Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Resumen

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Resumen

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Introducción

En las lesiones nerviosas, los muñones proximal y distal del nervio a menudo no pueden realineación directa de fascículos nerviosos debido a la zona de la lesión ^1-2. Normalmente, los tractos de axones se componen de haces altamente ordenados y alineados de los axones, que forman redes complejas de conectividad. Sin embargo, la regeneración nerviosa es un proceso caótico debido a la alineación del axón mal organizada ^3-4. Por lo tanto, para generar un número suficiente de regeneración de los axones que unen el sitio de la lesión, es necesario para inducir la alineación axonal bien organizado. Además, desmielinización acompaña a lesiones del nervio debido a la muerte de las células mielinizantes en el sitio de la lesión. Desde desmielinización deteriora fuertemente la capacidad conductora de sobrevivir a los axones, los tratamientos dirigidos desmielinización o promueven la remielinización son significativos para la recuperación funcional tras la lesión del nervio ^5. Así, el objetivo de este protocolo es ilustrar un enfoque de ingeniería que se ocupa de estas dos cuestionesde la regeneración nerviosa.

Anisotropía de superficie, que se define como la diferencia, cuando se mide a lo largo de diferentes ejes, en las propiedades físicas o mecánicas de un material, se ha aplicado a influir en la alineación celular, el crecimiento y la migración ^6-7. Además de la topografía, hay otros métodos para inducir anisotropía. Anteriormente, se investigó la anisotropía inducida por la superficie mecánica de pre-estiramiento estático de membrana de poli-dimetil-siloxano (PDMS). La teoría de la "pequeña súper deformación impuesta a gran" predijo que la rigidez efectiva de las células sentido en la dirección estirada difiere de la dirección perpendicular, y esta diferencia en la rigidez efectiva se debe a la anisotropía ⁸ la superficie. Las células madre mesenquimales (MSCs) cultivadas en una membrana de pre-estirado PDMS son capaces de detectar la anisotropía tirando activamente la superficie y, como resultado, alinear en la dirección de pre-estirado ^9. Del mismo modo, un ar superficie anisotrópicaising de una superficie pre-estirado mecánico afecta a la alineación, así como el crecimiento y la mielinización de ganglio de la raíz dorsal (DRG) axones ^10. Aquí proporcionamos un protocolo para la inducción de la anisotropía de superficie sobre un sustrato pre-estirado estática PDMS para mejorar la regeneración de axones ^10.

A fin de obtener la alineación del axón, características topológicas con patrones deseados, reportado por brindar orientación contacto a través de las fibras y los canales ^6,11-12 alineados, se demostró para facilitar la alineación axón ^11,13. Sin embargo, informó técnicas para la inducción de la alineación del axón a través de características topológicas, tales como fibras, los canales y los patrones, no fueron capaces de alargar y aumentar el grosor de los axones. Por el contrario, gradual estiramiento mecánico llevó a alineación axón en la dirección de estiramiento con axones más largos y más gruesos que el aumento de la magnitud del tramo ^14. Sin embargo, la incorporación de un dispositivo de motor alimentado in vivo no esfactible. En contraste, la anisotropía inducida por el pre-estirado estática es menos complicado y se puede incorporar más fácilmente en los futuros diseños de andamios para aplicaciones in vivo.

En este protocolo, un sistema de cultivo de células pre-estirado estático se utiliza para inducir anisotropía superficie sin características topológicas. El sistema de cultivo pre-estirado se compone de una membrana de PDMS, un marco estirable y una etapa de estiramiento, después de lo cual la membrana se fija sobre el marco y una magnitud tramo predeterminado se aplica en la etapa de estiramiento. recién aisladas DRG neuronas cultivadas en la superficie pre-estirado hasta por 21 días son monitoreados para la alineación del axón y grosor. Posteriormente, las células de Schwann (SC) co-cultivadas con los axones alineados están supervisados ​​por la mielinización. Mediante la incorporación inducida de pre-estirado anisotropía superficie hemos sido capaces de mejorar la alineación de células-diferenciación y axón alineación-crecimiento de MSCs y las neuronas DRG ^9-10, respectivamente.

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Protocolo

Todos los procedimientos para el aislamiento de las células fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad del Estado de Michigan.

1. Preparación de pre-estirado superficial anisotrópico

1. Mezclar un 10: 1 solución de base y agente de curado y se vierte la mezcla en una placa de cultivo tisular (12 cm de diámetro). Utilice 4,900 mg de base y 490 mg de agente de curado de la mezcla total de reticulación.
2. Mantener la mezcla de gel a vacío durante 20 min para eliminar las burbujas de aire.
3. Colocar la mezcla de gel en el horno para el curado durante la noche a 60 ° C.
4. Después de que los curas de membrana de PDMS, tratar la superficie con plasma de oxígeno usando un sistema de limpieza / ataque con plasma durante 3 minutos a 165 mTorr y 65 sccm flujo de _O2.
5. Cortar un trozo de membrana rectangular (5 x 3,5 cm) desde el plato, mientras que ser consciente de qué lado está tratado con oxígeno, asegúrese de que el lado tratado con oxígeno esté orientada hacia arriba y fijar sobre un marco de estiramiento. Coloque el marco en una estiramiento etapa y de manera uniforme estirar girando la perilla en el escenario hasta que llega a 10% de alargamiento (o algún otro tramo predeterminado; el alargamiento se puede leer directamente desde la etapa de estiramiento) en el eje más largo ^9. Fijar el tramo apretando los tornillos en el marco.
6. Retire el marco de la etapa. Asegúrese de que la superficie de la membrana esté seca y libre de polvo, a continuación, colocar una cámara de silicona sobre la membrana que permite el lado pegajoso de la cámara para fijar firmemente a la membrana.
   Nota: La cámara de silicona proporciona un pozo para retener el medio de células en la membrana de PDMS. El diseño del dispositivo se muestra en la Figura 1.
7. Esterilizar la superficie con UV durante 10 min.
8. Añadir 1 ml de poli-L-lisina (PLL) (0,01% en solución salina tamponada con fosfato) a la superficie de PDMS dentro de la cámara, dentro de 6 h de tratamiento con plasma y se incuba durante 2 horas a 37 ° C antes de la siembra de las neuronas DRG. Esto mejora la unión celular.

Le "> 2. El aislamiento de DRG

1. Preparar medio de crecimiento estándar para las neuronas DRG.
2. Antes de la aislamiento, autoclave el equipo de aislamiento y los reactivos de filtro. Añadir 5 ml de tampón de aislamiento en un pocillo de una placa de 6 pocillos, y se coloca la placa en hielo. Preparar 10 ml de medio de disociación mediante la adición de 1 ml de colagenasa A (500 U / ml) a 9 ml de 0,05% de tripsina-EDTA (1 mg / ml), filtrar las soluciones con un filtro de 0,22 micras y el lugar en el hielo.
3. Utilice diez a doce de 5 - 7 días de edad ratas Sprague-Dawley para el aislamiento. Pulverizar las crías, con un 75% de isopropanol, y el sacrificio por decapitación.
4. Cortar la piel que recubre la médula espinal de la parte posterior y eliminar cualquier exceso de tejido alrededor de la columna vertebral. Bajo una lupa quirúrgica con las luces del punto quirúrgicas en, hacer la primera incisión en el cuello y luego un corte a lo largo de la columna vertebral en ambos lados con unas tijeras. Separar la espina dorsal del cuerpo de los cachorros y eliminar el exceso de músculos. A continuación, utilice unas tijeras para cortar a lo largo de la long eje de las pinzas de la columna vertebral y utilizar para abrir completamente la columna vertebral y extraer la médula cord.Remove la punta de una pipeta para crear una abertura más grande para la transferencia de los GRD con tampón de aislamiento en un tubo estéril de 15 ml.
5. El uso de un buen par de pinzas, extraer el ganglio del bolsillo hueso y recoger aproximadamente 10-16 DRG de ambos lados. Recortar las raíces nerviosas y la transferencia de los ganglios al tampón de aislamiento enfriado con hielo.
6. Retire la punta de una pipeta para crear una abertura más grande para la transferencia de los GRD con tampón de aislamiento en un tubo estéril de 15 ml. Después de la disociación química, centrifugar los ganglios a 900 xg y 4 ° C durante 5 min.
7. Deje que los tejidos se depositan en el fondo del tubo y suavemente retire el tampón de aislamiento en la parte superior y añadir 10 ml de medio de disociación en el tubo.
8. Incubar los tejidos disecados en el medio de disociación en un baño de agua a 37 ° durante 1 hora mientras se agitaba el tubo de cada 5 a 10 min.
9. Despuésla disociación química, centrifugar los ganglios a 900 xg y 4 ° C durante 5 min.
10. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de medio de crecimiento estándar y de vórtice.
11. Centrifugar las células disociadas como se indica en la sección 2.9, una vez más.
12. Eliminar el sobrenadante, volver a suspender el sedimento en 12 ml de medio de crecimiento estándar y vórtice.

3. Cultura de DRG en pre-estirada de superficie

1. Antes de sembrar las células, eliminar las soluciones de PLL de la cámara y enjuagar la superficie de PDMS con agua estéril y secar al aire.
2. Después de volver a suspender las células, permitir que el conjunto de suspensión para 1-2 min para permitir que los desechos se deposite en el fondo del tubo. Añadir 1,5 ml de suspensión celular en cada cámara de estiramiento y se incuba a 37 ° C en 5% de CO _2.
3. Para eliminar las células gliales, en el día 1 in vitro (DIV), añadir 10 l (15 l) o mezcla de fluoro-2-desoxi uridina y uridina (FDU-T) stock solutien (Véase la Tabla de Materiales) a cada pocillo. Después de 7 h, reemplazar este medio con medio de crecimiento estándar fresco y colocar el dispositivo de cultivo pre-estirado en una incubadora de 37 ° C con 5% de CO _2.
4. Durante el período de cultivo celular (2 - 3 semanas), cambiar los medios de comunicación cada dos días, reemplazando la mitad del medio gastado con medio fresco. Nota: Después de cultivar en las superficies estiradas y no estiradas para 2 semanas, SCs purificados se añaden a la cámara y se cultivaron durante otra semana (paso 4.7).

4. Co-cultivo de células de Schwann (SCS) con DRG neuronas en la pre-estirada de superficie

1. Aislar las SC como se describe anteriormente por el grupo del Dr. ¹⁵ Campana.
   1. En resumen, aislar el SC de un cachorro de 1 día. Recoger y disociar los nervios ciáticos tanto química (tripsina-EDTA y colagenasa A) y mecánicamente (calibre 18 agujas / jeringas de 10 ml) ^15.
   2. Sembrar las células disociadas en poli-D-lisina (PDL) coado matraz T25 y el cultivo a 37 ° C en 5% de CO _2. En el día 5, purificar las células a través de la selección de anticuerpos utilizando anti-Thy 1.1 anticuerpo y complemento de conejo y el subcultivo de las células purificadas a paso 2 - 4. medio Uso de cultivo que contiene medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 10% de suero bovino fetal (FBS) , 1% penicilina / estreptomicina (Penn / Strep), 21 mg / ml bovina pituitaria extracto (BPE), y 4 M forskolina.
2. Retire el medio de cultivo de las castas, y añadir 5 ml de 0,05% tripsina-EDTA en el matraz. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de _CO2 durante 2 a 3 min.
3. Verificar si las células bajo el microscopio óptico utilizando un objetivo 10X para ver si se levantan del matraz, a continuación, añadir 5 ml de medio de cultivo y se mezcla con las células en el matraz.
4. Añadir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar a 200 xg y 20 ° C durante 5 min.
5. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 7 ml de medicina de crecimiento estándar DRGI a.
6. Tomar 10 l de suspensión de células en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, se mezcla con 10 l de azul de tripano, y luego contar el número de células utilizando un hemocitómetro bajo un microscopio óptico utilizando un objetivo 10X. Se diluye la suspensión celular a 5.000 células por ml mediante la adición de medio de crecimiento DRG.
7. Retirar 0,5 ml de medio del cultivo de DRG en la cámara de estirado y añadir 0,5 ml de la suspensión SC a la cultura DRG.
8. Cultivar las células durante 1 semana a 37 ° C y 5% de CO _2. Cambiar los medios de comunicación cada dos días mediante la sustitución de la mitad del medio gastado con medio de crecimiento estándar fresco para la DRG. Después de 1 semana de co-cultivo, proceso de las células mediante técnicas de inmunohistoquímica ^10.

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Resultados

El sistema de cultivo celular pre-estirada promovido DRG alineación axón ^10. DRG neuronas se cultivaron sobre superficies pre-estiradas y sin estirar durante 12 días. Los axones fueron teñidos para β-III-tubulina para demostrar su alineación. La Figura 2 compara la orientación axón en el PDMS pre-estirados y sin estirar sustratos después de 12 días de cultivo. Los axones DRG alineados paralelamente a la dirección de estirado, mientras que mostraron ...

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Discusión

Para inducir la alineación axón en la superficie pre-estirado, hay dos pasos críticos: 1) la membrana de PDMS debe ser plana y de un espesor homogéneo; y 2) las células gliales se deben retirar de la DRG. Después de mezclar el PDMS y agente de reticulación y curado en un horno, el gel reticulado PDMS debe mantenerse en la cima de banco plano y manejarla con cuidado para evitar cualquier inclinación. El tratamiento con plasma de oxígeno de la membrana de PDMS se debe seguir dentro de 6 h por recubrimiento de PLL...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml).
FDU Uridine stock solution			FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.