Prolongado lapso de tiempo intravital de imágenes de tiempo real multicelular Dinámica en el microambiente tumoral

Resumen

Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar extendida time-lapse de las interacciones multicelulares en tiempo real, en vivo a una resolución de una sola célula.

Resumen

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

Introducción

La difusión de células tumorales de tumor de mama primario se ha demostrado que la participación células tumorales no sólo, pero el anfitrión de las células del estroma incluyendo los macrófagos y células endoteliales. Además, la vasculatura del tumor es anormal con aumento de la permeabilidad ^1. Por lo tanto, la determinación de cómo las células tumorales, los macrófagos y las células endoteliales interactúan para mediar en la permeabilidad vascular y intravasación de células tumorales en el microambiente del tumor primario es importante para entender la metástasis. La comprensión de la cinética de la permeabilidad vascular, la intravasación de células tumorales y el mecanismo de señalización subyacente de las interacciones multicelulares en el microambiente tumoral puede proporcionar información crucial en el desarrollo y administración de terapias contra el cáncer.

El principal medio de estudio de la permeabilidad vascular de tumores in vivo ha sido la medición de tintes extravasculares como el azul ^2, dextranos Evans alto peso molecular (155 kDa)³ y fluoróforo o proteínas de radiotrazadores conjugado (incluyendo albúmina) ⁴ en puntos fijos de tiempo después de la inyección del colorante. Los avances en microscopía, modelos animales y tintes fluorescentes han permitido la visualización de procesos celulares y la permeabilidad vascular en animales vivos a través de microscopía intravital ^5.

Imágenes de animales vivos con la adquisición de imágenes estáticas o secuencias corto lapso de tiempo sobre varios puntos de tiempo no permite la comprensión completa de eventos dinámicos en el microambiente tumoral ^6,7. De hecho, la adquisición de imagen estática durante el transcurso de 24 horas demostró que la vasculatura del tumor es permeable, sin embargo la dinámica de la permeabilidad vascular no se observó ^6. Por lo tanto, extendida continua de imágenes de lapso de tiempo de hasta 12 horas capta la cinética de eventos dinámicos en el microambiente tumoral.

Este protocolo describe el uso de multiphot prolongado lapso de tiempoen la microscopía intravital para estudiar eventos multicelulares dinámicos en el microambiente tumoral. Múltiples tipos de células en el microambiente del tumor se marcan con tintes inyectables o mediante el uso de animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes. El uso de un catéter de vena de la cola colorantes vasculares o proteínas pueden ser inyectados después del inicio de formación de imágenes para adquirir datos cinética de eventos multicelulares en el microambiente tumoral. Para imágenes de células vivas del tumor mamario está expuesto a través de la preparación quirúrgica de un colgajo de piel. Las imágenes se adquieren por hasta 12 horas utilizando un microscopio multifotónica equipado con múltiples tubos fotomultiplicadores (PMT) detectores ^8. Mediante el uso de filtros adecuados, un algoritmo de sustracción permite 4 detectores PMT para adquirir 5 señales fluorescentes en el microambiente tumoral simultáneamente ^9. microscopía de alta resolución multifotónica intravital captura resolución de celda de imagen única de las interacciones tumor-estroma en el microambiente del tumor, lo que lleva a una mejor uOMPRENDER de la permeabilidad vascular y intravasación de células tumorales ^10-13. Específicamente, reveladas muy localizadas, eventos de permeabilidad prolongados de formación de imágenes intravital transitorios vasculares que se producen de forma selectiva en los sitios de interacción entre una célula tumoral, un macrófago y una célula endotelial (definido como el microambiente tumoral de metástasis, TMEM ^{14) 13.} Además, la intravasación de células tumorales se produce sólo en TMEM y se espacial y temporalmente correlacionado con la permeabilidad vascular ^13. fue posible la resolución de una sola célula de la dinámica de estos eventos a través del uso de prolongado lapso de tiempo múltiple de fotones microscopía de las células marcadas con fluorescencia en el microambiente tumoral.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos deben realizarse de conformidad con las directrices y regulaciones para el uso de animales vertebrados, incluyendo la aprobación previa del Albert Einstein College of Medicine Institucional Cuidado de Animales y el empleo.

1. Generación de fluorescencia tumores etiquetados y macrófagos asociados a tumores

1. Generar células tumorales marcadas con fluorescencia cruzando el modelo espontáneo, autóctona, ratón diseñado genéticamente mamaria del cáncer, donde la mama de ratón del virus del tumor repetición terminal larga conduce el antígeno de poliomavirus media T (MMTV-PYMT) con ratones transgénicos con los reporteros fluorescentes [es decir, el aumento de verde fluorescente proteína La proteína (EGFP), el aumento de cian fluorescente (ECFP) o Dendra2] ^8,9.
2. Macrófagos de la etiqueta fluorescente en animales PYMT con fluorescencia etiquetados células tumorales mediante el cruce de modelos de ratones genéticamente manipulados con los reporteros fluorescentes específicas myeloid- y de macrófagos [es decir, MacGreen ¹⁵ o ratones MacBlue Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP ^16].
3. Alternativamente, la etiqueta fluorescente generan tumores a través del trasplante ortotópico de células tumorales marcadas con fluorescencia PYMT (singénicos), líneas celulares de cáncer de mama humano o tumores primarios paciente humano derivados (xenoinjertos) ^11,17.
   1. Implante marcado con fluorescencia células tumorales en ratones singénicos PYMT con células mieloides proteínas marcadas con fluorescencia para generar animales con células tumorales marcadas con fluorescencia y células mieloides ^13.
4. Inyectar 100 l de 10 mg / kg fluorescente 70 kDa de dextrano por vía intravenosa (iv) vena de la cola en ratones inmunodeficiencia combinada grave (SCID) con tumores de xenoinjertos de líneas celulares humanas o tumores primarios derivados del paciente a los macrófagos de la etiqueta fluorescente 2 hr antes del comienzo de formación de imágenes intravital.

2. Configuración del microscopio e Imagen Preparación

Nota: Este procedimiento describe la puesta a puntopara intravital de imágenes en un microscopio multifotónica ^8.

1. Encienda todos los componentes del microscopio y láser, incluyendo láseres de dos fotones y los detectores.
2. Encienda la caja de calentamiento a 30 ° C para pre-calentar el escenario. Este paso es fundamental para mantener la temperatura fisiológica del animal.
3. Para su uso en un lugar microscopio invertido el inserto etapa personalizada en la platina del microscopio. La pieza de enganche personalizada es una hoja de 1/8 "de espesor de aluminio mecanizada para caber en el espacio escénico de inserción y con un diámetro de 1" agujero pasante en el centro de formación de imágenes.
   1. Limpiar la platina del microscopio y el inserto etapa con 70% de etanol y secar al aire.
   2. Colocar una gran gota de agua sobre la 20X, 1,05 NA objetivo de microscopio óptico para mantener el contacto con la cubierta de vidrio.
   3. Coloque la tapa de vidrio (# 1.5 espesor) a través del puerto de imágenes en el inserto de platina del microscopio. Asegure en su lugar con cinta de laboratorio.
   4. Utilice una perforadora para perforar un agujero de 2 cm x 2 cmen una almohadilla de caucho flexible y colocar la almohadilla de goma en la platina del microscopio con el orificio en la almohadilla alineado con el orificio en el inserto etapa personalizado.

3. Preparación de la vena de la cola del catéter y reactivos para la inyección durante Imaging

1. Cortar una longitud de 30 cm de tubo de polietileno (PE).
2. Con unas pinzas, mover la aguja de metal de una aguja 31 G de ida y vuelta hasta que se desprende de la conexión de plástico.
3. Con unas pinzas, inserte el extremo romo de la aguja individual en el tubo de PE.
4. Inserte una aguja 31 G en el otro extremo del tubo de PE.
5. Llene una jeringa de 1 cc de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y la inserta en la aguja 31 G y vaciar todo el aire de la tubería y la aguja con PBS. PBS se utiliza para mantener la hidratación y la osmolaridad de la sangre ^9,18, solución salina isotónica sin embargo también se puede utilizar.
6. Llene una jeringa de 1 cc con 200 l de 3 mg / kg 155 kDa dextrano-tetrametilrodamina (TMR) O puntos cuánticos para el etiquetado vascular.
7. Preparar las otras proteínas inyectables tales como una isoforma de 165 aminoácidos del factor de crecimiento vascular endotelial A (VEGFA ₁₆₅₎ en una jeringa de 1 cc y el lugar en el hielo. Inyectar 0,2 mg / kg VEGFA ₁₆₅ ¹⁹ a una concentración de 0,05 mg / ml.

4. La inserción de la cola de mora en el interior de la vena con catéter

1. Colocar el animal bajo anestesia utilizando una cámara de inducción con 5% de isoflurano con O ₂ como gas portador.
2. Transferir el ratón a la plataforma quirúrgica, una vez que esté completamente anestesiado y no responde a una pizca dedo del pie.
3. Abrir línea de anestesia con isoflurano a la plataforma quirúrgica, cerca de la línea de la anestesia a la cámara de inducción y colocar el cono de la nariz sobre el hocico del animal. Reducir el isoflurano del 5% al ​​2,5%.
4. Aplicar la pomada oftálmica de los ojos del ratón para evitar la sequedad durante la anestesia.
5. Calentar el animal bajo la lámpara de calordurante 2 min para aumentar la circulación en la cola ya que la circulación se ralentiza con anestesia profunda.
6. Esterilizar la vena de la cola del ratón con un 70% de etanol.
7. Inserte la punta de la aguja de 31 G del catéter construido en la Sección 3 en la vena lateral de la cola del animal y empuje la aguja en 2-3 mm.
8. Tire hacia atrás de la jeringa para ver la sangre, lo que garantiza que el catéter se coloca en la vena de la cola.
9. Utilice una longitud 1 cm de cinta de laboratorio se coloca sobre la aguja para sujetar la aguja en su lugar en paralelo a la vena a lo largo de la longitud de la cola.

5. Procedimiento quirúrgico colgajo de piel para exponer el tumor mamario

1. Con el animal en la plataforma quirúrgica limpiar el tumor y la superficie ventral con el 70% de etanol. Nota: Como se ha descrito, este procedimiento no se realiza completamente de forma aséptica. Para las sesiones de formación de imágenes largas donde la infección puede llegar a ser un factor de confusión, se recomienda utilizar una técnica aséptica adecuada.
2. usando steriLe fórceps, levantar la piel ventral y con tijeras estériles hacen una incisión subcutánea a lo largo de la línea media ventral aproximadamente 1 cm de longitud. Evitar perforar el peritoneo durante la incisión.
3. cortar suavemente el tejido conectivo fijar la glándula mamaria y el tumor lejos del peritoneo para exponer el tumor mamario.
4. El uso de tijeras y pinzas, retire suavemente y cortar la fascia y la grasa de la superficie expuesta del tumor mientras se mantiene la integridad de la vasculatura del tumor y minimizar el sangrado. Este paso es crítico en el mantenimiento de la arquitectura tumoral y la vasculatura de alimentación del tumor.

6. Preparación de los animales de Microscopía

1. Transferir el animal a la etapa de formación de imágenes pre-calentado con el tumor expuesto colocado en el cubreobjetos en el inserto de la etapa sobre el objetivo del microscopio para la imagen. Tener cuidado para transferir el catéter vena de la cola suavemente con el animal con el fin de no desplazar la aguja.
2. º lugare anestesia nariz cono sobre el hocico del animal para mantener el conjunto de la anestesia isoflurano al 3%.
3. Coloque el animal de modo que el tumor se basa en el orificio de la almohadilla de goma y hace contacto con el cubreobjetos de vidrio.
4. Utilice dos almohadillas de goma para sujetar suavemente el tumor en su lugar y fijarlos a la platina del microscopio con cinta de laboratorio para reducir el movimiento durante la adquisición de imágenes.
5. Llenar la cámara de la almohadilla de goma con PBS para mantener el tejido hidratado y mantener el contacto óptico con el cubreobjetos.
6. Comenzar a monitorear los signos vitales del animal con una sonda de oxímetro de pulso. Adjuntar un sensor clip para el muslo del animal. Alternativamente, un cuello que está configurado para encajar alrededor del cuello se puede utilizar.
7. Coloque la caja de calentamiento sobre el animal para mantener 30 ° C ^20.
8. Lentamente reducir el nivel de isoflurano al 0,5-1% para mantener la anestesia y mantener el flujo de sangre.

7. Adquisición de imágenes y la inyección de FLUORESCLas proteínas inyectables ent Colorantes y

1. Utilizando el enfoque del microscopio ocular sobre las células tumorales fluorescentes en la superficie del tumor.
2. Seleccione un área de interés mediante la búsqueda de zonas de escape de los vasos sanguíneos. La selección de un área de interés con la que fluyen los vasos sanguíneos es fundamental para la evaluación de la vasculatura del tumor.
3. Una vez se ha seleccionado una región de interés conmutar el microscopio en el modo de imagen multifotónica.
4. Establecer los límites superior e inferior de una z-series. Establecer el límite superior de la serie Z utilizando el ajustador de enfoque para mover el objetivo a la posición de inicio deseada y hacer clic en el botón de posición Z "Inicio". Determinar el límite superior de la serie z mediante la visualización de la red de fibras de colágeno en la superficie del tumor en el canal de segunda generación armónica (SHG) y la observación de cuando no hay células, pero sólo las fibras de colágeno son visibles.
   1. Establecer el límite inferior de la serie Z moviendo el objetivo de la profundidad de imagen deseada (typically 50 - 150 micras) y haciendo clic en el botón de posición Z "inferior".
   2. Ajuste el tamaño de paso escribiendo el valor deseado en el campo Tamaño de paso. Determinar el tamaño del paso sobre la base de consideraciones para la resolución y el tiempo de adquisición (normalmente 2 micras se utiliza para la alta resolución de la reconstrucción 3D y 5 micras de otra manera).
5. Establecer el intervalo de lapso de tiempo al cambiar al panel de intervalos de tiempo y entrar en el lapso de tiempo deseado en el campo de lapso de tiempo. Para la resolución temporal óptima establecer el intervalo de tiempo de 0 segundos para la imagen continua. Nota: Para obtener imágenes a intervalos de tiempo que se recomienda ajustar el intervalo de tiempo de 10 segundos entre las adquisiciones para reponer el líquido de inmersión objetivo.
6. Una vez que se han determinado los parámetros para imágenes, inyectar lentamente 155 kDa dextrano-TMR.
   1. Retire la jeringa con PBS en el catéter de vena de la cola y reemplazar con la jeringa que contiene 155 kDa dextrano-TMR teniendo cuidado de no introducir burbujas en el linordeste.
   2. inyectar lentamente 155 kDa dextrano-TMR en el ratón, con un volumen máximo de 200 l, y vuelva a colocar la jeringa con la jeringa que contenía PBS. Paso crítico: Realizar la inyección lentamente y tomar las precauciones necesarias para evitar que la solución fuera de la vena.
7. Iniciar la adquisición de la imagen de lapso de tiempo pila Z haciendo clic en los botones de lapso de tiempo Z-Stack y para deprimir ellos y luego hacer clic en el botón de grabación.
8. Si otros dextranos fluorescentes, es decir, isotiocianato de 10 kDa de dextrano-fluoresceína (FITC), o proteínas, es decir, VEGFA _165, han sido preparados de antemano, inyectarlos después del inicio de la adquisición de imágenes para at = 0 inicio min.
   1. Retire la jeringa con PBS en el catéter de vena de la cola y reemplazar con la jeringa que contiene 10 kDa dextrano-FITC o VEGFA ₁₆₅ teniendo cuidado de no introducir burbujas en la línea.
   2. inyectar lentamente inyectables en el ratón a través del catéter en la vena caudaly sustituir la jeringa con una jeringa que contiene PBS.
9. Cada 30 a 45 min, inyectar lentamente 50 l de PBS o solución salina para mantener la hidratación del animal.

8. La eutanasia

1. A la terminación de la adquisición de imágenes, la eutanasia del animal.
   1. Aumentar el isoflurano al 5%.
   2. Mantener al animal por debajo del 5% de isoflurano hasta 30 segundos después de que se deja de respirar y eliminar al animal de la etapa.
   3. Realizar la dislocación cervical para asegurar la eutanasia completa.

Procesamiento 9. Imagen

1. Adquirir imágenes en archivos TIFF de 16 bits para cada canal individual en cada punto de tiempo y ahorrar de forma secuencial.
2. Realizar la separación de solapamiento espectral (es decir, las buenas prácticas agrarias y PPC), la eliminación de la deriva xy y la generación de películas a partir de secuencias de lapso de tiempo utilizando los métodos establecidos en ImageJ ^9. Realizar reconstrucciones de superficie 3D de imágenes de alta resolución ¹³.

Resultados

Extendido microscopía intravital de lapso de tiempo permite la resolución de la célula de imagen única de los procesos multicelulares en el microambiente tumoral. Por las células tumorales con fluorescencia etiquetado, macrófagos, el espacio vascular, y la visualización de la red de fibras de colágeno mediante la segunda señal de generación de armónicos, múltiples compartimentos en el microambiente del tumor se realiza un seguimiento de forma simultánea durante la exploraci?...

Discusión

interacciones celulares que se producen de forma espontánea en el microambiente del tumor puede conducir a cambios en la motilidad de las células tumorales y intravasación. -Alta resolución de imagen intravital del tejido tumoral vivo permite la visualización de la dinámica multicelulares que pueden ser altamente ^10,13,24 transitoria. Punto final en ensayos in vivo o imágenes con lapso de tiempo adquiridos con puntos de tiempo discretos pueden proporcionar información esencial sobre ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate	Sigma Aldrich	T1287	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
70 kDa dextran-Texas Red	Life Technologies	D-1830	reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate	Sigma Aldrich	FD10S	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Life Technologies	Q21561MP	Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection
MMTV-PyMT mice	Jackson Laboratory	2374
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)	Jackson Laboratory	26051
Csf1r-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
1x PBS	Life Technologies
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	AirTech
1 ml syringe, tuberculin slip tip	BD	309659
30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle	BD	305128
Polyethylene micro medical tubing	Scientific Commodities Inc	BB31695-PE/1	0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D.
Microscope coverglass	Corning	2980-225	thickness 1.5, 22 x 50 mm
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors	Kent Scientific
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
soft rubber pad	McMaster-Carr	8514K62	Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back
hard rubber pad	McMaster-Carr	8568K615	High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer
Microscope	Olympus		The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens.
7-Punch set	McMaster-Carr	3429A12	1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch