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Resumen

The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.

Resumen

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.

Introducción

La barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (BCSFB) es uno de los tres sitios de barrera entre la sangre y el cerebro 1. Su correlato morfológico son las células epiteliales del plexo coroideo (CP) 2,3, un convoluta endotelial-epitelial, que es fuertemente vascularizada y situado en los ventrículos del cerebro. El CP sirve para producir el líquido cefalorraquídeo (CSF), así como para separar esta última de la sangre. Con el fin de lograr la función de barrera, las células epiteliales CP muestran una actividad pinocíticas baja, expresan transportadores específicos, y están densamente conectadas por una red continua de las uniones estrechas (TJs) 2,3.

Las células humanas del papiloma del plexo coroideo (HIBCPP), derivado de un papiloma del plexo coroideo maligna de una mujer japonesa 4, se utilizaron para construir un modelo funcional en vitro de la BCSFB. HIBCPP células muestran un par de características de un BCSFB funcional como la formación de TJhebras, el desarrollo de un potencial de membrana de alta transepitelial que puede ser determinado como la resistencia eléctrica transepitelial (TEER), y permeabilidades menores de macromoléculas. Por otra parte, las células expresan transportadores HIBCPP característicos, que pueden servir para regular el microambiente iónica, y mostrar apical / basolateral 5,6,7 polaridad.

El BCSFB se ha demostrado que funcionan como un sitio de entrada para los patógenos (bacterias, virus y hongos) en el sistema nervioso central (CNS) 8. La invasión de patógenos, incluyendo Neisseria meningitidis (N. meningitidis), una bacteria Gram-negativas, puede causar enfermedades graves como la meningitis. La evidencia de que supera la barrera del epitelio de protección de la CP es apoyado por observaciones histopatológicas en pacientes con enfermedad meningocócica que exhibe una mayor cantidad de meningococos en los vasos y células epiteliales CP 9,10. Para poder entrar en las células huésped bacteria menudo secuestrar mecanismos endocytotic, que están mediadas o provocados por los receptores de superficie específicos localizados en las células huésped. Dado que las interacciones de patógenos con estos receptores pueden ser especies modelos 11, específicas de animales sólo pueden ser consultados en un grado limitado. La línea celular HIBCPP ofrece la oportunidad de estudiar el proceso de invasión, así como los mecanismos moleculares subyacentes en un sistema modelo humano. El empleo de insertos de cultivo celular nos permite analizar las interacciones de los agentes patógenos con células huésped desde dos lados distintos. Muchas bacterias, incluyendo N. meningitidis, están firmemente sujeto a los efectos de la gravedad durante ensayos de la infección. Para la interacción óptima de patógenos con las células HIBCPP durante los ensayos, las bacterias se añaden inicialmente en el compartimento superior del sistema de inserción de filtro de cultivo celular. Para permitir la infección de la apical o el lado basolateral de células, respectivamente, dos variaciones del sistema in vitro han sido thiscidos: En el sistema estándar células HIBCPP se siembran en el compartimiento superior del inserto de filtro, imitando la situación cuando los microorganismos se encuentran en el lado del CSF y se meten en contacto con el lado apical de las células (Figura 1A, C). Por el contrario, el uso de las células HIBCPP en un sistema de filtro de inserto de cultivo celular invertida refleja las condiciones cuando las bacterias han entrado en la corriente sanguínea. Los microorganismos difunden en la sangre y las células epiteliales CP encuentro desde el lado basolateral (Figura 1 B, C). Digno de mención, en este sistema modelo se ha demostrado que las bacterias invaden las células HIBCPP de una manera polar específicamente del 5,7 lado celular basolateral.

Posteriormente a la infección de la CP, los patógenos invadido pueden ser reconocidos por el sistema inmune innato a través de la ligadura a receptores de reconocimiento de patrones (PRR). los miembros descritos bien de los derechos y responsabilidades parentales pertenecen a la familia de receptores de tipo Toll (TLR). TLRs puede cubod para estructuras características de los microorganismos infecciosos, que son patrones moleculares asociados a patógenos (denominado PAMPS). La ligación de los receptores conduce a la activación de la célula huésped cascadas de señalización que activan la expresión de citocinas y quimiocinas 12, que a su vez estimulan la transmigración de las células inmunes a través de la BCSFB 13,14. Se ha demostrado que las células HIBCPP expresan varios TLRs a nivel de mRNA y que la infección con N. meningitidis resulta en la secreción de varias citocinas y quimiocinas, incluyendo CXCL1-3, IL6, IL8 y TNF 15,16.

A continuación, describimos el cultivo y la infección de la línea celular humana HIBCPP en un sistema de inserción de cultivo celular invertida que imita la BCSFB. Este sistema modelo permite estudiar las interacciones de patógenos con el lado in vivo relevante celular basolateral, así como la respuesta celular posterior.

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Protocolo

1. Preparar los elementos filtrantes de cultivo celular para células Siembra HIBCPP en un sistema invertido Modelo

  1. Pre-caliente DMEM / F12 (HAM) suplementado con 5 mg / ml de insulina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 10% de suero de ternera fetal (FCS).
  2. El uso de fórceps estériles para colocar en la zona de crecimiento de los cartuchos de filtro cultivo de células de 0,33 cm² con un tamaño de poro de 3 micras boca abajo en una placa de 12 pocillos (Figura 1E).
  3. Llenar medio en el compartimento inferior del filtro de inserción de cultivo de células (alrededor de 3 ml) y 100 l en la parte superior del inserto de filtro. Inundar la placa, así como el compartimiento inferior con el medio. Aspirar el medio excesiva de tal manera que el compartimiento inferior del inserto de filtro permanece lleno (Figura 1E).
    Nota: Se recomienda utilizar una pipeta serológica para este paso.
  4. Cubrir la placa de 12 pocillos con la tapa y transferir los insertos de filtro de cultivo celular preparado a la incubadora, 37 ° C,5% de CO 2 hasta la adición de las células.

2. Cultivo y pases de células HIBCPP

  1. Preparar DMEM / F12 (HAM) suplementado con 5 g / ml, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 10% FCS.
  2. Pre-caliente medio y PBS en un baño de agua a 37 °. Aspirar medio del frasco. Añadir 10 ml de PBS al matraz y remolino. Repita este paso una vez.
  3. Añadir 3 ml 0,25% de tripsina-EDTA al matraz y remolino. Colocar en la incubadora, 37 ° C, 5% de CO 2.
  4. Después de aproximadamente 20 minutos sacar el matraz de la incubadora. Asegúrese de que las células se separan del fondo del matraz y muestran una forma redonda cuando encuestados con el microscopio.
    Nota: Las células no se separan completamente una de otra y se encuentran a menudo en los aglomerados. Se recomienda el uso de las células hasta el paso 38.
  5. Para detener la tripsinización añadir 17 ml de medio. Resuspender las células pipeteando arriba y abajo y transferir la suspensiónen un tubo de 50 ml. Centrifugar a 50 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
  6. Resuspender las células en un volumen apropiado de medio y contar las células usando un hemocitómetro.
    Nota: La concentración de las células resuspendidas HIBCPP debe ser de 1 x 10 6 células / ml. Para el mantenimiento de las células HIBCPP se sugiere para transferir una cantidad de 1-6 x 10 6 células en 10 ml de medio a un T75-matraz. Cambio de medio cada segundo día.

3. Siembra de insertos de cultivo celular invertida de filtro con células HIBCPP

  1. En la parte superior de cada elemento filtrante invertida (es decir, el lado inferior del filtro) añadir 80 l de suspensión de células (es decir. 8 x 10 4 células) (Figura 1E).
    Nota: Asegúrese de que las células se distribuyen de manera uniforme en la suspensión invirtiendo el tubo antes de la siembra.
  2. Cubrir los insertos de filtro de cultivo sembrado de células con la tapa de la placa de 12 pocillos y la transferencia a la incubadora, 37 ° C, 5% de CO 2.
  3. En el primer día, llenar 1 ml de medio en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Levantar los elementos filtrantes de cultivo de células mediante el uso de fórceps fuera de la placa de 12 pocillos, se elimina el medio en el interior, a su vez los elementos filtrantes y colocarlos en la orientación estándar en la placa de 24 pocillos preparada (Figura 1E).
  4. Colocar las células en medio fresco cada dos días. Preparar 24 pocillos con medio fresco y transferir los insertos de filtro a la misma. Llenar inserciones con 0,5 ml de medio fresco. Compruebe TEER todos los días como se describe en la sección 4.
  5. Cuando los valores de TEER de HIBCPP células sembradas en insertos de cultivo celular supera el 70 Ω x cm² (aproximadamente 4 días después de la siembra), y luego continuar el cultivo de células en un medio que contiene 1% de FCS y 5 mg / ml de insulina. Preparar placas de 24 pocillos con 1 ml de medio de cada pocillo. Transferencia de elementos filtrantes a los pocillos preparados y medio de intercambio en el compartimiento superior.
    Nota: Esta retirada del suero después de la confluencia conduce a la formación deun potencial de membrana superior.
  6. Aspirar medio del compartimiento del filtro, traslado al bien preparado y rellenar con 500 l de medio. Repita este paso una vez. Poner las células durante la noche en la incubadora, 37 ° C, 5% de CO 2.

4. La medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER)

  1. Sumergir las puntas de los electrodos de voltohmmeter tejido epitelial durante 15 min en 80% de etanol. Transferir voltohmmeter bajo el capó y dejar que seque el electrodo por un momento. Coloque electrodo en medio de cultivo respectivo utilizado para las células durante otros 15 min para equilibrar.
  2. Realizar mediciones colocando el brazo más largo del electrodo de modo que toque la parte inferior del compartimiento inferior cada vez, coloque el brazo más corto en el compartimento de inserción del filtro.
    Nota: Los valores de resistencia de los cartuchos de filtro de cultivo celular sin células en el medio se debe utilizar como valores en blanco ((valor medido (Ω) - valor en blanco (Ω)) x Filtrosuperficie (es decir, 0,33 cm $ ² $)).
  3. Después de medir lugar el electrodo de nuevo en 80% de etanol durante 15 min. Almacenar en un tubo seco.

5. Determinación de la permeabilidad paracelular

  1. Disolver 1 g FITC-inulina en 200 ml de medio de cultivo suplementado con 5 mg / ml de insulina 1% de FCS. Aplicar 50 mg / ml de la solución en el compartimento superior del filtro antes de la infección de las células.
  2. Después de la infección recoger muestras de medio desde el pozo inferior para determinar la cantidad de inulina pasa desde el compartimiento del filtro a través de la capa de células.
  3. Preparar una solución estándar FITC-inulina y llevar a cabo diluciones 1: 2, 10 veces (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% y 0%) . Detectar la fluorescencia mediante la medición de todas las muestras en un lector de microplacas.

6. Preparación de bacterias para la infección de células en cultivo celular HIBCPP Filtrar insertos

  1. Un día antes del experimento, rascado tél N. congelada meningitidis cepas de una glicerol-social y consecutivas a cabo en agar chocolate con Vitox. Crecer durante la noche en la incubadora, a 37 ° C, con 5% de CO 2.
  2. Extraer 20-30 colonias del cultivo durante la noche y transferir a un tubo que contiene 8 ml Proteosa Peptona medio suplementado con 0,042% de NaHCO3, 0,01 M MgCl 2 y 1% Polyvitex.
  3. Agitar las bacterias durante 1,25 horas a 220 rpm, 37 ° C. Sedimentar las bacterias por centrifugación a 2684 g durante 10 min a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento bacteriano con medio libre de suero 8 ml. Vórtice para asegurar una suspensión uniforme.
  4. Para determinar la densidad de cultivo, medir una dilución de 1:10 en una densidad óptica (DO) de 600 nm. Ajustar la suspensión bacteriana a una DO 600 de 0,1.
    Nota: Esta suspensión contiene aprox. 1 x 10 8 UFC / ml.
  5. Para confirmar la concentración de células bacterianas, se diluye la suspensión por pasos (01:10) hasta unadilución de 10 -5 y placa sobre placas de agar chocolate.
    Nota: diluciones seriadas similares necesitan ser realizados para calcular las curvas de crecimiento bacteriano.

7. Infección de células en cultivo celular HIBCPP filtro inserciones y Determinación de la invasión bacteriana por inmunofluorescencia doble

  1. Después de continuar el cultivo de células en medio que contiene 1% de FCS y 5 mg / ml de insulina, medir las células cada día usando un voltohmmeter tejido epitelial. Si las células han alcanzado un TEER de alrededor de 500 Ω x cm², llevar a cabo la infección.
  2. Infectar las células con la suspensión bacteriana preparada a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Tienda de las células infectadas en la incubadora, a 37 ° C, con 5% de CO 2 durante el período de tiempo indicado.
    Nota: La MOI se puede calcular teniendo en cuenta el número de células por filtro de inserto de cultivo celular a confluencia (1,21 x 10 6 células / cm 2).
  3. Detener el Infection lavando tres veces con 500 l de medio libre de suero (SFM) que contiene albúmina de suero bovino 1% (BSA) aplicada al compartimiento del filtro, 1 ml para el compartimiento inferior.
  4. Bloquear con 500 l SFM que contenía tampón de BSA 1% en el compartimiento del filtro y 1 ml en el compartimiento inferior para 20 min a temperatura ambiente para evitar la adherencia de los anticuerpos a los sitios de unión no específica.
  5. Incubar con 100 l de anticuerpo primario contra N. meningitidis α-OMP (1: 200) en el compartimiento del filtro y 500 l en el compartimiento inferior para 20 min a temperatura ambiente.
    Nota: Si es necesario, la concentración de anticuerpo necesita ser valorada.
  6. Se lavan las células aspirando el medio desde el compartimiento del filtro, transferir el elemento filtrante a una SFM bien con 1 ml de preparado que contiene 1% de BSA y llenar el compartimiento del filtro de vaciado con SFM 500 l que contiene 1% de BSA. Repita este paso dos veces.
  7. Fijar las células con 500 l 4% de formaldehído en el filtro de compartamento, 1 ml en el compartimiento inferior durante 10 min a temperatura ambiente.
  8. Se lavan las células aspirando el medio desde el compartimiento del filtro, transferir el elemento filtrante a un bien preparado con 1 ml de PBS y llenar el compartimiento del filtro de vaciado con 500 l de PBS. Repita este paso una vez.
    Nota: Las muestras pueden ser almacenadas durante la noche en PBS a 4 ° C.
  9. Cut cultivo celular fijo filtra de los insertos y se lava con 250 l de PBS que contiene 1% de BSA. Se incuban las células durante 15 min a temperatura ambiente con 250 l fluorescente marcada (longitud de onda de excitación 594 nm) de pollo anticuerpo secundario anti conejo (1: 500) para teñir las bacterias extracelulares.
    Nota: Si es necesario, la concentración de anticuerpo necesita ser valorada.
  10. Permeabilizar las células con 250 l de PBS que contiene 1% de BSA y 0,5% de Triton X-100 durante 1 hora a temperatura ambiente. Lavar las células tres veces con 250 l de PBS que contiene 1% de BSA.
  11. Incubar con 250 l de anticuerpo primario contra N. meningitidis α-OMP (1: 200) durante 30 minutos para teñir bacterias extra e intracelulares. Lavar las células tres veces con 250 l de PBS que contiene 1% de BSA.
  12. Aplicar 250 l de marcado fluorescente (excitación de longitud de onda 488 nm) anticuerpo secundario (1: 500), marcado fluorescente (excitación de longitud de onda 660 nm) faloidina (1: 250) y 4 ', dihidrocloruro de 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ( 1: 50000) durante 1 hora a temperatura ambiente para teñir bacterias extra e intracelulares, citoesqueleto de actina y núcleos.
    Nota: Si es necesario, la concentración de anticuerpo necesita ser valorada.
  13. Lavar las células tres veces con 250 l de PBS que contiene 1% de BSA. Incrustar las células en el medio y se almacena a 4 ° C hasta que el examen de montaje a través del microscopio.
  14. Determinar el número de bacterias invadidas por campo predefinido. Para ello, contando 20 campos por filtro de membrana. Calcular el porcentaje de bacterias invadidas.
    Nota: Multiplicar el número de bacterias media de los 20 campos microscópicos con un área de Coefficient. El resultado se expresa la cantidad de bacterias totales presentes en un filtro de cultivo de células de inserción 0,33 cm². Divida este valor por la cantidad de bacterias cultivadas en medios durante la duración de la infección.

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Resultados

Aquí se describe el cultivo y la infección de las células HIBCPP en un sistema de inserción de cultivo celular invertida. Este modelo nos permite estudiar los mecanismos de invasión y las vías de señalización molecular subyacente desde el lado basolateral de células, que reproduce una situación fisiológica de las bacterias que entran y difusión de las células epiteliales a través del torrente sanguíneo (Figura 1).

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Discusión

Las células epiteliales de la CP forman la BCSFB que separa el CSF desde el 2,3 sangre. Recientemente se estableció la línea celular HIBCPP como un modelo humano funcional de la BCSFB. Las células muestran importantes funciones de barrera de la BCSFB in vitro, incluyendo el desarrollo de un alto potencial de membrana, una baja permeabilidad para las macromoléculas, así como la presencia de hebras continuas de TJs 5. Las proteínas TJ contribuyen a una polaridad apical / basolateral d...

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Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056
4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI)Life TechnologiesD1306
12-well platesStarlabCC7682-7512
24-well platesStarlabCC7682-7524
Anti Neisseria meningitidis α-OMPThis antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany)
Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit)InvitrogenA21441
Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit)InvitrogenA21442
Alexa Fluor 660 PhalloidinInvitrogenA22285
Bovine serum albumine (BSA)Calbiochem12659
Chocolate agar platesBiomerieux43109
Cytochalasin DSigmaC8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPESGibco31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o PhenolredGibco11039-047
Dimethyl sulfoxideSigmaD2650
Fetal calf serum (FCS)Life Technologies10270106
FITC-InulinSigmaF3272
InsulinSigma19278
MgCl2Sigma2393
NaHCO3Sigma55761
PBS + Mg + CaGibco14040-174
Penicillin/StreptomycinMP Biomedicals1670049
PolyvitexBiomerieux55651
Proteose peptoneBD211684
Serum-free mediumGibco10902-096
Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µmGreiner662630
Tissue culture flask 75 cm² red cap sterileGreiner658175
Triton X-100SigmaT8787
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrodeMilliporeMERSSTX00

Referencias

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