Las técnicas para la Evolución de la robusta levaduras que fermentan la pentosa para la bioconversión de lignocelulosa en etanol

Resumen

Técnicas de evolución y de aislamiento de adaptación se describen y se demostraron para producir derivados de la cepa Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 que son capaces de consumir rápidamente azúcares hexosa y pentosa mixtos en enzima sacarificadas hidrolizados undetoxified y acumular más de 40 g / L de etanol.

Resumen

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.

Introducción

Se estima que 1,3 millones de toneladas secas anuales de biomasa lignocelulósica podrían apoyar la producción de etanol y permitir que los EE.UU. para reducir su consumo de petróleo en un 30%. ¹ Aunque la biomasa vegetal mezclas de los rendimientos de hidrólisis de azúcar ricos en glucosa y xilosa, inhibidores de la fermentación son generados por el pretratamiento químico necesario para descomponer hemicelulosa y celulosa para exponer ataque enzimático. ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural y (HMF) se cree que son componentes clave entre muchos inhibidores que se forman durante el pretratamiento. Con el fin de mover la industria del etanol lignocelulósico hacia adelante, la investigación y los procedimientos que permiten la evolución de cepas de levadura capaces de sobrevivir y eficaz funcionamiento de usar tanto hexosa y pentosa en presencia de tales compuestos inhibidores son necesarios. Una debilidad adicional significativo de cepas de levaduras industriales tradicionales, tales como Saccharomyces cerevisiae, es la incapacidad de Fermen eficientet la xilosa disponibles en hidrolizados de biomasa vegetal.

Pichia stipitis tipo de cepa NRRL Y-7124 (CBS 5773), recientemente renombrado stipitis Scheffersomyces, es una levadura de fermentación de pentosa nativo que es bien conocido para fermentar la xilosa a etanol. ^2,3 La evolución de la cepa NRRL Y-7124 fue perseguido aquí ya que se ha documentado para tienen el mayor potencial de cepas de levaduras nativas para acumular etanol económicamente recuperables inferior o igual a 40 g / L con poco subproducto xilitol. ^4,5,6 En los medios de comunicación óptima, S. cepa stipitis NRRL Y-7124 produce 70 g / L de etanol en 40 hr (1.75 g / L / hr) con un rendimiento de 0,41 ± 0,06 g / g en cultivos de alta densidad celular (células 6 g / L). ^7,8 Resistencia a los inhibidores de la fermentación del etanol, furfural y HMF también se ha informado, ⁹ y S. stipitis ha sido clasificada entre las levaduras que fermentan la pentosa nativas más prometedoras disponibles para el etanol Productio escala comercialn a partir de lignocelulosa. ¹⁰ Nuestro objetivo era aplicar diversos hidrolizados lignocelulósicos undetoxified y presiones de selección etanol para forzar la evolución hacia una más sólida derivada de la cepa NRRL Y-7124 adecuado para aplicaciones industriales. La llave entre características mejoradas solicitados son más rápidas tasas de absorción de azúcar en hidrolizados de concentrados, reducida diauxy para la utilización de azúcar mezclado más eficiente y más altas tolerancias de etanol e inhibidores. La aplicación de S. stipitis de hidrolizados undetoxified fue un elemento clave de la investigación para eliminar el gasto operativo añadido asociado a los procesos de descontaminación de hidrolizados, tales como overliming.

Dos hidrolizados industrialmente prometedores se aplicaron para forzar la evolución:. Sacarificado enzima fibra de amoniaco expansión pretratados con hidrolizado de rastrojo de maíz (AFEX CSH) y diluir el licor Panicum virgatum hidrolizado ácido pretratados (PSGHL) ^11,12 tecnología de pretratamiento AFEX está siendo desarrollado paraminimizar la producción de inhibidores de la fermentación, mientras que el pretratamiento con ácido diluido representa la actual tecnología de bajo coste más comúnmente practicado para exponer la biomasa celulósica para la sacarificación enzimática. PSGHL es separable de la celulosa restante después del tratamiento previo y es característicamente rico en xilosa a partir de la hemicelulosa hidrolizada, pero bajo en glucosa. AFEX CSH y composiciones PSGHL difieren entre sí en aspectos clave que fueron explotadas para gestionar el proceso de la evolución. AFEX CSH es más bajo en aldehídos de furano y los inhibidores de ácido acético, pero más alta en aminoácidos y fuentes de nitrógeno de amoníaco en comparación con PSGHL (Tabla 1). PSGHL presenta el reto adicional de xilosa ser el azúcar predominante disponible. Por lo tanto PSGHL es apropiada para enriquecer específicamente para la mejora de la utilización de xilosa en hidrolizados, una debilidad prevenir el uso comercial de la levadura disponibles. Incluso entre las levaduras de fermentación de pentosa nativas, la dependencia de la xilo azúcar subóptimaSE para apoyar el crecimiento celular y la reparación se hace aún más difícil en los hidrolizados debido a una variedad de razones:. deficiencias de nutrientes, inhibidores causan un daño generalizado a la celda integridad estructural, y la interrupción de metabolismo debido a los desequilibrios redox ⁹ suplementación con nitrógeno, especialmente en la forma de aminoácidos, pueden representar un coste operativo importante para las fermentaciones. El impacto de la suplementación de nitrógeno sobre el cribado del aislamiento y la clasificación fue explorada con hidrolizados de P. virgatum.

La mejora de los individuos se enriquecieron en una población evoluciona el uso de múltiples presiones de selección dependen de la diversidad genética natural de la S. la población y las mutaciones stipitis inducida por la exposición a dos diversos hidrolizados, etanol o radiación UV. Presiones de selección se aplicaron en paralelo y en serie para explorar el progreso evolución de S. stipitis hacia derivados deseados capaces de crecer y fermentar de manera eficiente en hidrolizados(Figura 1). El cultivo repetitivo de las poblaciones funcionales en hidrolizados cada vez más desafiantes se llevó a cabo en microplacas el empleo de una serie de dilución de cualquiera de glucano CSH AFEX 12% o más preparado PGSHL a 20% de carga de sólidos. La aplicación de un crecimiento de etanol-desafió en xilosa en cultivo continuo mejorado aún más CSH adaptada poblaciones AFEX mediante el enriquecimiento de fenotipos que demuestran menor susceptibilidad a etanol represión de la utilización de xilosa. Esta última característica ha demostrado recientemente problemática de la utilización de pentosa por la cepa NRRL Y-7124 después de la fermentación de la glucosa. ⁸ Enriquecimiento en PSGHL se exploró junto a ampliar la funcionalidad hidrolizado.

Derivados mejorados putativa de S. stipitis NRRL Y-7124 fueron aisladas de cada fase del proceso de evolución dirigida mediante el enriquecimiento en condiciones de estrés y una dilución en placas para recoger colonias de las poblaciones de mayor prevalencia. en relación adimensionalíndices de rendimiento (RPI) se utilizaron para clasificar las cepas basado en el rendimiento general, donde se evaluó el comportamiento cinético de los diferentes tipos de hidrolizados y suplementos de nutrientes aplicados. Aunque los éxitos de diversos procedimientos de adaptación para mejorar la funcionalidad de S. stipitis en hidrolizados lignocelulósicos se han documentado anteriormente, las cepas que demuestran la producción de etanol económico en hidrolizados undetoxified no se ha informado anteriormente. ^13-17 Usando los procedimientos de evolución para ser visualizado en más detalle aquí, Slininger et al. ¹⁸ cepas que se mejoran significativamente durante desarrollaron la cepa parental NRRL y-7124 y son capaces de producir> 40 g / L de etanol en AFEX CSH y la enzima hidrolizado sacarificado Panicum virgatum (SGH) debidamente complementado con fuentes de nitrógeno. Estas nuevas cepas son de interés para el futuro desarrollo de la lignocelulosa a la industria del etanol y como sujetos de la genómica estudios adicionales edificioen los de la cepa previamente secuenciados NRRL Y-11545. ¹⁹ Un estudio de la genómica de los mejores cepas producidas durante las diversas fases de la evolución esquematiza en la figura 1 sería dilucidar la historia de los cambios genéticos que ocurrieron durante el desarrollo como un preludio a seguir investigando la mejora de cepas.

Protocolo

1. Preparar los materiales de partida y Equipo para ensayos

1. Preparar hidrolizados utilizando 18 a 20% de peso seco de biomasa inicial en la reacción de tratamiento previo para el uso en la evolución, el aislamiento y procedimientos de clasificación. Ver Slininger et al. 2015 ¹⁸ para los métodos detallados para preparar AFEX CSH, PSGHL, y SGH con suplementos de nitrógeno N1 o N2 utilizados en la evolución, el aislamiento o la clasificación. Véase la Tabla 1 para la composición de cada tipo de hidrolizado.
   NOTA: fortificaciones de nitrógeno de SGH fueron designados como SGH-N1 o SGH-N2 definen como sigue: SGH-N1 = SGH fortificado a 42: carbono 1 molar a la proporción de nitrógeno (C: N) con fuentes de nitrógeno, incluyendo urea, amino libre de la vitamina ácidos de caseína, D, L-triptófano, L-cisteína, y vitaminas de fuentes definidas (tal que ~ 15% de nitrógeno molar N es nitrógeno amino primario (PAN) y ~ 85% de N es de urea); SGH-N2 = SGH fortificada a 37: 1 C: N con urea y harina de soya como el más bajo costo fuente comercial of aminoácidos y vitaminas, proporcionando ~ 12% del N de la sartén y 88% en forma de urea.
2. Adquirir un cultivo liofilizado de la cepa madre, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) de la Colección de Cultivos ARS (Centro Nacional de Investigación de Utilización Agrícola en Peoria, Illinois), y preparar los cultivos de glicerol como se indica. Mantener los cultivos madre de la levadura de los padres y sus derivados en el 10% de glicerol a -80 ° C.
   1. stocks de glicerol a la racha de dextrosa de levadura de malta peptona (YM) placas de agar (/ l de extracto de levadura 3 g, 3 g / L de extracto de malta, 5 g / l de peptona, 10 g / l de dextrosa, 20 g / l de agar) e incubar 48- 72 horas a 25 ° C. ⁸ placas desarrollados se puede almacenar hasta por una semana a 4 ° C antes de su uso inóculos precultivo como líquido.
3. Preparar definidas óptimas Medio (ODM), un medio sintético compatible con los procedimientos de formulación industriales ²⁰ que fue desarrollado previamente para la conversión óptima de la xilosa a etanol por el padre strain Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. ⁷ Utilice el medio definido en todos los cultivos previos y culturas a los bioensayos de rendimiento de fermentación y también para el etanol desafiado, la evolución del cultivo continuo xilosa alimentado. Composición del ODM está listada como referencia en la Tabla 2.
4. Como se ha descrito anteriormente, ¹⁸ analizar la biomasa celular usando un espectrofotómetro de lectura cuvette- o micro-placa, según sea apropiado, para medir la absorbancia de cultivo a 620 nm (A _620). Cuantificar los azúcares, etanol, furfural, hidroximetilfurfural (HMF), y ácido acético en las muestras de cultivo utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o la determinación enzimática robótico de la glucosa y la xilosa para un mayor rendimiento.

2. Enriquecer Derivados robustas durante la transferencia serie en AFEX CSH

1. Inocular un cultivo previo de la cepa NRRL Y-7124. La transferencia de células de agar YM a 75 ml ODM + 150 g / L de xilosa para mantener la capacidad de crecer bajo osmotic estrés. Incubar precultivos en matraces de 125 ml cerrados con la esponja de silicona tapones de 24 horas a 25 ° C con agitación (150 rpm, 1 "órbita).
2. Descongelar las alícuotas congeladas de 6-12% glucano CSH AFEX en agua fría para el uso. Ajustar el pH a 5, si es necesario y el filtro de esterilizar antes de preparar una serie de diluciones en microplacas de 96 pocillos.
3. Llenar microplacas con 50 l por pocillo y 8 pocillos por cada dilución hidrolizado, a continuación, inocular con unos pocos microlitros de precultivo por pocillo para permitir una absorbancia inicial (620 nm) A ₆₂₀ ≥0.1. Incubar las placas estáticamente 24-48 horas a 25 ° C en una caja de plástico con una toalla de papel húmeda para la humedad.
4. El uso de la dilución hidrolizado más concentrada que visiblemente creció a A _620> 1, la transferencia de 1-5 l a cada pocillo de una nueva serie de dilución hidrolizado para lograr inicial A ₆₂₀ ≥0.1.
5. Monitor de cultivo de crecimiento A ₆₂₀ en microplacas con un espectrofotómetro. Una serie de dilución Ser sin inocularVes como un control y blanco. tapas de placas se dejan en durante la supervisión para evitar la contaminación, y las lecturas de ajustarse en consecuencia.
6. Preparar las existencias de glicerol de las culturas de adaptación regularmente para el posterior aislamiento de cepas mejoradas o para su uso en reinoculating la continua serie de dilución hidrolizado. Para preparar las existencias, piscina cuatro pozos (200 l) de la mayor concentración de hidrolizado colonizado. Mezclar 1: 1 con 20% de glicerol estéril en crioviales, para congelar las células en 10% de glicerol a -80 ° C.
7. Repita los pasos 2.3-2.6 hasta que el crecimiento en el 12% de glucano CSH AFEX es constantemente visible a las 24 h.

3. Aislar la célula individual Derivados tolerantes después del enriquecimiento en AFEX CSH

1. Streak seleccionado existencias de glicerol de las culturas de adaptación a agar YM, y las rayas de uso para inocular 50 l de 3% o 6% glucano AFEX CSH (pH 5) en cada uno de tres pocillos de la microplaca (inicial A ₆₂₀ ~ 0,1). Incubar las microplacas de 24 horas como en el paso 2.3. réplica de la piscinate colonizada pozos en la fuerza más alta hidrolizado con un fuerte crecimiento, y la placa de dilución para YM o 6% de agar glucano CSH AFEX. Preparar el último como una mezcla 1: 1 de filtro esterilizado 12% glucano CSH AFEX con solución / L agar 30 g en autoclave caliente.
2. Elige 5 colonias individuales desde el más alto crecimiento que muestra la placa de dilución después de la incubación de 24-48 horas a 25 ° C para congelar como cultivos de glicerol. Racha de cada colonia a una placa YM. Incubar 24 horas. Con un asa estéril, transferir un desarrollado racha de células a un pequeño volumen de 10% de glicerol, se mezcla la suspensión de células, y distribuir a 2-3 crioviales para la congelación a -80 ° C.

4. Evaluar Rendimiento de AFEX CSH Derivados tolerantes En comparación con los Padres

1. Aisla prueba en simples culturas 6% glucano AFEX CSH lotes.
   1. La transferencia de células a partir de las 48 hr placas estriadas de las existencias de glicerol de tampón fosfato potásico pH 7 (0,4 mM) para preparar suspensiones de células con A = ₆₂₀ 10. Uso 1 l decada suspensión para inocular cada uno de los cuatro pozos de 50 l 3% de hidrolizado de glucano a rubrique A ₆₂₀ = 0,2. Incubar las microplacas de 24 horas como en el paso 2.3. Preparar el glucano CSH 3% AFEX a pH 5 mediante la dilución de 12% de glucano CSH AFEX 1: 3 con agua estéril.
   2. Transferencia de dos pozos de la microplaca de 24 horas para inocular 25 ml de cultivos previos pH 5 al 12% glucano CSH AFEX utilizados en el 50% de su fuerza. Incubar precultivos en matraces de 50 ml con cierres de esponja de silicona para 24 horas a 25 ° C, ~ 150 rpm (1 "órbita) Preparar el medio resistencia 12% glucano CSH AFEX diluyendo el hidrolizado de 1:. 1 con agua estéril.
   3. Use la mitad de intensidad de cultivos previos de hidrolizado para inocular 25 ml de cultivos de crecimiento similares a la administración inicial de ₆₂₀ A = 0,1. Se incuban los cultivos de crecimiento que el anterior (4.1.2) y la muestra diaria (0,2 ml). Acumulaciones de monitor de biomasa (A ₆₂₀₎ y las concentraciones de azúcares y productos de fermentación (HPLC).
2. Alternativamente, repitch (es decir, la cosecha y la reuse) poblaciones de 6% glucano de levadura AFEX CSH-crecido de ensayos con el 8% de cultivos por lotes de hidrolizado de glucano, como se ha descrito anteriormente. ¹⁸
3. Alternativamente, otras poblaciones de ensayo de glucano culturas CSH AFEX 6% repitched por la alimentación con 12% de hidrolizado de glucano, tal como se describe anteriormente. ¹⁸
4. La prueba de demora diauxic de los aislamientos en cultivos discontinuos de ODM con azúcares mixtos.
   1. Inocular cultivos previos de 75 ODM ml con 150 g / L de xilosa en matraces de 125 ml con cierres de esponja de silicona mediante transferencia de lazo de rayas glicerol YM. Incubar 24 horas como en el paso 2.1.
   2. Utilice precultivos para inocular cultivos 75 ml de ensayo similares con ODM que contiene 75 g / L de glucosa y 75 g / L de xilosa a un pH de 6,5. Agitar matraces a 25 ° C, 150 rpm. Muestra todos los días.
   3. Alternativamente, probar el impacto de ácido / L acético 0-15 g en diauxy durante la fermentación de la glucosa y xilosa mediante el uso de un protocolo similar, excepto pH inicial se fija en 6,0 ± 0,2 en cultivos de ensayo para mantener el pH 6-7 duanillo consumo de ácido acético, como se describió anteriormente. ¹⁸

5. Aplicar cultivo continuo seleccionar para la utilización de xilosa etanol-desafió

1. Preparar ODM como el medio de alimentación cultivo continuo con 60-100 g / L de xilosa, 20-50 g / L de etanol a pH 6,3 ± 0,2. Elija combinaciones de xilosa y etanol para simular la fermentación parcial de 150 g / L de xilosa, suponiendo un rendimiento potencial de ~ 0,5 g de etanol / g de xilosa, y para acomodar el potencial de 50 a 70 g / L de etanol que se produzca. ⁸
2. Para preparar el inóculo de cultivo continuo, la transferencia de un representante AFEX colonia CSH-tolerante (análoga a la colonia 5 en el ejemplo, la Figura 1) por bucle de una placa de YM 48 hr a 75 ml de la ODM libre de etanol (100 g / L de xilosa, en este caso) en matraces de 125 ml. Se incuba a 25 ° C, 150 rpm (1 "órbita) durante 24 horas. Elige la concentración ODM xilosa cultivo previo para que coincida con la del cultivo continuo de volumen que sostiene inicial.
3. Inocular un volumen que sostiene cultivo continuo de ODM a pH 6,3 ± 0,2 que tiene 100 g / L de xilosa + 20 g / L de etanol con ~ 5-10 ml de un concentrado de pre-cultivo de un aislado AFEX CSH-tolerante (análoga a la colonia 5, la Figura 1 ) para obtener 100 ml en el punto inicial a ₆₂₀ ~ 0,5. Mantener la cultura que sostiene volumen (V _R), a 25 ° C en un matraz de agitación con camisa 100 ml se agitó a 200 rpm y equipado con electrodo de pH esterilizable, controlador de pH y baño de agua circulante de temperatura controlada.
4. En un principio, ya que el crecimiento celular será lento debido a la exposición al etanol, configurar el medio de alimentación para dosificar el uso de una bomba accionada por el pH. Establecer la bomba para alimentar a pH-6,3 ODM con 100 g / L de xilosa y 50 g / L de etanol cuando la fermentación del cultivo deja caer el pH a 5,4, deteniendo así aún más la caída del pH. Mantener el volumen a 100 ml con una bomba de efluente continuamente rozando la superficie de cultivo. En consecuencia, la concentración de etanol aumenta con el metabolismo y la alimentación continua.
5. Medir efluente y extraer muestras (1-2 ml) de cultivos continuos de cada 48 a 72 horas para el análisis de la concentración de células viables, los productos y sustratos, como se describió previamente. ¹⁸ Para encontrar la concentración de células viables, hacer diluciones 1:10 en serie de muestras en tampón (véase 4.1.1) y la placa de propagación de las diluciones a agar YM (véase 1.2.1). Sobre la base de las tasas de recogida de efluente (Q), el cálculo de la tasa de dilución (D) (Q / V _R), y, en el ejemplo de S. stipitis, que variaba desde el 0 a la 0,01 h ^-1.
6. Guardar reservas de glicerina con regularidad mediante el aislamiento a partir de placas de viabilidad de las diluciones de muestras tamponadas formando 30-100 colonias, lo que representa colonos robustos más prevalentes en ese momento en el enriquecimiento. placas de inundación con ~ 5 ml de glicerol al 10% para permitir la preparación de crioviales duplicados. Para el mantenimiento o un respiro, detener el cultivo continuo y reinicie cuando sea necesario el uso de más reciente (resistente) de glicerol (s).
7. Para reiniciar, racha de los stock (s) de glicerol de la mayoríapoblaciones resistentes a agar YM y la transferencia de células de 24-48 hr por bucle para un pre-cultivo de ODM libre de etanol para la incubación como anteriormente. Inocular los 100 ml que sostienen volumen de ODM a rubrique A ₆₂₀ 0,5 usando un concentrado de la levadura precultivado, y permitir que el cultivo crezca de forma discontinua hasta la fase estacionaria antes de que se reinicie el flujo medio de alimentación.
8. Si los cultivos pueden crecer de manera constante a> 0,01 h ^-1 en ^{caso de} xilosa en la presencia de> 25 g / l de etanol, iniciar la alimentación continua de cultivo (ODM + 60 g / L de xilosa + etanol que van de 30 a 50 g / L) a un bajo ~ velocidad de dilución de 0,01 h ^-1 a los 100 ml de volumen que sostienen (inicialmente ODM + 60 g / L de xilosa + 20 g / L de etanol). Con el tiempo, elevar el etanol en la alimentación hacia 50 g / L. Capturar poblaciones avanzadas en reservas de glicerina.
   NOTA: El mantenimiento de la tasa de dilución baja permite la formación de una concentración celular lo suficientemente alto como para reducir la disponibilidad de oxígeno y el apoyo de fermentación.
9. Opcionalmente, aplicar ultra-violeta (UV) irradiatión mensual a glicerol poblaciones de valores utilizados para renovar la siembra cultivos continuos.
   1. Volver a suspender las colonias de glicerol vetas de valores en 10 ml de ODM (como en cultivos previos) con 60 g / L de xilosa, y poner en común todas las existencias en un solo frasco estéril. Aplicar la suspensión de células agrupadas en ~ 5 x 10 ⁸ células / ml viables para cubrir sólo las partes inferiores de 4-5 placas de Petri con 6 ml / placa. Para obtener la cobertura de 6 ml de una placa de Petri desechables estándar, dispensar 15 ml de superar la tensión superficial, y luego retire 9 ml.
   2. Exponer a cada placa de cultivo abierta a los rayos UV de la fuente de luz en una cabina de seguridad biológica. Ajustar el tiempo de exposición a rayos UV o la distancia para obtener el grado de destrucción deseada> 90%. Aquí, exponer durante 45 min a alrededor de 56 cm de la fuente.
   3. Diluir las suspensiones de células placa antes y después de la irradiación. grado de mortandad estimación basada en unidades formadoras de colonias. Para el S. stipitis ejemplo, la tasa de muerte fue de ~ 97%.
   4. La transferencia de los cultivos expuestos UV (24 a 30 ml) a una lámina-CoVEred matraz de 50 ml, y se incuba a 25 ° C y 150 rpm durante 24 horas para permitir que el pequeño porcentaje de células viables para repoblar a ~ 1 x 10 ⁸ S. viable stipitis células / ml. Al prevenir reactivaciones de fotos, la cubierta de aluminio conserva mutaciones mientras que los cultivos se incuban.
   5. Utilizar el cultivo mutagenizado repoblada para inocular cultivos continuos de ~ 1 x 10 ⁷ células viables / ml. Reinicie el ODM + 60 g / L de alimentación del medio xilosa en etanol enriquecida para continuar el proceso de selección.

6. Evaluar glicerol de poblaciones y determinar los que Mejora de xilosa fermentación en presencia de etanol

1. Streak selecciona cultivos stock de glicerol de agar YM como el primer paso en la pantalla para el mejor crecimiento y la fermentación de xilosa en la presencia de etanol.
2. Transferir cada población evolucionado a cribar de rayas de agar a 75 ml precultivos en ODM con 150 g / l de glucosa, y se incuban en matraces de 125 ml 96hr antes de su uso como inóculos para cultivos de ensayo. Las grandes poblaciones de glucosa-crecido requerirán la inducción de enzimas para la utilización de xilosa.
   1. Para probar la inducción, la cosecha de cada cultivo, suspender las células para 30 ml, inicial A ₆₂₀ de 40 en ODM 60 g / L de xilosa + 30-45 g / L de etanol, y se incuba a 25 ° C, 150 rpm (1 "órbita) en matraces de 50 ml con cierres de esponja de silicio. Dibuje muestras dos veces al día para el control de la absorción de xilosa por análisis de HPLC.
3. Alternativamente, como se describe en Slininger et al., ¹⁸ para evaluar el crecimiento en xilosa en la presencia de etanol, se preparan precultivos de cada población evolucionado por transferencia de bucle para 75 ml de ODM con 150 g / L de xilosa en matraces de 125 ml y se incuban 96 hr a 25 ° C, 150 rpm (1 "órbita). Se inoculan cultivos de ensayo a una baja inicial a ₆₂₀ de 0,1 en 25 ml de ODM + 60 g / L de xilosa + 30-45 g / L de etanol en matraces de 125 ml. Incubar frascos a 25 ° C, 300 rpm, "órbita 1 y la muestra.

7. Aislar colonias de una sola célula que utilizan xilosa en etanol PSGHL Cuando está presente

1. Basándose en los resultados de la etapa 6, seleccionar poblaciones de valores de glicerol que muestran capacidad superior para crecer en y fermentar la xilosa, en presencia de etanol. Utilice estos para placas de racha. Las placas del rayado se usan para preparar las suspensiones de células, tamponadas densas de A ₆₂₀ = 5. A continuación, las suspensiones de células se utilizaron para inocular cultivos previos en placas de 96 profundas así a A ₆₂₀ = 0,5. Sembrar 1 ml precultivos en PSGHL mezclaron 1: 1 con ODM + 50 g / L de xilosa (sin etanol). Incubar cultivos previos en 96 pocillos, placas de pocillos profundos con baja evaporación ventilación cubre durante 48 horas a 25 ° C, 400 rpm, 1 "órbita. Separar las diferentes poblaciones de glicerol de stock por pozos vacíos.
2. El uso de cada precultivo, se inoculan los dieciséis 1 ml replican culturas para rubrique a ₆₂₀ ~ 0,5 en 1: 1 PSGHL: ODM + 50 g / L de xilosa con 20, 30, o 40 g / l de etanol para enriquecer colonos tolerantes. Incubar cultu enriquecimientores de manera similar a precultivos.
3. Para cada una de glicerol de valores diferentes, cosechar los pocillos de cultivo con más alta concentración de etanol que permite el crecimiento y la xilosa uso. Placa de cada línea celular de agar YM para obtener colonias individuales para preservar prevalentes en glicerol. Recoger diez colonias por línea celular y consecutivas cada uno a una placa de agar YM para la preparación de glicerol.

8. enriquecer aún más robusta Evolved cepas durante la transferencia serie en PSGHL, como para AFEX CSH

1. Preparar pre-cultivos de NRRL Y-7124 (padre), AFEX CSH-tolerante evolucionó aislar y cultivo continuo evolucionó población con mayor capacidad de utilizar xilosa en la presencia de etanol. Inocular 75 ml de ODM + 150 g / L de xilosa por bucle de rayas stock de glicerol como se describió anteriormente (paso 2.1) para el proceso de adaptación hidrolizado de AFEX CSH.
2. Diluir PSGHL con agua para proporcionar una serie de concentraciones crecientes. Preparar un 96 pocillos micro-placa para cada una de las tres líneas celulares mediante el uso de cadadilución PSGHL para llenar 8 pocillos con 50 l. Utilice precultivo para inocular cada 50 l micro-cultura de la serie de dilución inicial de ₆₂₀ ~ Un 0,1-0,5.
   1. Continuar la evolución de la levadura en el aumento de los puntos fuertes de PSGHL usando el mismo procedimiento como la adaptación hidrolizado AFEX CSH detallado anteriormente (paso 2) hasta que los cultivos son capaces de crecer en el hidrolizado de fuerza completa en una proporción promedio de 14-d estable de? A ₆₂₀ por Δtime como transferencias de serie se siguieron cuatro meses adicionales.

9. Aislar colonias de células individuales en el PSGHL degradados con o sin etanol Challenge

1. Obtener de una sola célula aísla directamente de placas de adaptación finales PSGHL plena fuerza por dilución en placas de agar YM. Escoja diez grandes colonias para cada una de las tres líneas celulares y racha bar a placas YM para preparar stocks de glicerol como se ha descrito previamente (paso 3.2).
2. Opcionalmente, explorar los puntos de tiempo anteriores en elproceso de evolución mediante el aislamiento de las existencias de glicerol almacenadas de las tres líneas celulares.
   1. Inocular un cultivo previo para cada línea celular por bucle de stock de glicerol rayas e incubar 24 horas en 30 ml ODM + 50 g / L de xilosa (matraces de 50 ml, 25 ° C, 150 rpm).
   2. Células reto de cultivos previos al crecimiento de hidrolizado mediante la inoculación de 50 l de 50% PSGHL en pocillos de la microplaca a una inicial A ₆₂₀ ~ 0,2 e incubando estáticamente 48 h.
   3. Difundir 0,1 ml de cada cultivo en placas de agar enriquecido gradiente PSGHL que van de 0 a 50% de hidrolizado de fuerza (~ 300-400 entrega de células viables por placa), y recoger 10 colonias individuales por línea celular desde la zona más alta posible concentración hidrolizado del gradiente . ²¹ Streak recogió colonias de YM para la preparación de glicerol como en el paso 3.2.
   4. Como una alternativa al paso 9.2.3, en lugar de la inoculación de las placas de agar de gradiente, inocular los pocillos de 96 pocillos de micro-placas para inicial A ₆₂₀ ~ 0,2, where los pozos están diseñados para contener una gama de concentraciones de hidrolizado de 50 a 100% de fuerza y ​​etanol de 10 a 40 g / L. En este caso, el desarrollo de micro-placas de 72 a 96 hr y de otra manera que en el paso 2.3. Aislar diez colonias individuales de los pozos de las combinaciones hidrolizado de etanol más duras que muestran el crecimiento a través de una dilución en placas, y preparar reservas de glicerina como en el paso 3.2.

10. En una pantalla primaria, elimina aislamientos inferiores comparando y Clasificación Actuaciones en PSGHL en dos condiciones de nutrientes

1. Aplicar un alto rendimiento de pozo profundo pantalla plato de rendimiento PSGHL a la pantalla de cinco series de treinta aislamientos junto con NRRL Y-7124 padres y el aislado de AFEX CSH-tolerante (análoga a la colonia 5 del ejemplo de la evolución Figura 1) como controles para elegir seis mejores cepas (20%) de cada conjunto para pasar al nivel de escrutinio secundario (etapa 12).
2. Llevar a cabo la pantalla en placas de pocillos profundos llenos de 1 ml por pocillo y wi cubiertosth tapas de acero inoxidable con silicona negro bajo los sellos por evaporación. Sujetar todas las placas a la placa de la incubadora / agitador y operar a 25 ° C y 400 rpm (1 "órbita agitador). Diseño de todo pozo profundo placa de llenado patrones para permitir la separación de los diferentes aislados por los pozos abiertos.
3. Para empezar cultivos, recoger una capa de células de rayas glicerol preparados a partir de 30 aislamientos obtenidos como anteriormente (en los pasos 3, 7 y 9) a pocillos duplicados de ODM + 50 g / L de xilosa e incubar 48 h.
4. Como un medio de precultivo reto para aislamientos, preparar 50% PSGHL mezclando PSGHL 1: 1 con ODM + 10 g / l de glucosa + 50 g / L de xilosa. Para el cribado de 30 aislamientos y dos cepas de control, 2 placas con 2 pocillos por cada una de las 16 cepas, se llenan, dejando pocillos vacíos entre las diferentes cepas.
5. Para las culturas de desafío, la transferencia, un volumen de 50 l de ODM precultivosde (A ₆₂₀ ~ 10) a cada uno de dos pocillos de cultivo desafío PSGHL 50% para cada uno de los aislados y los controles para obtener una iniAl A ₆₂₀ ~ 0,5 e incubar 72 h.
6. Utilizar dos medios de prueba de diferente riqueza nutritiva para el cribado aísla: nutrientes 60% PSGHL + ODM; y el 75% nutrientes ODM + YM PSGHL +. Añadir nutrientes ODM (con exclusión de los azúcares) a la mitad de la fuerza de serie para utilizar ODM con 50 g / L de azúcar (paso 1.3). Como designado, añadir nutrientes YM (con exclusión de los azúcares) a la mitad de la fuerza global de 3 g / L de extracto de levadura, 3 g / L de extracto de malta, 5 g / L de peptona.
7. Se inoculan cultivos de ensayo mediante la transferencia de 50 l de 72 h 50% de desafío PSGHL pre-cultivos para inocular 1.000 l de rubrique a ₆₂₀ ~ 0,5 en cinco pozos profundos para cada uno de dos medios de prueba.
8. Muestra de cada aislamiento diaria. Pipetear los contenidos de un pocillo a un tubo de microcentrífuga y se centrifuga (5.533 xg, 15 min) para obtener sobrenadante de etanol, glucosa y xilosa análisis de alto rendimiento. Medir la biomasa como ₆₂₀ en 96 pocillos de micro-placas (200 l / pocillo) con un espectrofotómetro.
9. Dentro de cada grupo de 30 esolates probado (5 juegos para S. stipitis NRRL Y-7124 se desarrollaron cepas), el cálculo de los índices de rendimiento relativo (RPI), como se describe en el paso 11 a continuación y utilizar para clasificar cada cepa basado en el rendimiento de etanol (etanol máxima acumulada por el azúcar inicial suministrado) y tasa de absorción de xilosa (concentración de xilosa inicial consumida por 96 horas) tanto en los medios de prueba.

11. Rango Aisla en la pantalla primaria PSGHL Utilizando el Índice de Rendimiento Relativo (RPI)

1. Tras el cribado primario, el cálculo de los índices de rendimiento relativo sin dimensiones (RPI) con el fin de clasificar el 30 aislamientos en cada uno de los cinco experimentos diferentes a la pantalla aislados en PSGHL con dos formulaciones diferentes de nutrientes por experimento, es decir, 60% y 75% PSGHL PSGHL.
2. Calcular el parámetro estadístico F para su uso en la clasificación de rendimiento aislado dentro de un grupo de aislados ensayados en un experimento dado: F = (XX _promedio) / s. Aquí, X es el parámetro de rendimiento, como el rendimiento (Y)o tasa (R), observado para cada aislado individual, mientras que X _promedio y s son el promedio y desviación estándar, respectivamente, de X observó para todos los aislados dentro de un experimento dado. Para las distribuciones normales, -2
3. Para cada aislamiento en un experimento, calcular el rendimiento relativo a día, RPI _R = (2 + F _R) × 100/4, y calcular de manera similar el rendimiento relativo basado en el rendimiento, RPI _Y = (2 + F _Y) × 100/4 . El valor de RPI va de 0 a 100 ~ percentil (menor a mayor). A continuación, calcular promedios de RPI para cada aislado dentro de un experimento de hidrolizado de la forma siguiente: RPI = _promedio (RPI _Y + RPI _R) / 2, donde las contribuciones de rendimiento y la velocidad se dio el mismo peso en esta solicitud.
   Tenga en cuenta que, en general, los parámetros de rendimiento y velocidad pueden ser ponderados si se considera desigual en importancia.
4. Calcular IPC _general en todos los n tipos de hidrolizados probados: IPC _general = Σ _{i = 1, n} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n. Consideremos cada aislado en un conjunto experimental de 30 aislamientos y 2 controles. Durante la clasificación primaria de la única colonia de ~ 150 aislamientos adaptado a xilosa rica PSGHL, el RPI _global se calcula para las tasas y los rendimientos a través de las dos formulaciones PSGHL aplicados en la pantalla, es decir, 60% PSGHL y 75% PSGHL, donde n = 2.
5. Sobre la base de RPI _general dentro _de cada experimento, elegir el porcentaje superior de los aislados de pasar a la pantalla secundaria. En este ejemplo, el 20% superior de las cepas se eligen para pasar a través (es decir, 30 de 150 ensayadas).

12. En una pantalla secundaria, Compara Mejores rendimientos selección primaria en Multiple hidrolizados completa (> 100 g / L de azúcares mixtos) para revelar más altas cepas robustas Funcionamiento

1. Comparación de mejor desempeño PSGHL el 6% glucano CSH AFEX y SGH modificado con dos niveles de nitrógeno, SGH-N1 y N2 SGH-(composicións que en la Tabla 1) para la clasificación final. Se tamizan los 30 aislados que eran los de mejor desempeño en la pantalla de la placa de pozo profundo primaria de PSGHL (pasos 10 y 11) y los dos controles (cepa parental NRRL Y-7124 y el aislado de AFEX CSH-tolerante (análoga a la colonia 5 de la Figura 1 Ejemplo ).
2. Comience cultivos escogiendo un cordón de células a partir de vetas de glicerol a pocillos duplicados de profundidad de 1 ml ODM + 50 g / L de xilosa como antes y se incuba 48 hr en el sistema de placa de pozo profundo (paso 10.2). A continuación, traslado 50 l de cultivos previos ODM a 50% de cultivos de desafío SGH, e incubar en el sistema de placa de pozo profundo durante 72 horas para obtener un ₆₂₀ a ~ 10). Preparar el SGH 50% mezclando SGH 1: 1 con azúcar ODM + 50 g / L de xilosa (pH 5,6).
3. Para cada uno de los aislados, inocular un 16 ml alícuota de SGH-N1 o SGH-N2 con el sedimento de células (15 min, 2.711 xg) a partir de tres pocillos de cultivo de infección para producir cultivo de prueba inicial A ₆₂₀ ~ 2,0. Incubar los cultivos de ensayo en 25 & #176;. C, 180 rpm (1 "órbita) en matraces de 25 ml con cierres de esponja de silicona matraces muestra diaria y analizan por la pantalla PSGHL.
4. Del mismo modo, la pantalla aísla como en los pasos 12.2 y 12.3, pero esta vez sustituto SGH-N1 y N2 SGH-glucano con un 6% CSH AFEX a pH 5.2 para su uso en la preparación del medio de medio de cultivo desafío y cultivo de ensayo. Para las culturas de desafío al 50%, utilice 6% AFEX CSH diluido 1: 1 con agua, ya que es suficiente nitrógeno sin modificaciones.
5. Repita los pasos 12.1 a 12.4 para duplicar los resultados.

13. Rango las representaciones de los aislamientos en la pantalla secundaria utilizando RPI _general a la tasa de uso de múltiples hidrolizados completa

1. Calcular los índices de rendimiento relativo (RPI) a fin de clasificar cada una de la parte superior del 20% de los aislados (~ 30 de cada 150) desde la pantalla principal que se han probado en la pantalla secundaria de la enzima sacarificado formulaciones de hidrolizado de diversa riqueza nutritiva.
2. anotar cada unoaislado de prueba en la pantalla secundaria en base a la tasa de absorción de xilosa y el rendimiento de etanol realizado en tres formulaciones de hidrolizado con enzimas sacarificado pretratada por duplicado, incluyendo AFEX CSH (i = 1 y 2), SGH-N1 (i = 3 y 4) y SGH -N2 (i = 5 y 6).
3. Calcular el IPC _general para cada aislamiento, y aplicar este parámetro de clasificación para aventar aún más la lista de los aislamientos superiores: IPC _general = Σ _{i = 1, n} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n, donde n = 6 .
   NOTA: Demostrar cinética de aislamientos superiores en hidrolizados SGH-N2 en cultivos en matraz siguiendo los procedimientos en Slininger et al ^18.

Resultados

S. stipitis se desarrolló usando combinaciones de tres cultivos de selección, que incluían AFEX CSH, PSGHL, y cultivo continuo xilosa alimentado etanol-desafiado. La figura 1 muestra el diagrama esquemático de los experimentos de evolución realizadas junto con los aislados encontrar ya sea para realizar con mayor eficacia en general, o más eficazmente en uno de los hidrolizados de probadas. Tabla 3 muestra los números de NRRL de adhesión de estas cepas superiores y resu...

Discusión

Varias medidas fueron cruciales para el éxito del proceso de la evolución. En primer lugar, es la clave para elegir las presiones de selección apropiados para conducir la evolución de la población hacia los fenotipos deseados que se necesitan para la aplicación exitosa. Los siguientes tensiones selectivos fueron elegidos para S. stipitis desarrollo y aplicado en los momentos apropiados para guiar enriquecimiento para los fenotipos deseados: el aumento de puntos fuertes de 12% glucano AFEX CSH (que fuerza ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-)	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour	Archer Daniels Midland Co. (ADM)	63160	ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant)	Sigma-Aldrich	P1300	Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids	Becton Dickinson and Company	228830	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T3300	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar	Becton Dickinson and Company	214010	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract	Becton Dickinson and Company	218630	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract	Becton Dickinson and Company	212750	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean	Fluka	P0521-500g	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder	Sigma-Aldrich	A8626	CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99%	Sigma-Aldrich	C3506	CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	G6779	CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99%	Sigma-Aldrich	T0376	CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99%	Sigma-Aldrich	U0750	CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS	Fisher Chemical	D16-500	CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99%	Sigma-Aldrich	X1500	CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates	Becton Dickinson Falcon	351172	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper	Kimberly-Clark		towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5)	Corning Life Science Glass	4980-125	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation	New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)	M1335-0016	multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates	Applikon Biotechnology	Z365001700	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates	Applikon Biotechnology	Z365001296	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover	Applikon Biotechnology	V0W1040027	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover	Applikon Biotechnology	V0W1040001	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene	Applikon Biotechnology	ZC3DXP0240	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks	Bellco	1924-00032	Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured.	Bellco	1968-00100 (original Cat. No.)	Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven	MathisAg	Typ-Nbr BFA12 215307	Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer	YSI Life Sciences	2900D-UP	www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek Instruments, Inc	MQX200R	www.biotek.com