Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Resumen

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Resumen

Las células dendríticas (DC) son las células presentadoras de antígeno profesionales principalmente responsable de la adquisición, procesamiento y presentación de antígenos en moléculas presentadoras de antígenos para iniciar la inmunidad mediada por células T. Las células dendríticas se pueden separar en varios subconjuntos fenotípicamente y funcionalmente heterogéneos. Tres importantes subconjuntos de células dendríticas esplénicas son plasmocitoide, células CD8a ^POS y CD8a ^Neg. Las DCs plasmacitoides son productores naturales de interferón de tipo I y son importantes para la inmunidad de células T anti-viral. El subconjunto CD8a ^Neg DC está especializada para MHC de clase II presentación de antígenos y está implicado en el centro de cebado de células T CD4. El CD8a ^Pos países en desarrollo son los principales responsables de la presentación cruzada de antígenos exógenos y sensibilización de las células T CD8. Los CD8a ^Pos DC han demostrado ser más eficaz en la presentación de antígenos glicolípidos por moléculas CD1d a un cel T especializadal población conocidas como células T asesinas naturales invariantes (iNKT). La administración de Flt-3 ligando aumenta la frecuencia de la migración de progenitores de células dendríticas de la médula ósea, lo que se traduce en la expansión de las células dendríticas en los órganos linfoides periféricos en modelos murinos. Hemos adaptado este modelo para purificar grandes cantidades de células dendríticas funcionales para su uso en experimentos de transferencia de células para comparar dominio in vivo de diferentes subconjuntos de DC.

Introducción

Las células dendríticas (DC) fueron descubiertos hace casi cuarenta años como el "gran estrelladas (griego dendron) celular" que se encuentra en los órganos linfoides ^1. Muchos estudios han demostrado que los países en desarrollo son las únicas células que presentan antígenos que pueden estimular eficazmente las células T ingenuas ^2. Una función importante de estas células es la captación y presentación de antígenos y su procesamiento eficaz y la carga de éstos a las moléculas presentadoras de antígeno. En bazo de ratón, las DC se puede separar en plasmocitoide y subconjuntos convencionales. Las DCs plasmacitoides se caracterizan por una baja expresión de CD11c y altos niveles de B220 y Gr-1. Ellos también son positivas para el marcador de superficie mPDCA1 y secretan interferón de tipo I en respuesta al número 9 como ligandos del receptor (TLR9). Las CD convencionales son demasiado altos para CD11c y MHC clase II expresión. Ellos se pueden dividir en tres subconjuntos distintos basados ​​en la expresión superficial de marcadores fenotípicos tales como CD4, CD8a, DEC205, CD11b y las células dendríticas del receptor inhibitorio 2 (DCIR2, reconocido por el anticuerpo 33D1) proteínas ^3,4. Los CD8a ^Pos DC también se conocen como Cdc1, son positivas para DEC205, pero negativas para los marcadores mieloides tales como CD11b y 33D1. El CD8a ^Neg DC, también llamado cdc2, son positivos para 33D1, CD11b y CD4, pero carecen de DEC205. El subgrupo negativo doble (es decir, negativo para CD4 y CD8a) es relativamente poco frecuente, y es negativa para DEC205 y 33D1. Es el subconjunto menos caracterizado y puede ser una forma menos diferenciadas de CD8a ^Neg DC.

Las diferencias fenotípicas en los diferentes subconjuntos de DC se extienden también a sus funciones in vivo. El CD8a ^Neg los DC son altamente fagocítica y se cree que presentar el antígeno exógeno principalmente a través de MHC de clase II de células T CD4 ^3. Por el contrario, los países en desarrollo ^Pos CD8a son especializados para la presentación de antígeno de proteína soluble en MHC de clase Ien un mecanismo denominado presentación cruzada. El resultado de la presentación cruzada depende del estado de activación de estas DCs ^5, y puede o bien conducir a la expansión de las células T citotóxicas (CTL) o el desarrollo de células T reguladoras ^{6 2,7.} Focalización del antígeno a CD8a ^Pos DC usando resultados de la entrega mediada por anti-DEC205-anticuerpo en gran medida en la eliminación de las células T ^8, mientras que la presentación de antígenos derivados de células apoptóticas infectadas induce una fuerte respuesta CTL ^9.

Además del reconocimiento de antígenos peptídicos, el sistema inmune de los mamíferos ha evolucionado para reconocer los antígenos de lípidos y glicolípidos. Estos antígenos son presentados por moléculas CD1, que son proteínas de la superficie celular-I como de clase MHC que existen en múltiples formas relacionadas en diversos mamíferos. En ratones, un solo tipo de molécula de CD1 altamente conservada llamada CD1d es responsable de la presentación de antígenos glicolípidos ^10. El mayor población de células T que reconocen complejos CD1d / glicolípidos se llama células NKT invariantes (células iNKT). Estas células expresan un receptor de células T semi-invariante (TCR) compuesto por una cadena invariante TCRα que se empareja con cadenas TCR que han diversidad ¹¹ limitados. A diferencia de las células T convencionales que necesitan para proliferar y diferenciarse para convertirse en células T efectoras activadas, existen células iNKT como una población efectora y comenzar a responder rápidamente después de la administración glicolípido ^12. Identificación de células presentadoras de antígeno de lípidos fisiológicamente relevante es un área activa de investigación, y se han sugerido varios tipos de células diferenciadas, tales como las células B, los macrófagos y las CD para realizar esta función. Sin embargo, se demostró que el subconjunto CD8a ^Pos de las DC es la célula primaria que media la captación y presentación de antígenos a las células de lípidos iNKT ratón ¹³ y glicolípido mediada cebado cruzado de células T CD8 ^14.

ove_content "> Para comparar la eficiencia de la presentación de antígenos por diferentes células presentadoras de antígenos, un enfoque directo es la transferencia de los diferentes tipos de APCs purificadas pulsadas con cantidades equivalentes de antígeno en huéspedes tratados previamente. experimentos de transferencia de células de este tipo se realiza a menudo para estudios inmunológicos. Sin embargo, la realización de estudios de transferencia con las DC tratadas ex antígeno in vivo es un reto, ya que estas células existen poblaciones tan raros en los órganos linfoides en las que constituyen menos del 2% del total de células ^15. por tanto, es necesario mejorar el desarrollo de estas células en los animales donantes para aumentar la eficacia de los protocolos de aislamiento.

Se sabe que la linfoide común y progenitores mieloides comunes, que son necesarios para la generación de pDC, CD8 ^Pos y subconjuntos CD8 ^Neg DC, expresa fms relacionadas receptor tirosina quinasa 3 (Flt-3). A in vivo Flt-3 ligando (Flt-3L) administración, emigration de Flt-3 que expresan las células progenitoras de la médula ósea se incrementa, lo que resulta en el aumento de la siembra de los órganos linfoides periféricos y la expansión de su progenie madura DC ^16. La expresión de Flt-3 se pierde durante el compromiso con el B, T o NK vías de diferenciación celular. Por lo tanto, sólo alteraciones mínimas se observan en estas células tras la administración Flt-3L. Expansión similares en las poblaciones de DC se observa en ratones con tumores generados por la implantación de una línea celular B16-melanoma secretoras de murino Flt-3L, que proporciona un método sencillo y económico para proporcionar niveles sistémicos sostenidos de Flt-3L ^17,18. Usando este enfoque, hemos desarrollado un protocolo basado en la implantación de células B16 melanoma secretoras de Flt-3L para estimular la expansión de todos los subconjuntos normales de corriente continua en el bazo del ratón, lo que aumenta en gran medida los rendimientos de estas células que se pueden aislar para experimentos posteriores . constantemente nos encontramos con que dentro de 10 - 14 días después de im subcutáneaplantación del tumor secretor de Flt-3, los ratones desarrollan esplenomegalia marcada con el enriquecimiento de las DC para constituir 40 - 60% del total de células de bazo. A partir de estos bazos, diferentes subconjuntos de DC se pueden aislar con alta pureza usando el estándar kits de purificación de células disponibles en el mercado que emplean marcadores fenotípicos-subconjunto específico.

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Protocolo

Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices aprobadas por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el uso (IACUC). Todos los procedimientos que requieren la esterilidad se llevan a cabo en una cabina de bioseguridad.

1. Implantación de B16.Flt3L melanoma en ratones

1. Cultura la expresión de línea de Flt-3 B16 melanoma celular en T25 matraces de cultivo tisular a una densidad de 0,5 x 10 ⁶ células / ml en medio completo DMEM con 10% de _CO2 a 37 ° C. Creciendo hasta que las células alcanzan ~ 90% de confluencia (~ 20 h).
2. Recoger las células por digestión con tripsina. Aspirar los medios de cultivo celular y se lavan las células adherentes con PBS. Añadir 5 ml de tripsina al 0,05% y se incuba durante 5 min a 37 ° C. Añadir 20 ml fríos medio completo DMEM (4 ° C) que contiene suero de ternera fetal (FCS) para extinguir la digestión con proteasas. Levantar las células fuera golpeando ligeramente seguido pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
3. Recoger las células por centrifugación a 300xg durante 10 min a 4 ° C. Contar las células utilizando un hemocitómetro o un contador de la viabilidad celular automatizado. Resuspender a una densidad de 10 ⁸ células / ml en PBS.
4. Ratones implante (C57BL / 6 o de otra cepa histocompatible) con células tumorales mediante inyección subcutánea como se describe por Machholz et al. ¹⁹ en la base del cuello con 100 l de suspensión de células (10 ⁷ células).
5. Deje que el tumor crezca hasta palpables o visibles (2 - 10 mm de diámetro, generalmente 7 - 12 días) antes de sacrificar animales para la extracción de órganos.

2. Preparación de esplénica suspensión de células individuales a partir de ratones portadores de tumor

1. Anestesiar a los ratones con una sobredosis de isoflurano (ajuste la velocidad de flujo de isoflurano a> 5% y continuar la exposición al menos 2 minutos después de dejar de respirar). Sacrificar el ratón portador de un tumor de melanoma Flt-3 por dislocación cervical según las directrices institucionales para la eutanasia.
2. disinfect la piel con 70% de etanol y el bazo cosecha utilizando una técnica aséptica con la ayuda de unas tijeras estériles ^20.
3. Coloque el bazo en una placa de Petri estéril para su transporte a la cabina de bioseguridad. Realizar todos los pasos de aquí en adelante en condiciones estériles.
4. Transferencia de bazo a un plato fresco Petri y se lava con medio RPMI. Cortar el bazo en trozos pequeños (~ 0,2 cm ²⁾ utilizando un bisturí. Incubar durante 30 min a 37 ° C con 10 ml de solución de colagenasa / DNasa.
5. Se vierte la suspensión parcialmente digerido de tejido esplénico en un filtro de células de 70 micras. Comprimir los fragmentos de tejido restante a través de la malla del filtro utilizando un émbolo de la jeringa 5 ml.
6. Lavar el filtro de malla con 10 ml de medio fresco y deseche el filtro. Centrifugar la suspensión a 300 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar las células.
7. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 2 ml de tampón de lisis RBC. Se incuba a RT fo 10 min. Se detiene el tampón de lisis RBC mediante la adición de 10 ml de medio completo RPMI.
8. Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender en volumen apropiado para alcanzar la densidad celular de 10 ⁸ células / ml en tampón de clasificación de células (por ejemplo, MACS) que contiene 20 mg / ml de anticuerpo Fc-bloque (2.4G2).

3. Purificación de plasmocitoide DC, DC y CD8a ^{Pos Neg} CD8a países en desarrollo de esplénica suspensión de células individuales

Nota: El aislamiento de los subconjuntos de DC esplénicos de suspensión de células individuales es un procedimiento de múltiples etapas como se ilustra en la Figura 1 Realizar todos los pasos usando tampón de pre-enfriado y un baño de agua con hielo para mantener la temperatura a 4-8 ° C.. Todos los volúmenes de reactivos en el siguiente apartado del protocolo se calculan para una entrada inicial de 200 l de suspensión de células del bazo a los 10 ⁸ células / ml). Esto se puede escalar hacia arriba o haciaabajo función de sus necesidades, cambiando el volumen de suspensión celular (siempre a una densidad de 1 x 10 ⁸ células / ml) y otros reactivos proporcionalmente en la etapa inicial (3.1.1 y 3.2.1). Ajustar los volúmenes de reactivo en todos los pasos posteriores en consecuencia. Por ejemplo, si a partir de 100 l de suspensión de células del bazo en 1 x 10 ⁸ / ml, utilizar la mitad de los volúmenes de reactivos indicadas en todos los pasos.

1. El aislamiento de los DC plasmocitoide (PDC)
   1. Añadir 300 l de cóctel de anticuerpo marcado con biotina en el kit plasmocitoide aislamiento de CC a 200 l de suspensión celular esplénica.
   2. Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos. Toque en el tubo de cada 3 minutos para mantener las células en suspensión, y para maximizar la unión de los anticuerpos.
   3. Añadir 12 ml de células de tampón de clasificación y sedimentar las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante para eliminar los anticuerpos no unidos con biotina.
   4. Resuspender la célulaprecipitado en 500 l de tampón de clasificación de células. Añadir 300 l de perlas de anticuerpo conjugado con anti-biotina. Repita el paso 3.1.2 y 3.1.3.
   5. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 2 ml de tampón de clasificación de células. Realizar todos los pasos de este punto en adelante a temperatura ambiente utilizando tampones pre-enfriado.
   6. Coloque una célula activada magnética fresca de clasificación de columna LS en el soporte magnético. Lavar y equilibrar la columna con 5 ml de tampón de clasificación de células.
   7. Pipetear la suspensión celular en la columna, aplicando suavemente para el centro de la superficie del lecho de la columna. Recoger el flujo a través.
   8. Lavar la columna con 10 ml de tampón de clasificación de células. Recoger este flujo a través y se combinan con el flujo a través del paso 3.1.7. Los PDC se enriquecen en este flujo a través de la columna (FT1).
   9. Sedimentar las células de FT1 por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, se resuspenden en 2 ml de tampón de clasificación celular y pasar las células a través de una columna LS frescorepitiendo los pasos 3.1.6 - 3.1.8. Este uso de dos columnas secuenciales produce una mayor pureza de las células aisladas.
   10. Precipitar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, y resuspender con 2 ml RPMI completo. Colocar en hielo hasta que se necesite.
2. Aislamiento de CD8a ^{Pos Neg} CD8a y los países en desarrollo
   Nota: El primer paso en este procedimiento es el agotamiento de las células B, PDC, T y NK.
   1. A partir de toda la suspensión de células de bazo (1 ml de 10 ⁸ células / ml obtenidos en la etapa 2.8), añadir 100 l de cóctel de anticuerpo conjugado con biotina proporcionado en el kit de aislamiento de CD8a ^Pos DC.
   2. Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos. Toque en el tubo suavemente cada 3 minutos para maximizar la unión de los anticuerpos marcados con biotina a sus células diana.
   3. Añadir 12 ml de células de tampón de clasificación y sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar súpersobrenadante para eliminar los anticuerpos no unidos con biotina.
   4. Añadir 150 l de tampón de clasificación celular y 100 l de perlas de anti-biotina proporcionados en el kit de aislamiento de CD8a ^Pos DC. Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos.
   5. Añadir 10 ml de células de tampón de clasificación y sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
   6. Resuspender las células en tampón de clasificación 1 ml de células y pasar por encima de una columna LS fresca acuerdo con el procedimiento en los pasos 3.1.6 a través de 3.1.8.
   7. Recoger el flujo sin etiqueta a 2 (FT2) y desechar el material retenido columna. Esta fracción se enriquece sin etiqueta para CD8a ^{Pos Neg} CD8a y los países en desarrollo.
   8. Sedimentar las células en FT2 por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
   9. Resuspender las células en tampón de clasificación celular 1 ml y añadir 200 l de perlas magnéticas conjugadas-CD8a contra proporcionados en el kit de aislamiento de CD8a ^Pos DC.
   10. Repscomer pasos 3.2.2 a través de 3.2.6. El flujo a través de la columna se enriquece para CD8a ^Neg DC y agota para CD8a ^Pos países en desarrollo. Esto se denomina flujo a través de 3 (T3L).
   11. Para eluir el CD8a ^Pos DCs retenido en la columna, eliminar la columna del imán, añadir 5 ml de tampón de clasificación celular y purgar la matriz de la columna usando el émbolo suministrado con la columna de LS.
   12. Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender en tampón de clasificación de 1 ml de células. Para aumentar la pureza, ejecute las células eluidas de nuevo a través de una columna LS fresco repitiendo los pasos 3.1.6 a 3.1.8, excepto desechar el flujo a través y recoger células retenidas como en 3.2.11.
   13. Para purificar el CD8a ^Neg DCs de la suspensión PIE3S, sedimentar los PIE3S por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y resuspender en 300 l de tampón de clasificación de células.
   14. Añadir 100 l de mag anti-CD11cperlas néticas. Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos.
   15. Añadir ordenar celdas tampón y de pellets de 10 ml de células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
   16. Repita los pasos 3.1.5 a través de 3.1.8. El CD8a ^Neg DCs se seleccionan positivamente con perlas de CD11c y se unió a la columna. El flujo a través se puede descartar.
   17. La elución de las células retenidas en la columna como se describe en el paso 3.2.11 para recoger el purificada CD8a ^Neg DC.

4. pulsante APC con antígenos y de transferencia de células

1. Contar las células vivas después de la purificación mediante exclusión con azul de tripano ²¹ para distinguir las células vivas y muertas.
2. Se incuban las células con el antígeno de elección. Utilizar análogos de antígeno glicolípido ceramida llamada alfa-galactosil (αGalCer) a una concentración de 100 nM ^13. Típicamente, la placa 10 ⁶ células viables / pocillo en medio RPMI completo el uso de ultra bajo attachment de fondo en U de 96 pocillos para minimizar la unión celular. Se incuban las células en una atmósfera de CO2 al _5% a 37 ° C por 1 - 4 horas.
3. Las células de la cosecha con la pipeta suavemente varias veces. Utilice puntas de pipeta diámetro ancho para minimizar el daño celular de las fuerzas de corte. Lavar los pocillos con PBS y agrupar estos lavados para maximizar la obtención de células.
4. Sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y resuspender a la densidad deseada en PBS. Por lo general, se inyecta 1 millón de células en 200 l por animal receptor. Mantener las células en hielo para maximizar la viabilidad antes de la administración en animales huésped.
5. Inyectar células vía intravenosa en ratones, ya sea a través del vano lateral de la cola o del plexo venoso retroorbital ^19. Use una aguja 27 G en una jeringa de 1 ml, y se inyecta un volumen máximo de 0,1 ml por ratón.

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Resultados

El resultado de este procedimiento se basa en la expansión de los subgrupos de CD por murino Flt-3L expresado por las células de melanoma implantados. El tumor B16.Flt3L se derivó de un 6 mouse / C57BL, y debe ser implantado en animales con que cepa de antecedentes con el fin de evitar el fallo del tumor a establecerse debido al rechazo. En algunos casos, puede ser deseable usar ratones modificados genéticamente para derivar DCs con defectos conocidos en vías o receptores de interé...

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Discusión

se aceptan las células dendríticas que es el principal antígeno profesional que presenta células que participan en el cebado de respuestas de células T. Su función principal es la de inspeccionar el microambiente del tejido mediante la adopción y el procesamiento de antígenos para la presentación a las células T. Con el fin de estudiar la función de subconjuntos específicos de DC, estos necesitan ser aislados en cantidades suficientes utilizando un enfoque que mantiene su fenotipo y las funciones normales. L...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (dry powder)	QIAGEN	79254
200 proof ethanol	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030081
MEM non-essential amino acids	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM essential amino acids	Life Technologies	11130-051
β-mercaptoethanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution	Life Technologies	15575-020
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11050
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Trypan blue (dry powder)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotech	130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit	Miltenyi Biotech	130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-mouse CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anti-mouse CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Anti-mouse B220-PE	BD Biosciences	553090
1 ml syringes	BD	26048
23 G1 needle	BD	305145
100 mm Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	875712
Surgical instruments	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm)	BD	352350
Large Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm))	Corning	431097
LS columns	Miltenyi	130-042-401
Magnetic stand MACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips	PerkinElmer	111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates	Corning	CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice	Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line			described by Mach et al., 2000
Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)			Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media			Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer			Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).
FACS staining buffer			Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml.			This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use.