidores, etc.), los ratones se han convertido en un organismo modelo de vertebrados esencial para descubrir los procesos de homeostasis y enfermedades humanas. ³

Los ratones han sido especialmente valiosa para el estudio de enfermedades pulmonares, incluyendo lesión pulmonar aguda (ALI) y fibrosis pulmonar. ⁴ ALI en los seres humanos puede ser causado por trauma, lesión o sepsis y se caracteriza por epitelial yfuga endotelial (es decir., edema), la inflamación y la fibrosis incipiente. En muchos pacientes, ALI progresa a su forma severa, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), que a menudo resulta en la fibrosis y la muerte por insuficiencia respiratoria. ^5,6 La fibrosis pulmonar es una patología progresiva y fatal que se caracteriza por el exceso de deposición de la matriz extracelular , especialmente colágeno de tipo I, que lleva a la función pulmonar. ^7,8 administración de bleomicina (BLM) es el modelo más ampliamente utilizado y mejor caracterizado para inducir ALI y fibrosis en animales de experimentación. ⁹ Aunque BLM inducida por la fibrosis pulmonar en roedores hace no recapitular completamente los fenotipos fibróticos humanos, ¹⁰ estudios con ratones con este modelo han llevado al descubrimiento de muchos factores importantes que influyen en la aparición y progresión de la enfermedad. ¹¹

Aunque el mecanismo exacto (s) detrás de la fibrogénesis BLM inducida son desconocidos, la lesión iniciarse cree que surgen de la ruptura de cadenas de ADN dependientes del contacto en las células epiteliales que recubren las vías aéreas y los alvéolos, y, en particular, tipo 1 neumocitos. ¹² La necesidad de un contacto directo entre la BLM y el epitelio pulmonar pone de relieve la importancia de una vía de administración robusta , y estas preocupaciones también son pertinentes para una amplia gama de tratamientos dirigidos a las vías respiratorias distales, incluyendo las proteínas recombinantes, anticuerpos, siRNA, virus, bacterias, partículas, y más. Aspiración orofaríngea (OPA) ha sido ampliamente utilizado para este fin ^13, pero un importante una deficiencia de OPA es que alguna porción del agente suministrado puede ser tragado en el tracto gastrointestinal, lo que conduce a la imprecisión en la dosis administrada. Otro método ampliamente utilizado es la instilación transtraqueal, que implica la traqueostomía con anestesia fuerte como para exponer la tráquea y la instilación de un agente directamente en el tracto respiratorio. ¹⁴ Sin embargo, no sólo puede talesun procedimiento sea indeseable debido a su invasividad, pero también es mucho tiempo, requiere un poco de entrenamiento, y causa una lesión potente para el tracto respiratorio. ^15,16 Varios protocolos se han desarrollado que implican la administración directa de los agentes en el tráquea sin la necesidad de intervención quirúrgica, ^{16,17,18,19,20} tiempos de recuperación pero estos métodos implican extendían causada por anestésicos potentes, el uso de equipo costoso (es decir., otoscopio / laringoscopio, tableros de procedimientos disponibles en el mercado, de fibra óptica cables, etc.), un exceso de manipulación en la cavidad oral, y la incertidumbre con respecto a la dosis.

Este documento describe un método relativamente fácil de administración a través de intubación que permite al investigador rápida, económica y fiable a infundir un reactivo en el pulmón murino con riesgo limitado de daño residual a los tejidos circundantes.

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Protocolo

Los Comités Institucionales Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Washington y el Cedars-Sinai Medical Center han aprobado el trabajo con animales necesarios para estos estudios.

1. Preparación

1. Esterilizar tanto las pinzas de extremos romos y el depresor través de autoclave.
2. El uso de una cabina de seguridad biológica, preparar una solución de trabajo de la BLM en PBS a partir del polvo liofilizado. Sonicar la solución durante 10 min a 35 Khz para asegurar una mezcla uniforme.
   Nota: Se recomienda un volumen total de entre 30 y 45 l para evitar la variación de pipeteado en el extremo inferior, y la asfixia con volúmenes más grandes.
3. Prepare un área de trabajo limpia que incluye aproximadamente 1 ^m 2 para el procedimiento en sí, así como los lugares designados para jaulas, tanto antes como después del procedimiento.
4. Fijar la base de la junta procedimiento para el banco inmediatamente delante del investigador poniendo 2 o 3 tiras de cinta de laboratorio a través de la base y SUBCARying banco. Ver Figura 1 para más especificaciones sobre la creación de una tabla.
5. Ate una sola longitud de tamaño de 4.0 hilo de sutura entre los dos tornillos de posicionamiento de la junta procedimiento.
6. Generar un espirómetro improvisada eliminando y desechando el émbolo de tres jeringas de 1 ml, y el depósito de 60 l de PBS en la parte superior de cada barril para formar un sello hermético. Asegurar el centro del catéter vagamente a una de las jeringas y colocarlo a un lado de la junta.
7. Aspirado de 300 l de aire en una jeringa de 1 ml y colocarlo a un lado de la junta.
8. Cortar una pieza adicional de cinta de aproximadamente 6 pulgadas de largo y el lugar de uno de los lados. Esto se utiliza para asegurar el animal a la junta en el paso 2.4.
9. Configurar una cámara de isoflurano. Adjuntar _O2, isoflurano, y el vacío a los puertos apropiados tanto en la cámara de exposición y el vacío despacho. Alternativamente, administrar anestésico en un isoflurano-compatible biológicacabina de seguridad.

2. La intubación

1. Anestesiar al ratón con isoflurano en la cámara hasta que se pierde la conciencia y la respiración se desacelera a un ritmo adecuado. Una exposición típica incluye 4% de isoflurano y 2% O ₂ durante 3 a 4 minutos, y el resultado ideal es de 2 a 2,5 min de sedación. Esto corresponde a una tasa de respiración de 1 respiración cada 2 seg.
2. A la espera de la sedación a instaurarse, aspirado de entre 30 y 45 l de BLM en una pipeta y el lugar de uno de los lados.
3. Cuando esté listo, suspender el ratón sedado por sus incisivos superiores desde el hilo unido a los tornillos de posicionamiento de la plataforma procedimiento. Asegúrese de que el dorso del animal quede plana contra la superficie de la plataforma.
4. Teniendo cuidado de no restringir la ventilación, coloque un trozo de cinta sin apretar a través de la parte inferior (caudal) de la cavidad torácica, justo por encima del diafragma. La colocación debe ser lo suficientemente apretado para mantener la alineación adecuada durante el procedure, pero no tan apretado que restringe la respiración.
5. Encender el iluminador a entre 80% y 100% de intensidad y orientar el cuello de cisne de modo que es de 1 a 2 cm de la superficie de la piel, cerca del plexo solar. revisar periódicamente la punta del cuello de cisne para el calor para asegurarse de que no perjudique el ratón.
6. De pie detrás de la plataforma, utilizar las pinzas de punta roma, estériles para localizar la lengua. Teniendo cuidado de evitar los incisivos inferiores, suavemente agarre y sacar la lengua fuera de la cavidad oral.
7. Usando la mano restante, inserte el depresor y utilizarlo para aplanar la lengua contra el suelo de la cavidad oral. Liberar la pinza, pero deje el depresor en el lugar durante los siguientes dos pasos.
8. Oriente la luz para que la tráquea es visible al guiar el cuello de cisne proximalmente desde el nivel del plexo solar hasta que alcanza el nivel de la bronquios principales.
   Nota: La tráquea se puede distinguir fácilmente por la acción de la respiración, WHIch hace que la luz emitida a fluctuar en intensidad. Cuando está colocado correctamente, esta estructura será discernible en el plano axial como un pasador situado en el centro de la luz con la luz ambiental mínimo en la propia cavidad oral.
9. Ángulo de la jeringa para que siga el camino natural de la tráquea, y bajar la punta del catéter 22-G, con la jeringa unida que contiene la gota, directamente en el lumen. La burbuja PBS comenzará a subir y bajar con cada respiración sobre la colocacion exitosa.
   Nota: Esta acción se puede retrasar por varios segundos, como resultado de la sedación profunda.
10. Alimentar el catéter en un 5 mm adicionales. Retire el depresor de lengua.
11. Cambiar la jeringa con la mano opuesta, y agarrando el cubo, retire suavemente la jeringa.
12. Fuerte entre 30 y 45 l de BLM en el centro del interior del cubo del catéter, coloque la segunda jeringa y dispensar 300 l de aire en el cubo.
13. Vuelva a colocar la segundajeringa con la primera que contiene la burbuja de PBS. La burbuja seguirá subiendo y bajando si el procedimiento se ha realizado con éxito.

3. Cuidado post-procedimental

1. Retirar el catéter y cinta, y colocar al animal en un lugar cálido y seco hasta que se recupere la conciencia - por lo general dentro de un par de minutos.

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Resultados

Ratones intubados se controlaron diariamente para la pérdida de peso y la angustia, y se sacrificaron 4, 10 o 17 días más tarde a través de inyección intraperitoneal de 2,5% 2,2,2 tribromoetanol. Se recogió el lavado broncoalveolar (BAL) en tres lavados de PBS como se describe en otra parte ²¹ y el pulmón derecho se fijó en formalina al 10%, embebidos en parafina, y se tiñeron con tricrómico de Masson por la Universidad de Washington Histología y I...

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Discusión

En los casos en que la aerosolización es poco práctico debido a la limitada disponibilidad de reactivos, la seguridad, o el coste, la administración directa de la tráquea es un método superior para la administración de agentes exógenos en los pulmones ¹⁶ transtraqueal instilación ha sido ampliamente utilizado para lograr esto.; Sin embargo, como con cualquier intervención quirúrgica, sino que también lleva consigo la posibilidad de complicaciones causadas por el procedimiento en sí, y no necesaria...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin For Injection, 30 units/vial	APP Pharmaceuticals, LLC	103720	For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots
Blunt End Forceps
Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4")	Covidien	E1551G	Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm  from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions.
Exel Safelet Catheter 22G X 1"	Exel International	26746
1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca)	BD	309659
0.2 ml Pipettor and Filter Tips
Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator	Dolan Jenner Industries, Inc.	181-1	Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea.
Intubation Board			See Diagram 1.
Colored Label Tape: 0.5 in. Wide	Fisherbrand	15-901-15A
Oxygen
Phosphate-Buffered Saline, 1X	Corning	21-040-CV	Product should be sterile
Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0	Harvard Apparatus	517698
Table Top Anesthesia Machine Isoflurane	Highland Medical Equipment		http://www.highlandmedical.net/
Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber	MIP / Anesthesia Technologies	AS-01-0530-SM
FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL	Baxter	1001936040
Nanozoomer Digital Pathology system	Hamamatsu
IgM ELISA Quantification Kit	Bethyl Laboratories	E90-101