La detección de las proteínas de unión a ARN por<em&gt; In Vitro</em&gt; ARN desplegable de adipocitos Cultura

Resumen

Un protocolo desplegable ARN se optimiza aquí para la detección de interacciones entre proteínas de unión a ARN (prácticas comerciales restrictivas) y no codificante, así como los ARN de codificación. Un fragmento de ARN de receptor de andrógenos (AR) se utilizó como un ejemplo para demostrar cómo recuperar su RBP de lystate de adipocitos marrones primarios.

Resumen

proteínas de unión a ARN (prácticas comerciales restrictivas) están emergiendo como una capa de regulación en el desarrollo y la función del tejido adiposo. Prácticas comerciales restrictivas juegan un papel clave en la regulación de la expresión génica a nivel posttranscriptional al afectar la eficiencia de la estabilidad y de la traducción de ARNm diana. técnica desplegable RNA ha sido ampliamente utilizado para estudiar la interacción de ARN-proteína, que es necesaria para dilucidar el mecanismo de la función de las prácticas comerciales restrictivas ", así como largos ARN no codificante" (lncRNAs) subyacente. Sin embargo, la alta abundancia de lípidos en los adipocitos plantea un desafío técnico en la realización de este experimento. Aquí un protocolo desplegable ARN detallada está optimizado para el cultivo de adipocitos primaria. Un fragmento de ARN a partir de (AR) 3 'no traducida del receptor de andrógenos (3'UTR) que contiene un elementwas adenilato-uridylate ricos utilizados como un ejemplo para demostrar cómo recuperar su socio RBP, proteínas Hur, de lystate adipocito. El método descrito aquí se puede aplicar para detectar las interacciones entrePrácticas comerciales restrictivas y ARN no codificantes, así como entre las prácticas comerciales restrictivas y ARN de codificación.

Introducción

Prácticas comerciales restrictivas son proteínas que se unen al ARN de doble o de cadena sencilla en las células y participan en la formación de complejos de ARN-proteína. Las prácticas comerciales restrictivas pueden unir una variedad de especies de ARN, incluyendo ARN no codificantes de ARNm y largos (lncRNAs), y ejercer su influencia a nivel post-transcripcional. Ambas prácticas comerciales restrictivas y lncRNAs están surgiendo como nuevos reguladores en el desarrollo adiposo y funcionan ^1,2,3. Para entender el mecanismo de RBP- y regulación lncRNA mediada de vías celulares, a menudo es necesario para detectar la interacción entre una molécula de ARN específico y una o varias prácticas comerciales restrictivas, y, a veces, para identificar el espectro completo de proteínas asociados de un ARN transcripción. Sin embargo, el experimento puede ser difícil debido al alto contenido de lípidos en los adipocitos. El protocolo desplegable RNA descrito aquí se puede emplear para recuperar los compañeros de la proteína de un ARN específico de los lisados ​​de adipocitos de cultivos primarios ^4,5.

Justificación de este protoCol se resume de la siguiente manera. Un cebo de ARN es transcrito in vitro a partir de un molde de ADN, marcado con biotina y conjugado a perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina ^4. El cebo de ARN se incuba con lisados ​​celulares para permitir la formación de complejos de ARN-proteína, que se extraen posteriormente hacia abajo en un soporte magnético. Más específicamente, el protocolo desplegable RNA describe a continuación utilizar un fragmento de ARN de AR 3'UTR como el cebo para recuperar proteína Hur, un RBP expresado universalmente unido a 3'UTR de ARNm de ^6,7, de theadipocytelysate de cultivo primario. Para probar la especificidad de unión de este ensayo, un RNAas no relevantes así como perlas de estreptavidina en blanco se incluyen como control. Este protocolo es compatible con el Western Blot o espectrometría de masas (MS) para confirmar la captura de un RBP específica o para identificar el repertorio completo de las prácticas comerciales restrictivas capturados ^8, respectivamente.

Hay disponibles varias técnicas para estudiar la interacción proteína-ARNs. Para revelar los ARN unidos por un determinado RBP, RIP (ARN inmunoprecipitación) y CLIP (reticulación UV e inmunoprecipitación) se puede aplicar. Por el contrario, para identificar proteínas asociados de un determinado ARN, ARN desplegable, Chirp (cromatina aislamiento mediante la purificación del ARN), gráfico (análisis de hibridación de captura de dianas de ARN) y el PAR (purificación de ARN antisentido) se puede aplicar. En comparación con los posteriores, la técnica desplegable ARN requiere menos esfuerzo de configurar. Puede ser empleado para capturar proteínas in vitro e in vivo. El enfoque in vivo de ARN desplegable, que es técnicamente más difícil que su homólogo in vitro, preserva las interacciones ARN-proteína por reticulación en las células, capta los ARN aptamer etiquetado de interés a partir de células, y, posteriormente, detecta las prácticas comerciales restrictivas consolidados. ARN desplegable se puede utilizar para enriquecer las prácticas comerciales restrictivas bajas abundantes, y para aislar e identificar los complejos de proteínas y ARN que tienen diversos roles funcionales en el control de la regulación celular ^9,10 .

Protocolo

NOTA: El ARN de interés en el contexto de este estudio es un fragmento de AR 3'UTR.

1. Preparación de ARN marcado con biotina

1. Para obtener el ARN, amplificar T7-AR-oligo por PCR, seguido por la transcripción in vitro utilizando un kit comercial y siguiendo las instrucciones del fabricante ^11.
   NOTA: Los cebadores para PCR se enumeran en la Tabla 4: T7-AR-F y T7-AR-R.
2. Para el control de la unión no específica, amplificar una secuencia parcial del ADN de luciferasa de luciérnaga (FL) mediante PCR a partir psiCHECK-2 plásmido, seguido por la transcripción in vitro.
   NOTA: Los cebadores para PCR se enumeran en la Tabla 4: hluc (+) - T7-sonda-F y hluc (+) - sonda-R Tabla 4 Secuencias de molde y los cebadores para la amplificación por PCR...
3. Para un 50 l de reacción de PCR, mezclar 50 ng de ADN (oligo o plásmido), 4 dNTPs l (2,5 mM de cada dNTP individuales), 5 l de 10x tampón de reacción, 1 l 2,5 U / & #181; l de ADN polimerasa, 2 l 10 mM de cebador directo, 2 l 10 mM cebador inverso, y agua libre de nucleasa.
   1. Ejecutar la amplificación por PCR en un termociclador usando el siguiente programa. Paso 1: un ciclo de 95 ° C durante 2 min; Paso 2: 35 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 30 segundos (AR) o 60 segundos (FL); Paso 3: un ciclo de 72 ° C durante 10 min.
4. Sintetizar ARN con biotina utilizando un kit de transcripción in vitro siguiendo las instrucciones del fabricante ^11. En este experimento, utilizar productos de PCR como plantillas para la síntesis de ARN. Para una reacción de 20 l transcripción in vitro, mezclar 200 ng de ADN amplificado por PCR, 2 l de cada NTP individual, 1 l 10 mM de biotina-CTP, tampón de reacción de 2 l de 10x, y 2 l de ARN polimerasa de T7. Incubar la mezcla a 37 ° C durante 4 h.
5. Después de la transcripción in vitro, mezcla de reacción tratamiento con 1 l 2 U de DNasa / l a 37 & #176; C durante 15 minutos para degradar la plantilla de ADN. Por último, se diluye la ARN biotinilado a un volumen total de 60 l para la purificación posterior.
6. Se purifica ARN con biotina para eliminar las sales y los nucleótidos no incorporados mediante el uso de columnas de purificación siguiendo las instrucciones del fabricante ^12. Medir la concentración de ARN y se almacena a -80 ° C durante pull-down ensayos posteriores.
7. Para asegurar la estructura secundaria apropiada para el ARN de interés por la interacción de ARN-proteína, de calor 50 l de ARN biotinilado (50 pM) a 90 ° C durante 2 min, enfriar en hielo durante 2 min, a continuación, suministrar con 50 l de 2x tampón de la estructura del ARN (Tabla 3), y permitir el plegamiento del ARN a TA durante 30 min ^13,14.

2. Preparación de perlas de ARN conjugado

NOTA: Utilice un soporte magnético para la separación de las perlas magnéticas y sobrenadante.

1. Volver a suspender las perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina en el vial original mediante una breve vortexing siguiendo las instrucciones del fabricante. Transferir 150 l perlas se volvieron a suspender a un tubo de 1,5 ml. Se coloca el tubo en el imán durante 1 min. sobrenadante de descarte. Mantenga sedimento de perlas.
   NOTA: En los ensayos de pull-down de ARN, cuando una alícuota de perlas se volvieron a suspender a partir vial original, utilizar 50 perlas l para un ensayo seguido por el Western Blot, y 200 bolas l para un ensayo seguido de la EM.
2. Lavar perlas una vez por la re-suspensión de sedimento de perlas con 1 ml de recomendada por el fabricante 1x W & B tampón (Tabla 3) (unión y lavado), seguido de girar el tubo durante 5 minutos a temperatura ambiente en un rotador. sobrenadante de descarte. Mantenga sedimento de perlas.
3. Para inactivar la RNasa sobre perlas, perlas de lavar dos veces, cada vez por la re-suspensión de sedimento de perlas con 400 l de tampón A. El tampón A es una solución alcalina que contiene NaOH 0,1 M y 0,05 M NaCl (Tabla 3). Girar el tubo durante 2 min a temperatura ambiente en un rotador. sobrenadante de descarte. Mantenga sedimento de perlas.
4. Para eliminar NaOH a partir de perlas, perlas de lavar dos veces, cada vez por la re-suspensión de sedimento de perlas con 400 l de tampón B (Tabla 3), seguido por la rotación del tubo durante 2 minutos a temperatura ambiente en un rotador. sobrenadante de descarte. Mantenga sedimento de perlas.
5. Volver a suspender sedimento de perlas con 300 l 2 x W & B tampón, perlas dividida en partes iguales y transferir en tres tubos de 1,5 ml (100 granos l por tubo). Suministrar los tubos que contienen de talones con 100 l de RNasa libre de agua, 100 l con biotina ARN FL y 100 l biotina AR 3'UTR ARN, respectivamente.
6. Incubar cada mezcla de microesferas durante 1 hr a temperatura ambiente con rotación. Colocar los tubos en el imán durante 1 min. Desechar todo el sobrenadante. Mantener los gránulos de talón.
7. Lavar perlas dos veces, cada vez por la re-suspensión de cada sedimento de perlas con 400 l 1x W & B tampón, seguido de tubos giratorio durante 5 min a temperatura ambiente en un rotador.
8. Colocar los tubos en el imán durante 1 min. Desechar todo el sobrenadante. Resuspender cada grano pellet con 50 l de tampón de aislamiento nuclear (Tabla 3).

3. Aislamiento de preadipocitos y adipogénesis inducción

1. Como se ha descrito en publicaciones anteriores ^5, diseccionar preadipocitos de la almohadilla de grasa marrón interescapular (C57BL6 ratones de tipo salvaje, 3 semanas de edad).
2. Crecer y diferenciarse in vitro los preadipocitos ^5. Las células están listas para la aplicación aguas abajo 4-5 días después de la iniciación de la diferenciación.

4. Preparación de lisado celular de los adipocitos primarios

NOTA: Asegúrese de que todos los procedimientos de preparación de lisado celular se realizan en el hielo, y todos los tampones se enfrió en hielo. Pre-térmica del homogeneizadores de vidrio Dounce en hielo.

1. Crecer y diferenciarse preadipocitos en 15 cm platos ⁵ (ver sección 3.2). Cada plato proporciona células adecuadas para el ensayo desplegable uno ARN. En el día 4 o 5 días de diferenciación, medio de cultivo celular de descarte, y ce lavarLLS una vez con PBS 1x.
2. Para cosechar las células, añadir 10 a 15 ml de 1x PBS a las células, raspar para recoger las células en un tubo de 50 ml, y las células de pellets por centrifugación a 200 xg durante 5 min a TA. Desechar el sobrenadante mediante el uso de 1 ml pipeta.
3. Resuspender pellet de células en 2 ml de tampón hipotónico (Tabla 3), e incubar las células en hielo durante 15 min. La transferencia de células a un homogeneizador de vidrio Dounce de 15 ml, y las células de cizalla mecánicamente en hielo con 20 golpes.
4. Pellets núcleos de las células por centrifugación a 3.300 xg durante 15 min a 4 ° C. Mantenga pellets núcleos en hielo para su uso posterior (ver sección 4.6). Transferir el sobrenadante a tubos de 1,5 ml, añadir 3M KCl al sobrenadante para obtener una concentración final de 150 mM, y centrifugado a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
5. Después de la centrifugación, retirar con cuidado lipidlayeron la parte superior mediante el uso de una pipeta de 1 ml, y recoger el sobrenadante como el lisado celular citoplasmática.
6. Resuspender pellet núcleos (ver sección 4.4) en 1 ml de tampón de aislamiento nuclear. Tnúcleos RANSFERENCIA a un homogeneizador de vidrio Dounce de 15 ml usando una pipeta de 1 ml, y los núcleos de cizalla mecánica sobre hielo con 100 golpes. Sedimentar los restos nucleares por centrifugación a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C, y recoger el sobrenadante como el lisado celular nuclear.
7. O bien combinar los lisados ​​celulares nucleares y citoplasmáticos, o utilizar cada fracción por separado, para su aplicación desplegable aguas abajo. En este experimento de demostración, estas dos fracciones de lisado de células se combinaron a una relación en volumen de 1: 1.
8. Añadir inhibidor de RNasa a este lisado celular no fraccionada para obtener una concentración final de 0,5 U / l. Destinará 100 l de lisado celular como control de entrada para el Western Blot ^15.

5. encuadernación y elución de RBP

1. lisado de células de Split en tres alícuotas iguales (lisado de células de 1 ml en un tubo de 1,5 ml), e incubar con blanco, FL RNA-conjugado y perlas de AR 3'UTR ARN-conjugados (véase la sección 2.8), respectivamente, durante 3 horas a 4 ° docon la rotación.
2. Colocar los tubos en el imán durante 1 min. Recoger el sobrenadante usando una pipeta de 1 ml, seguido de aislamiento de ARN a partir del sobrenadante para confirmar RNA integralidad. Aislar el ARN mediante el uso de una solución de tiocianato de guanidinio-fenol ácido siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla 2). Evaluar la integridad de ARN mediante el análisis de 28S y 18S subunidades de ARN ribosómico. Mantener los gránulos de bolas en hielo.
3. Lavar las perlas magnéticas seis veces, cada vez por resuspensión cada sedimento de perlas con 1 ml de tampón de aislamiento nuclear que contiene 40 U de RNasa inhibidor y 0,25% de Igepal, seguido de tubos giratorio para 2 min a temperatura ambiente en un rotador. Utilice un soporte magnético para la separación de las perlas magnéticas y sobrenadante. Desechar todo el sobrenadante. Mantener los gránulos de bolas en hielo.
4. Utilice los pasos siguientes para eluir los complejos de ARN-proteína de los granos para el Western Blot. En primer lugar, volver a suspender cada sedimento de perlas en 75 l de tampón de aislamiento nuclear; a continuación, se añaden 25 l de 4x western blot carga buffer (que contiene SDS) para obtener un volumen total de 100 l. Finalmente, hervir perlas en esta solución 100 l a 95 ° C durante 5 min.
   NOTA: Utilice los siguientes pasos para eluir los complejos de ARN-proteína de los granos para la EM. Paso 1: resuspender cada sedimento de perlas en 100 l de tampón de elución (Tabla 3); PASO 2: incubar muestras de perlas durante 2-3 horas a temperatura ambiente con rotación; PASO 3: centrífuga y recoger el sobrenadante que contiene proteína; PASO 4: concentrar soluciones de proteínas de 20-30 l antes de su presentación para la EM.
5. Centrifugar cada 100 l de muestra de perlas a 12.000 xg durante 30 segundos a 4 ° C, y recoger el líquido sobrenadante. Alícuota de sobrenadante de 15 l para el análisis de western blot (ver sección 6.1 y 6.2). Sonda de la membrana resultante con el anticuerpo monoclonal Hur ratón diluido (dilución 1: 1000), durante la noche.

6. Transferencia Western para la verificación de las prácticas comerciales restrictivas

1. Las prácticas comerciales restrictivas separadas por SDS-PAGE utilizando técnicas estándar.
2. realizar nospopa secante utilizando técnicas estándar mediante el sondeo de las prácticas comerciales restrictivas asociados con el ARN de interés.
   NOTA: En este experimento de demostración, se utilizó el anticuerpo monoclonal de ratón Hur para la inmunodetección de la proteína Hur.
3. Incubar la membrana resultante con el anticuerpo Hur diluido (dilución 1: 1000) en 5% w / v de leche en polvo sin grasa, 1x TBS, 0,1% Tween - 20 al 4 ° C con agitación suave, durante la noche. Lavar la membrana tres veces con 1x TBST. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario (de cabra anti-IgG de ratón-HRP) a temperatura ambiente durante 1 hr. membrana Wash. Desarrollar y señal de grabación.

Resultados

En este experimento de demostración, un fragmento de ARN AR se utilizó como cebo para capturar su proteína de unión Hur. Tanto un ARN cebo FL que no es relevante para la proteína Hur, y una alícuota de perlas de estreptavidina en blanco no conjugados sirvieron como controles negativos. interacciones ARN-proteína puede ocurrir ya sea en el núcleo o citoplasma, y ​​este protocolo desplegable se puede aplicar a total o fraccionado lisados ​​celulares (citoplásmicos o nuclea...

Discusión

lncRNAs y las prácticas comerciales restrictivas tienen un papel vital en la salud y la enfermedad, sin embargo los mecanismos moleculares de estas moléculas son poco conocidos. Identificación de proteínas que interactúan con moléculas lncRNA es un paso clave para dilucidar los mecanismos de regulación. El enriquecimiento de las prácticas comerciales restrictivas por el sistema de ensayo desplegable ARN se basa en la captura en solución de interactuar complejo de manera que las proteínas de un lisado de célul...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Major materials used in this study.
MEGAscript kit	Ambion
Biotin-14-CTP	Invitrogen
NucAway spin columns	Ambion
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen
HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)	Santa Cruz Biotechnology
Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)	Santa Cruz Biotechnology
Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)	HyClone
Phosphate Buffer Saline (1×PBS)	HyClone
RNase inhibitor	Bioline
Protease inhibitor	Sigma
Pfu Turbo DNA polymerase	Agilent Technologies
TRIsure	Bioline
Name	Company	Catalog Number	Comments
Major equipment used in this study.
Sorvall Legend Micro 21R centrifuge	Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R centrifuge	Thermo Scientific
Bio-Rad T100 thermal cycler	Bio-Rad
Nanodrop 2000	Thermo Scientific
BOECO rotator Multi Bio RS-24	BOECO,Germany
Protein gel electrophoresis and blotting apparatus	Bio-Rad
DynaMag-2 magnet	Life Technologies