La evaluación de resultado primaria en un modelo porcino de infarto agudo de miocardio

Resumen

la evaluación del resultado fiable y precisa es la clave para la traducción de las terapias preclínicos en el tratamiento clínico. El presente documento describe la forma de evaluar tres parámetros de resultado primaria clínicamente relevantes de la función cardiaca y daños en un modelo porcino de infarto de miocardio agudo.

Resumen

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are therefore required to confine cardiac damage, promote survival and reduce the disease burden of heart failure. Large animal experiments are an essential part in the translational process from experimental to clinical therapies. To optimize clinical translation, robust and representative outcome measures are mandatory. The present manuscript aims to address this need by describing the assessment of three clinically relevant outcome modalities in a pig acute myocardial infarction (AMI) model: infarct size in relation to area at risk (IS/AAR) staining, 3-dimensional transesophageal echocardiography (TEE) and admittance-based pressure-volume (PV) loops. Infarct size is the main determinant driving the transition from AMI to heart failure and can be quantified by IS/AAR staining. Echocardiography is a reliable and robust tool in the assessment of global and regional cardiac function in clinical cardiology. Here, a method for three-dimensional transesophageal echocardiography (3D-TEE) in pigs is provided. Extensive insight into cardiac performance can be obtained by admittance-based pressure-volume (PV) loops, including intrinsic parameters of myocardial function that are pre- and afterload independent. Combined with a clinically feasible experimental study protocol, these outcome measures provide researchers with essential information to determine whether novel therapeutic strategies could yield promising targets for future testing in clinical studies.

Introducción

La insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida (ICFER) representa aproximadamente el 50% de todos los casos de insuficiencia cardiaca, que afecta a un estimado de 1 - 2% de las personas en el mundo occidental ^1. Su causa más frecuente es el infarto agudo de miocardio (IAM). Como la mortalidad aguda del IAM ha disminuido considerablemente debido a una mayor conciencia y mejores opciones de tratamiento, el énfasis se ha desplazado hacia sus secuelas crónicas; el ser más prominente ICFER ^2,3. Junto con el aumento de los costos del cuidado de la salud ^4, la creciente epidemia de insuficiencia cardíaca hace hincapié en la necesidad de nuevos diagnósticos y terapias, que puede ser estudiado en un modelo porcino altamente traslación del remodelado adverso tras el IAM como se describió previamente ^5.

Ambos, determinantes (por ejemplo, el tamaño del infarto) y funcionales evaluaciones (por ejemplo, ecocardiografía) de remodelado adverso a menudo se utilizan para las pruebas de eficacia de nuevas terapias, lo que indica la necesidad de relmétodos iable y relativamente barato. El objetivo del presente trabajo es abordar esta necesidad mediante la introducción de importantes y fiables medidas de resultado de los ensayos de eficacia en un modelo porcino de infarto agudo de miocardio. Estos incluyen el tamaño del infarto (IS) en relación con el área en riesgo (AAR), la ecocardiografía transesofágica 3D (3D-ETE) y la adquisición de bucle detallada basada en la admisión de presión-volumen (PV).

El tamaño del infarto es el principal determinante del remodelado adverso y la supervivencia después de un IAM ^6. A pesar de la reperfusión de miocardio isquémico oportuna puede salvar cardiomiocitos de forma reversible heridos y limitar el tamaño del infarto, la reperfusión en sí causa un daño adicional a través de la generación de estrés oxidativo y una respuesta inflamatoria desproporcionada (lesión por isquemia-reperfusión (IRI)) ^7. Por lo tanto, IRI ha sido identificado como un objetivo terapéutico prometedor. La capacidad de nuevas terapias para disminuir el tamaño del infarto se cuantifica mediante la evaluación del tamaño del infarto en relacióna la zona de riesgo (AAR). AAR cuantificación es obligatoria para corregir la variabilidad entre individuos en la anatomía coronaria de modelos animales, como AAR más grande conduce a un tamaño del infarto absoluta más grande. Desde el tamaño del infarto está directamente relacionada con el rendimiento cardíaco y la contractilidad del miocardio, las variaciones en AAR pueden influir estudiar medidas de resultado independientemente de las modalidades de tratamiento ^8.

Tridimensional ecocardiografía transesofágica (ETE-3D) es un método barato seguro, fiable y, lo más importante, aplicable clínicamente para medir la función cardiaca no invasiva. Mientras que la ecocardiografía transtorácica (ETT), las imágenes se limitan a las vistas 2D largo paraesternal y de eje corto en cerdos ^9, 3D-ETE puede ser utilizado para obtener imágenes en 3 dimensiones completas del ventrículo izquierdo. Por lo tanto, no requiere de aproximaciones matemáticas del ventrículo izquierdo (VI) volúmenes, tales como ^la regla ¹⁰ de Simpson modificado. Este último está a la altura de la corrrectamente la estimación de los volúmenes del VI después de remodelado del VI debido a la falta de geometría cilíndrica ^11. Por otra parte, 3D-TEE es preferible sobre la ecocardiografía epicárdica, ya que no requiere intervenciones quirúrgicas, que se han observado para ejercer efectos cardioprotectores en el presente modelo ^12. Aunque el uso de 2D-TEE para la evaluación de la función miocárdica se ha descrito antes ^13,14, limitaciones en cuanto a la geometría ventricular son similares a los observados en 2D-TTE y dependen de la extensión de LV remodelación. Por lo tanto, cuanto mayor sea el infarto (y por lo tanto mayor es la probabilidad de la insuficiencia cardíaca), las mediciones 2D más probablemente se convierta en defectuoso por suposiciones incorrectas geométricas y mayor la necesidad de técnicas de 3D.

No obstante, la mayoría de modalidades de imágenes están limitados en su capacidad para evaluar las propiedades funcionales intrínsecas del miocardio. PV bucles de proporcionar dicha información adicional pertinente y, por tanto, su adquisición esse describe en detalle a continuación.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad del Centro Médico de Utrecht (Utrecht, Holanda) y se ajustan a la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio".

NOTA: El protocolo para realizar una oclusión con balón a tórax cerrado no es parte del manuscrito actual y se describe en detalle en otra parte ^5. En resumen, los cerdos (60 - 70 kg) se sometieron a 75 min de oclusión con balón transluminal de la porción media de la arteria descendente anterior izquierda (LAD).

Ambos, en tres dimensiones ecocardiografía transesofágica (ETE-3D) y mediciones de bucle presión-volumen (PV) se puede realizar al inicio del estudio, a corto plazo ya largo plazo de seguimiento. Tenga en cuenta que estas medidas no se consideran fiables en las primeras horas tras el infarto de miocardio debido a arritmias frecuentes en esta fase. El tamaño del infarto (IS) y el área en riesgo (AAR) medidas son preferably evaluó a corto plazo de seguimiento (24 - 72 h) ^15,16, ya que los cambios en la microvasculatura y secundaria adelgazamiento de la cicatriz miocárdica culminan en resultados menos fiables. tinción El tamaño del infarto se lleva a cabo utilizando cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) (PRECAUCIÓN, irritante), que se considera altamente reproducible y relativamente barato. TTC es un polvo blanco que se disuelve en solución salina colorlessly. Al entrar en contacto con diversas deshidrogenasas, que se convierte en un color rojo ladrillo. De esta manera, se discrimina entre viable (rojo) y el tejido miocárdico muertos (blanco). Para una visión general tanto en la determinación invasiva y no invasiva el tamaño del infarto, los lectores se dirigen a una revisión exhaustiva sobre este tema ^17.

La Figura 1 muestra la línea de tiempo incluyendo la anestesia, la preparación quirúrgica y las medidas de resultados primarios utilizados en este estudio.

1. Los medicamentos y anestesia

1. Asegúrese de que el animal no come nibeber durante al menos 5 horas antes del procedimiento. Pre-tratamiento, la anestesia y los protocolos de tratamiento del dolor post-operatorio se han descrito en detalle en otra parte ^5.
2. En resumen, el día antes de la cirugía un parche buprenorfina (5 g / h) se aplica a la piel que está activo durante siete días para limitar el dolor post-operatorio. En el día de la cirugía, los cerdos sedar por inyección intramuscular de 0,4 mg / kg de midazolam, 10 mg / kg de ketamina y 0,014 mg / kg de atropina. Espere a que aproximadamente el 10 - 15 min. Insertar un G cánula 18 en una de las venas de la oreja y administrar 5 mg tiopental sódico / kg para inducir anestesia.
3. Intubate el cerdo usando un tubo endotraqueal (tamaño 8,5 de los cerdos de 60 - 70 kg). Si es necesario, realizar globo de ventilación (frecuencia de 12 / min) y transportar el cerdo para la sala de operaciones.
4. A su llegada a la sala de operaciones, iniciar la ventilación mecánica con presión positiva con _FiO2 0,50, 10 ml / kg de volumen corriente y una frecuencia de 12 / min utilizando continuagrabación de capnografía.
5. Iniciar la anestesia equilibrada por infusión intravenosa continua de una combinación de midazolam (0,5 mg / kg / hr), sufentanil (2,5 g / kg / hr) y pancuronio (0,1 mg / kg / hr).
6. Confirmar la anestesia probando el reflejo corneal y el seguimiento del patrón de respiración (por ejemplo, la respiración espontánea en combinación con ventilación mecánica indica la anestesia incompleta). Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras el animal está bajo anestesia.

2. 3D ecocardiografía transesofágica (ETE)

1. Para permitir la monitorización de la frecuencia cardíaca y la adquisición de datos, conecte el animal al 5 derivaciones de ECG en la máquina de ecocardiografía.
2. Colocar el animal en decúbito lateral derecho. Asegúrese de que la sonda es recta y flexible en la punta por el desbloqueo de la pieza de trabajo.
3. Abra la boca del cerdo e inserte cuidadosamente la sonda de eco en el esófago. Si es necesario, utilizar un laringoscopio para visualización. Tenga cuidado para evitar terminar en la bolsa faríngea anatómica normal, se asemeja a un divertículo de Zenker ^18.
4. Inserte la sonda durante 50 - 60 cm (medida desde la punta del hocico). Gire lentamente la sonda y flexionar la cabeza a una posición anterolateral izquierda para visualizar el corazón (Figura 2 A - B). Asegúrese de que todas las paredes son claramente visibles.
5. Utilice la opción "todo volumen 3D" en la pantalla de la máquina de ecocardiografía para mostrar dos imágenes perpendiculares del ventrículo izquierdo, como se muestra en la Figura 2C -. Entonces D maximizar el ancho de sector que está siendo adquirida por seleccionar "FV Opt volumen". Pausa ventilación cambiando temporalmente la ventilación mecánica y pulse "Adquirir" para obtener mediciones de volumen completo.
6. Después de la adquisición de eco, asegúrese de que la punta es flexible, liberando la pieza de trabajo. A continuación, retire la sonda lentamente a partir del animal.
   NOTA: No deje THe animales sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
7. Realizar el análisis fuera de línea con el software validado como se ha descrito previamente ^19.

3. basada en la admisión de presión-volumen del circuito de adquisición

1. Pre-remojar las puntas de detección del catéter admisión 7 F tetra-polar en 0,9% de solución salina (la temperatura ambiente a 37 ° C) durante un mínimo de 20 minutos para asegurar la correcta hidratación y mínima deriva presión de línea de base durante el experimento ^20.
2. Administrar medicamentos y anestesia como se describe en la sección 1.
3. Realizar la preparación quirúrgica y obtener acceso vascular como se describió previamente ^5.
   1. En resumen, afeitarse y limpiar el cuello. Desinfectar el área quirúrgica con yodo al 2% y cubrir las partes no estériles de los cerdos con paños quirúrgicos estériles.
   2. Haceruna incisión medial en el cuello para exponer la arteria carótida y la vena yugular interna. Insertar un 8 F vaina en la arteria carótida y una vaina F 9 en la vena yugular.
4. Insertar un catéter de Swan-Ganz (SG) a través de la funda 9 F en la vena yugular y la cuña en una pequeña arteria pulmonar inflando el globo en la punta del catéter. Después de la colocación adecuada en la parte periférica del pulmón, desinflar el balón. Conecte la SG a un dispositivo de salida cardíaco externo.
5. Adjuntar una jeringa de 20 ml que contiene 0,9% de solución salina estéril al puerto de inyección que se conecta al lumen con el desemboco más proximal. Medir el gasto cardíaco mediante la infusión rápida de 5 ml de solución salina al 0,9% (temperatura ambiente) y obtener la frecuencia cardíaca para calcular el volumen sistólico (SV). Repita este procedimiento tres veces y calcular el promedio de SV.
   NOTA: El gasto cardíaco es (automáticamente) calculado utilizando la ecuación de termodilución Stewart-Hamilton y se basa en los cambios de temperatura en elarteria pulmonar tras la infusión de solución salina sala de temperatura ^21.
6. Retire el catéter de SG. Insertar un catéter de Fogarty 8 M a través de la vaina de 9 F en la vena yugular y la posición en la vena cava inferior.
7. Calibrar la señal de presión del catéter bucle PV usando el botón "Fine" "Curso" y, mientras que la punta se mantiene en el 0,9% de solución salina. A continuación, introduzca el SV medido en el sistema.
8. Avanzar el catéter a través del bucle PV 8 F vaina en la arteria carótida y el centro de la punta en el ventrículo izquierdo (VI) mediante fluoroscopia.
9. Seleccione la más grande del segmento colocado adecuadamente por el trazado de la señal de conductancia de la prima con arreglo a la señal de presión. Asegúrese de que los bucles de presión-conductancia son de forma rectangular. Se espera que la fase de la señal para mostrar una traza sinusal con valores comprendidos entre 3 y 5 grados. Pausa ventilación y realizar una línea de base para convertir la exploración de la conductancia de volumen.
   1. Aceptar los datos de referencia depresionando en "Continuar" cuando las señales son estables (arritmias), la frecuencia cardíaca es igual a la frecuencia cardíaca ECG o derivada de presión y de fin de sístole (ES) / conductancia de fin de diástole (ED) son detectadas adecuadamente por el sistema ^20.
      NOTA: Este último puede ser verificada por el trazado de la señal de conductancia en bruto contra la señal de presión y la comparación de valores de conductancia ES / ED derivados de la línea de base escanear a la conductancia en tiempo real. Si alguno de los requisitos anteriores no se cumple, repita el procedimiento.
10. Adquirir bucles de presión-volumen de referencia mediante el registro de 10 - 12 latidos consecutivos durante la apnea haciendo una pausa en la ventilación.
11. Inflar el catéter Fogarty bajo guía fluoroscópica para reducir la precarga y grabar 10 - 12 latidos consecutivos como se describe anteriormente. Hacer presión arterial sistólica se mantiene seguro> 60 mmHg y no hay arritmias interfiere con las mediciones.
12. Retire los catéteres de bucle Fogarty y fotovoltaicos. Mantenga la grabación pressur arterialE antes y durante la extracción del catéter de bucle de PV para permitir la corrección de la deriva de la presión (es decir, ex vivo antes y después del procedimiento de línea de base diferencia de presión).
    NOTA: No deje desatendido el animal hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
13. Realizar análisis fuera de línea de las mediciones geométricas y los parámetros funcionales con software validado ^22.

4. zona de riesgo (AAR) y el tamaño del infarto (ES) Cuantificación

1. Disolver 1,00 g de azul de Evans (PRECAUCIÓN ^23, tóxico) en 50 ml 0,9% de solución salina, llenar dos 50 ml jeringas Luer con 20 ml y 30 ml de 2% solución de azul de Evans, respectivamente, y mantener a temperatura ambiente.
   NOTA: El trabajo en una campana de humos y utilice una máscara para limitar la exposición a polvos peligrosos y utilizar guantes y gafas protectoras para evitar el contacto from la piel y los ojos.
2. Tomando las precauciones similares, disolver 1% 2,3,5-trifenil-tetrazoliumchloride (TTC) (PRECAUCIÓN, irritante) en 37 ° C 0,9% de solución salina y mantener a 37 ° C.
3. Quirúrgicamente preparar el animal para obtener acceso vascular a ambas arterias carótidas. Realizar una esternotomía para permitir la visualización directa del efecto de la infusión in vivo Evans azul ^5.
4. Insertar un 7 F y un 8 F funda de introducción en la arteria carótida respectivo. Alternativamente, inserte las dos fundas de introducción en una sola arteria carótida o utilizar una de las arterias femorales para uno de los dos catéteres guía.
5. Conectar dos conectores-Y estándar hasta un 7 F JL4 y un 8 F JL4 catéter guía, respectivamente. Para un acceso femoral, use un JR4 de la arteria coronaria derecha (RCA) y una JL4 de la arteria coronaria izquierda (TCCI). Conectar una llave de tres vías adicional con 10 cm de extensión a ambos conectores-Y.
6. Administrar 100 UI de heparina kg /. Coloque el ca guía 8 F JL4theter en el orificio de la TCI a través de una de las dos fundas de introducción.
7. El uso de un "hilo guía 0,014, avanzar un catéter de dilatación coronaria a través del catéter TCCI y la posición del balón en el lugar donde se realizó la oclusión coronaria durante la inducción MI. No infle aún.
8. Coloque el segundo catéter guía 8 F JL4 en el ostium de la RCA a través de la segunda funda introductora.
9. Realice una angiografía coronaria (CAG) mediante la infusión de agente de contraste bajo fluoroscopia para confirmar la colocación correcta de los dos catéteres de guía y el globo de las arterias coronarias, utilizando anteroposterior y LAO 30 ° vistas.
10. Una los dos 50 ml jeringas que contienen 30 ml (CIMA) y 20 ml (RCA) 2% de azul de Evans a los respectivos grifos de tres vías unidos a los conectores-Y en los catéteres guía.
11. Inflar el globo y confirmar la oclusión de la arteria coronaria por CAG. Sólo cuando el globo bloquea completamente el paso de cualquier agente de contraste, inyectar Evans d azulye a través de ambos catéteres de guía (5 ml / s) mientras que el globo se infla.
12. Directamente después de la finalización de la infusión de azul de Evans, inducir fibrilación ventricular mediante la colocación de una batería de 9 V en la parte no infartada del corazón.
13. Incisión en la vena cava para liberar la presión y asegurarse de que una unidad de succión está disponible para permitir el drenaje de la sangre.
14. Desinflar el globo, retraiga junto con dos catéteres guía y explante del corazón mediante la disección de las membranas que rodean. Un corte transversal a través de los grandes vasos (es decir, la aorta, la arteria pulmonar / venas) permite la explantación completa. Rápidamente lavar la sangre y el colorante superfluo en la superficie exterior y en las cavidades cardiacas utilizando 0,9% de solución salina.
15. diseccionar cuidadosamente el ventrículo izquierdo y hacer recortes en 5 de 10 mm de espesor secciones iguales desde el vértice a la base, en un plano paralelo a la ranura auriculoventricular (AV).
16. Fotografía de ambos lados de las cinco rodajas por separado bajo condiciones de luz ambiental,como un posible lavado de azul de Evans se puede producir en la etapa subsiguiente. Para la calibración, asegúrese de que una regla está presente en la imagen.
17. Incubar durante 10 minutos en solución TTC 1% a 37 ° C, convirtiendo las secciones en torno a los 5 min para la igualdad de tinción.
18. Una vez más, fotografiar a ambos lados de los cinco rebanadas por separado bajo condiciones de luz ambiental y asegurarse de que un gobernante se visualiza en la imagen para la calibración.
19. Pesar todos los cortes. El uso de software adecuado para los análisis ^5. Al utilizar ImageJ (versión 1.47), haga clic en el botón "Recta". Ahora, dibuja una línea recta con una distancia conocida mediante la regla de la imagen (por ejemplo, 5 cm). Haga clic en "Analizar" -> "Ajuste de escala" y entrar en la distancia en el cuadro "distancia conocida". Este procedimiento permite la calibración de la distancia en píxeles a unidades del SI de longitud.
20. Con el botón "Polígono selecciones", seleccionar el área total que corresponde al miocardio del VI en la presente imedad, haga clic en "Analizar" -> "medida" para adquirir mediciones. Realice este procedimiento para ambos lados de cada rebanada de miocardio, y el promedio por rebanada.
    1. Multiplica por el peso de la rebanada proporcional al peso total de los cinco rodajas y un promedio de estas mediciones para todos los sectores.
21. Realizar medidas similares para el área en riesgo (AAR) y el tamaño del infarto (IS). Divide ES / AAR, AAR / LV y SI / LV y se multiplica por 100% para obtener mediciones de los resultados respectivos ^5.

Resultados

3D ecocardiografía transesofágica

3D ecocardiografía transesofágica (ETE-3D) se puede utilizar para la evaluación de la función cardíaca global. Después de un IAM, la función cardíaca global difiere de los valores basales sanos. En particular, la fracción de eyección ventricular izquierda (FEVI) disminuye de 59 ± 4% a 37 ± 6% después de una semana de reperfusión (n = 10) (GPJ van Hout, 20...

Discusión

La remodelación cardiaca depende en gran medida de tamaño del infarto de miocardio y la calidad de infarto de miocardio reparar ^6,26. Para evaluar la ex de una manera estandarizada, el presente manuscrito proporciona un método elegante de la infusión in vivo de azul de Evans en combinación con tinción TTC ex vivo, que ha sido validado y ampliamente utilizado ^8,16,27,28. Este método permite la cuantificación de la zona de riesgo (AAR) y el tamaño del infarto en relación c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-dimensional Transesophageal Echocardiography
iE33 ultrasound device	Philips	-
X7-2t transducer	Philips	-
Aquasonic® 100 ultrasound transmission gel	Parker Laboratories Inc.	01-34	Alternative product can be used
Battery handle type C (laryngoscope handle)	Riester	12303
Ri-Standard Miller blade MIL 4 (laryngoscope blade)	Riester	12225
Qlab 10.0 (3DQ Advanced) analysis software	Philips	-
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pressure-volume loop acquisition
Cardiac defibrillator	Philips
0.9% Saline	Braun
8 F Percutaneous Sheath Introducer Set	Arrow	CP-08803	Alternative product can be used
9 F Radifocus® Introducer II Standard Kit	Terumo	RS*A90K10SQ	Alternative product can be used
8 F Fogarty catheter	Edward Life Sciences	62080814F	Alternative product can be used
7 F Criticath™ SP5107H TD catheter (Swan-Ganz)	Becton Dickinson (BD)	680078	Alternative product can be used
Ultraview SL Patient Monitor and Invasive Command Module (external cardiac output device)	Spacelabs Healthcare	91387	Alternative product can be used
ADVantage system™	Transonic SciSense	-
7 F Tetra-polar admittance catheter (7.0 VSL Pigtail / no lumen)	Transonic SciSense	-
Multi-channel acquisition system (Iworx 404)	Iworx	-
Labscribe V2.0 analysis software	Iworx	-	Alternative product can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Infarct size / area-at-risk quantification
Diathermy	-		Alternative product can be used
Lebsch knife	-		Alternative product can be used
Hammer	-		Alternative product can be used
Bone marrow wax	Syneture		Alternative product can be used
Klinkenberg scissors	-		Alternative product can be used
Retractor	-		Alternative product can be used
Surgical scissors	-
7 F Percutaneous Sheath Introducer Set	Arrow	CP-08703	Alternative product can be used
8 F Percutaneous Sheath Introducer Set	Arrow	CP-08803	Alternative product can be used
7 F JL4 guiding catheter	Boston Scientific	H749 34357-662	Alternative product can be used
8 F JL4 guiding catheter	Boston Scientific	H749 34358-662	Alternative product can be used
COPILOT Bleedback Control Valves	Abbott Vascular	1003331	Alternative product can be used
BD Connecta™	Franklin Lakes	394995	Alternative product can be used
Contrast agent	Telebrix
Persuader 9 Steerable Guidewire 9 (0.014", 180 cm, straight tip), hydrophilic coating	Medtronic Inc.	9PSDR180HS	Alternative product can be used
SAPPHIRE™ Coronary Dilatation Catheter (PTCA balloon suitable for the size of the particular coronary artery (2.75 - 3.25 mm))	OrbusNeich	103-3015	Alternative product can be used
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129-100G	Toxic. Alternative product can be used
2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	T8877-100G	Irritant. Alternative product can be used
9 V Battery	-	-
Ruler	-	-
Photocamera	Sony	-
ImageJ	National Institutes of Health	-	Alternative product can be used