Implantación y grabación de Electrorretinograma Wireless y del potencial evocado visual en ratas conscientes

Resumen

Mostramos implantación y grabación de los procedimientos quirúrgicos para medir señales electrofisiológicas visuales desde el ojo (electrorretinograma) y el cerebro (potencial evocado visual) en ratas conscientes, que se parece más a la condición humana, donde las grabaciones se realizaron sin anestesia confunde.

Resumen

El electrorretinograma de campo completo (ERG) y los potenciales evocados visuales (VEP) son herramientas útiles para evaluar la retina y la integridad de las vías ópticas, tanto en el laboratorio como en clínica. Actualmente, las mediciones ERG y PEV preclínicos se realizan con anestesia para asegurar la colocación de electrodos estables. Sin embargo, la presencia misma de la anestesia se ha demostrado que contaminar las respuestas fisiológicas normales. Para superar estos factores de confusión de anestesia, desarrollamos una novela plataforma para ensayar ERG y PEV en ratas conscientes. Los electrodos se implantan quirúrgicamente sub-conjuntival en el ojo para ensayar la ERG y epidural sobre la corteza visual para medir el VEP. Una gama de amplitud y sensibilidad / parámetros de tiempo se analizan para determinar tanto el ERG y PEV a aumentar las energías luminosas. Las señales ERG y PEV se muestran para ser estable y repetible durante al menos 4 semanas después del implante quirúrgico. Esta capacidad de grabar señales ERG y PEV sin anestesia en los confunde s preclínicosrocedimien debe proporcionar traducciones de gran calidad a los datos clínicos.

Introducción

El ERG y VEP son mínimamente invasivos en herramientas in vivo para evaluar la integridad de las vías de la retina y visuales, respectivamente, en tanto en el laboratorio y de la clínica. El ERG de campo completo produce una forma de onda característica que se puede dividir en diferentes componentes, con cada elemento que representa diferentes clases de células de la retina ^1,2 vía. El ERG de campo completo de forma de onda clásica consiste en una pendiente inicial negativa (una onda), que se ha demostrado que representan los fotorreceptores actividad post exposición a la luz ^2-4. La onda a es seguido por una forma de onda positiva sustancial (b-onda), que refleja la actividad eléctrica de la retina medio, predominantemente las células ON-bipolares ^5-7. Además, se puede variar la energía luminosa e inter-estímulo-intervalo para aislar cono de respuesta de los bastones ^8.

El flash VEP representa los potenciales eléctricos de la corteza y el tallo cerebral visual en respuesta a la estimulación de la luz de la retina^9,10. Esta forma de onda se puede descomponer en componentes tempranos y tardíos, con el componente de principios de actividad de las neuronas de la vía retino-geniculo-estriada ^{11 a 13} y el componente tarde que representa el procesamiento cortical realizarse de diversas láminas V1 en ratas ^11,13 reflectante. Por lo tanto la medición simultánea de la ERG y PEV vuelve evaluación exhaustiva de las estructuras implicadas en la vía visual.

Actualmente, a fin de registrar la electrofisiología en animales, se emplea anestesia para permitir una colocación estable de los electrodos. Ha habido intentos de medir ERG y PEV en ratas conscientes ^14-16 pero estos estudios emplea una configuración de cable, que puede ser engorroso y puede conducir a estrés de los animales mediante la restricción de los movimientos del animal y el comportamiento natural ^17. Con los recientes avances en la tecnología inalámbrica, incluyendo la mejora de la miniaturización y la duración de la batería, ahora es posible implementar un enfoque de telemetría para un ERGd grabación de los VEP, disminuyendo el estrés asociado con las grabaciones de cable y la mejora de la viabilidad a largo plazo. Plenamente internalizados implantaciones estables de sondas de telemetría han demostrado tener éxito para el control crónico de la temperatura, la presión arterial ^18, la actividad ^19, así como la electroencefalografía ^20. Tales avances en la tecnología también ayudará con la repetibilidad y la estabilidad de las grabaciones conscientes, lo que aumenta la utilidad de la plataforma para estudios crónicos.

Protocolo

Ética declaración: Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con el Código Australiano para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos (2013). aprobación ética animal se obtuvo del Comité de Ética Animal de la Universidad de Melbourne. Los materiales en este documento son para experimentos de laboratorio solamente, y no para uso médico o veterinario.

1. Preparación de electrodos

Nota: Un transmisor de tres canales se utiliza para la implantación quirúrgica que permite 2 ERG y grabación 1 VEP para ser llevado a cabo de forma simultánea. Los tres activo y tres electrodos inactivos deben ser pre-formado en forma de anillo antes de la implantación con el fin de insertarse en el ojo. A efectos de identificación, el fabricante ha cerrado electrodos activos en la mitad blanco, mitad vainas de plástico de colores, mientras que los electrodos inactivos están cubiertos en fundas de colores completos. El electrodo de masa (envoltura de plástico transparente) se deja inalterada. Para todos electr activa e inactivaconducta odas los pasos 1.1, 1.2, 1.3 y 1.7.

1. Desenroscar el electrodo de acero inoxidable de doble cadena con dos pinzas de punta fina.
2. Recorte una de las hebras de acero inoxidable (aproximadamente 1 cm desde la punta), dejando una sola hebra larga recta restante para dar forma al electrodo de anillo.
3. Doble la hebra simple de acero inoxidable sobre sí mismo y la torsión, formando un anillo liso en la punta del electrodo.
4. Para los electrodos activos manera ERG este bucle ~ 0,2 - 0,5 mm de diámetro por torsión de la base del bucle (para el propósito descrito aquí, forma dos electrodos activos de este modo para grabar ERG de ambos ojos), y para el ERG inactivo y VEP electrodos hacen que el diámetro del bucle ~ 0,8 mm de diámetro (en este ejemplo, hacer esto para un electrodo activo y VEP los tres electrodos inactivos).
5. Enganche la circular VEP electrodo activo en torno a un tornillo de acero inoxidable (diámetro 0,7 mm, longitud de 3 mm) de modo que el electrodo se apoya contra la cabeza del tornillo.
6. Hook los 3 electrodos inactivos (2 ERG, 1 VEP) alrededor de un segundo tornillo de acero inoxidable (diámetro 0,7 mm, longitud de 3 mm).
7. Tire de la funda de plástico hacia delante sobre los extremos afilados de la barra de acero inoxidable de dos a reducir la irritación.
8. Esterilizar los transmisores de telemetría por inmersión en glutaraldehído al 2% durante más de 10 horas a aproximadamente 25 ° C. A continuación, enjuagar el transmisor con solución salina estéril 3 veces.

2. La implantación del transmisor

1. Preparación de los animales
   1. Desinfectar el área de la cirugía antes de la experimentación de una limpieza con etanol al 70%. Autoclave todo el equipo quirúrgico antes de usar y mantener el equipo en clorhexidina cuando no se utiliza durante la cirugía. Cubrir el animal con un paño quirúrgico durante la cirugía para mantener un ambiente estéril. Asegúrese de que todos los experimentadores usan máscaras quirúrgicas, guantes y batas estériles.
   2. Inducir la anestesia con 1,5 a 2% de isoflurano, a una velocidad de flujo de 3 L / min y mantenidefinido en 1,5 a 2% en 2 L / min durante toda la cirugía. Confirmar suficiente profundidad de la anestesia por la ausencia de un reflejo del pedal al pellizcar el músculo entre los dedos de los pies.
   3. Afeitarse un área de 40 mm x 30 mm sobre el abdomen por encima de la ingle hasta el esternón.
   4. Shave un área de 30 mm x 20 mm sobre la frente, posterior a los ojos y anterior a los oídos.
   5. Desinfectar las dos áreas afeitadas. Para la zona de la frente desinfectar con 10% de povidona yodada en tres ocasiones (evitar el uso de antisépticos a base de alcohol para el área cerca del ojo, siendo consistente con la Norma de conducta establecido por la Asociación de tecnólogos quirúrgicos). Durante el abdomen desinfectar con 10% de yodo povidona y 70% de etanol.
   6. Aplicar 1 gota de proximetacaína a la córnea para la anestesia tópica adicional.
   7. Aplicar 1 gota de carboximetilcelulosa de sodio a la córnea para prevenir la sequedad de los ojos.
2. La implantación quirúrgica
   1. Hacer una incisión de 10 mmen la cabeza a lo largo de la línea media vertical entre las orejas con un bisturí quirúrgico.
   2. Se practica una incisión de 5 mm en el abdomen a través de la capa de piel a lo largo de la línea media por debajo del esternón.
   3. Túnel a 5 mm de diámetro de la cánula por vía subcutánea desde la incisión del abdomen a la incisión cabeza.
   4. Alimentar a los hilos de los electrodos (3 activos y 3 inactivos) del transmisor a través de la cánula del abdomen a la cabeza.
   5. Deje el electrodo de referencia con la base transmisor y cubrir la punta del electrodo con una gasa aséptica.
   6. Cubrir las puntas de los electrodos (3 activos y 3 inactivos) con una gasa aséptica.
   7. Asegure la cabeza de la rata a una plataforma estereotáxica.
   8. Extender la incisión frente a 30 mm de longitud con tijeras quirúrgicas.
   9. Exponer el área quirúrgica mediante la retracción de la piel floja con 2 suturas (3 - 0) en ~ 3 y las 9 horas.
   10. Raspar el periostio que recubre el cráneo con una gasa esterilizada para exponer las suturas bregma, lambda y la línea media.
   11. Perforar dos agujeros a través del cráneo en el VEP activa (7 mm ventral al bregma 3 mm lateral a la línea media) e inactivo (5 mm rostral al bregma en la línea media) estereotáxica coordenadas.
   12. Adjuntar VEP electrodos activos e inactivos con tornillos pre-adjunta de acero inoxidable (diámetro de 0,7 mm y una longitud de 3 mm) en el cráneo con un pequeño destornillador de ~ 1 mm de profundidad en los agujeros prefabricados. Esto fija el tornillo para el hueso sin dañar el tejido cortical subyacente.
   13. Para implantar los electrodos activos ERG utilizan un 8 - 0 sutura para retraer temporalmente el párpado superior.
   14. Insertar un 16 a 21 G por vía subcutánea cánula desde detrás del ojo hasta el fondo de saco conjuntival superior.
   15. Retire la aguja guía.
   16. Alimentar el electrodo activo a través del catéter de plástico acortado desde la frente hacia el ojo. A continuación, retire el catéter de plástico.
   17. Utilice una sutura temporal (8-0), que está roscado a través del lazo del electrodo, para evitar que los elecelectrodo se retraiga de nuevo en el túnel.
   18. Hacer una incisión de 0,5 mm en la conjuntiva superior a las 12 horas, 1 mm por detrás del limbo. Utilice una disección roma para exponer la esclerótica subyacente.
   19. Implantar un 8 - 0 con o 9 - 0 simplemente sutura inmediatamente detrás del limbo a la mitad de espesor escleral.
   20. Retire la sutura temporal del ERG electrodo activo.
   21. Anclar el electrodo activo ERG a la media de sutura espesor escleral atando 3 nudos consecutivos, lo que garantiza que la punta del electrodo está situado cerca del limbo.
   22. Cerrar el colgajo conjuntival usando de 1 a 2 suturas interrumpidas (8 - 0 a 9 - 0). Asegúrese de que la conjuntiva cubre completamente el electrodo ERG para mejorar la comodidad.
   23. Retire el párpado retracción de sutura.
   24. Repetir el procedimiento para el ojo contralateral.
   25. Aplicar gel de cianoacrilato sobre el cráneo para asegurar todos los tornillos de acero inoxidable y cables de los electrodos. Asegúrese de que los electrodos activos ERG no están demasiado apretadas antes de asegurar que enmovimientos oculares portacables.
   26. Cerrar la herida en la cabeza con un no-absorbible 3 - 0 con sutura.
   27. Girar roedor para exponer el área abdominal. Alargar la incisión cutánea abdominal para 40 mm a lo largo de la línea alba con tijeras quirúrgicas.
   28. Se practica una incisión 35 mm a través de la pared muscular interior para exponer la cavidad abdominal interior.
   29. El uso de dos suturas (3 - 0) adjuntar el cuerpo del transmisor a la pared abdominal interna lado derecho del animal. Evitar el contacto con el hígado.
   30. Pase el electrodo de masa y seguro en esta forma con una sutura (el 3 - 0). Coloca que flote en la cavidad abdominal.
   31. Cerrar el peritoneo usando una sutura continua (el 3 - 0).
   32. Cerrar la incisión de la piel usando suturas interrumpidas (3 - 0).
3. El cuidado postoperatorio
   1. Vigilar el animal hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Casa del animal por separado después de la cirugía.
   2. administrar carprofen por vía subcutánea para la analgesia (5 mg / kg) una vez al día durante 4 días.
   3. Añadir antibióticos orales profilácticos (Enrofloxin, 5 mg / kg) al agua de bebida durante 7 días después de la cirugía.
   4. Aplicar una pomada antiinflamatoria a los sitios de incisión en la piel para reducir la irritación durante los primeros 7 días después de la cirugía.

3. Llevar a cabo ERG y PEV Grabaciones en ratas conscientes

1. Oscura adaptación de los animales durante 12 horas antes de grabaciones ERG y PEV
2. Llevar a cabo todas las manipulaciones experimentales bajo una iluminación tenue rojo (17,4 cd.m ^-2, λ _max = 600 nm)
3. Aplicar anestesia tópica (0,5% proximetacaína) y la dilatación (0,5% tropicamida) cae a la córnea.
4. Guiar el roedor consciente en un hecho a medida, lo detiene clara.
   Nota: La longitud de este tubo de plástico se puede ajustar para adaptarse a diferentes ratas de tamaño con el diámetro total fija en 60 mm. El extremo delantero del dispositivo se estrecha para reducir al mínimo la cabeza movimiento y contiene perforaciones para permitir la respiración normal. Este frente cónico permite la alineación y la estabilización de la cabeza y los ojos de la rata a la apertura de la esfera Ganzfeld. Tenga en cuenta que el roedor se ha aclimatado a la inmovilización (3 a 5 ocasiones) antes de la cirugía.
5. Coloque el roedor en frente de la taza Ganzfeld con los ojos alineados con la abertura de la taza.
6. Encienda el transmisor de mora pasando un imán dentro de ~ 5 cm del transmisor. Compruebe que el transmisor está activado por el control de la luz LED de estado en la base del receptor.
7. Recoger señales a través de una gama de energías luminosas (es decir, -5,6 a 1,52 log cd.sm ^-2) como se describió anteriormente ^21. En pocas palabras, más señales de promedio en los niveles de conmutación de luces (~ 80 repeticiones) y menos en las energías más brillante luminosos (~ 1 repetición). Poco a poco, alargar el intervalo inter de 1 a 180 segundos desde más tenue que el nivel de luz más brillante.
8. Para aislar la varilla ERGy la respuesta de los conos utilizan un paradigma de doble flash de ^8. Por ejemplo, iniciar dos destellos en cd.sm 1.52 ^-2 log con un intervalo de 500 ms entre estímulos en el medio.
9. Para grabar señales VEP, una media de 20 repeticiones en las energías más brillante luminosos (es decir, 1,52 log cd.sm ^-2, 5 segundos de intervalo entre estímulos).
10. Para evaluar la estabilidad del implante, que se evalúa por la variabilidad de la señal en el tiempo, llevar a cabo ERG y PEV grabaciones 7, 10, 14, 21 y 28 días después de la cirugía.
11. Siguiendo período experimental, la eutanasia a las ratas mediante la inyección intracardiaca de pentobarbiturate (1,5 ml / kg) después de ketamina: xilazina la anestesia (12: 1 mg / kg).

Resultados

La respuesta de los fotorreceptores se analiza mediante el ajuste de una gaussiana retrasado al borde de ataque de la rama descendente inicial de la respuesta ERG en las 2 últimas energías luminosas (1,20, 1,52 csm registro ^-2) para cada animal, basándose en el modelo de Lamb y Pugh ^22, formulada por la capilla y Birch ^23. Esta fórmula devuelve una amplitud y un parámetro de sensibilidad, (Figura 1C y 1D, respectivam...

Discusión

Debido a la naturaleza mínimamente invasiva de la electrofisiología visual, grabaciones ERG y PEV en pacientes humanos se llevan a cabo en condiciones conscientes y sólo requieren el uso de anestésicos tópicos para la colocación del electrodo. Por el contrario, la electrofisiología visual en modelos animales se lleva a cabo bajo anestesia general convencional para permitir la colocación de electrodos estable mediante la eliminación de los movimientos oculares y corporales voluntarias. Sin embargo, los anestési...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioamplifier	ADInstruments	ML 135	Amplifies ERG and VEP signals
Carboxymethylcellulose sodium 1.0%	Allergan	CAS 0009000-11-7	Maintain corneal hydration during surgery
Carprofen 0.5%	Pfizer Animal Health Group	CAS 53716-49-7	Post-surgery analgesia, given with injectable saline for fluid replenishment
Chlorhexadine 0.5%	Orion Laboratories	27411, 80085	Disinfection of surgical instrument
Cyanoacrylate gel activator	RS components	473-439	Quickly dries cyanoacrylate gel
Cyanocrylate gel	RS components	473-423	Fix stainless screws to skull
Dental burr	Storz Instruments, Bausch and Lomb	E0824A	Miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws
Drill	Bosch	Dremel 300 series	Automatic drill for trepanning
Enrofloxin	Troy Laboratories		Prophylactic antibiotic post surgey
Ganzfeld integrating sphere	Photometric Solutions International		Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size
Gauze swabs	Multigate Medical Products Pty Ltd	57-100B	Dries surgical incision and exposed skull surface during surgery
Isoflurane 99.9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery
Kenacomb ointment	Aspen Pharma Pty Ltd		To reduce skin irritation and itching after surgery
Luxeon LEDs	Phillips Lighting Co.		For light stimulation, twenty 5 W and one 1 W LEDs, controlled by Scope software
Needle (macrosurgery)	World Precision Instruments	501959	for suturing abdominal and head surgery, used with 3 - 0 suture, eye needle, cutting edge 5/16 circle Size 1, 15 mm
Needle holder (macrosurgery)	World Precision Instruments	500224	To hold needle during abdominal and head surgery
Needle holder (microsurgery)	World Precision Instruments	555419NT	To hold needle during ocular surgery
Optiva catheter	Smiths Medical International LTD	16 or 21 G	Guide corneal active electrodes from skull to conjunctiva
Povidone iodine 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml
Powerlab data acquisition system	ADInstruments	ML 785	Acquire signal from telemetry transmitter, paired to telemetry data converter
Proxymetacaine 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 5875-06-9	Topical ocular analgesia
Restrainer	cutom made		Front of the restrainer is tapered to minimize head movement, length can be adjusted to accommodate different rat length, overall diameter is 60 mm.
Scapel blade	R.G. Medical Supplies	SNSM0206	For surgical incision
Scissors (macrosurgery)	World Precision Instruments	501225	for cutting tissue on the abodmen and forhead
Scissors (microsurgery)	World Precision Instruments	501232	To dissect the conjunctiva for electrode attachment
Scope Software	ADInstruments	version 3.7.6	Simultaneously triggers the stimulus via the ADI Powerlab system and collects data
Shaver	Oster	Golden A5	Shave fur from surgical areas
Stainless streel screws	MicroFasteners	L001.003CS304	0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length
Stereotaxic frame	David Kopf	Model 900	A small animal stereotaxic instrument for locating the implantation landmarks on the skull
Surgical drape	Vital Medical Supplies	GM29-612EE	Ensure sterile enviornment during surgery
Suture (macrosurgery)	Ninbo medical needles	3-0	for suturing abdominal and head surgery, sterile silk braided, 60 cm
Suture needle (microsurgery)	Ninbo medical needles	8-0 or 9-0	for ocular surgery including, suturing electrode to sclera and closing conjunctival wound, nylon suture, 3/8 circle 1 × 5, 30 cm
Telemetry data converter	DataSciences International	R08	allows telemetry signal to interface with data collection software
Telemetry Data Exchange Matrix	DataSciences International		Gathers data from transmitters, pair with receiver
Telemetry data receiver	DataSciences International	RPC-1	Receives telemetry data from transmitter
Telemetry transmitter	DataSciences International	F50-EEE	3 channel telemetry transmitter
Tropicamide 0.5%	Alcon Laboratories		Iris dilation
Tweezers (macrosurgery)	World Precision Instruments	500092	Manipulate tissues during abdominal and head surgery
Tweezers (microsurgery)	World Precision Instruments	500342	Manipulate tissues during ocular surgery