Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

Resumen

Microscopía de fluorescencia intravital (IVFM) de la bóveda craneal se aplica en combinación con la genéticos modelos animales para estudiar el autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células hematopoyéticas en la médula (BM) nichos.

Resumen

Creciente evidencia indica que la hematopoyesis normal está regulada por distintas señales microambiental en el BM, que incluyen nichos celulares especializadas modulación crítica de células madre hematopoyéticas (HSC) funciones^1,2. De hecho, un cuadro más detallado del microambiente hematopoyético ahora surge, en el cual los endoóseos y los nichos endoteliales forman unidades funcionales para la regulación de HSC normal y su progenie^3,4,5 . Nuevos estudios han revelado la importancia de las células perivasculares, adipocitos y células neuronales en el mantenimiento y regulación de la función HSC^6,7,8. Además, hay evidencias de que células de diferentes linajes, es decir, las células mieloides y linfoides, hogar y residen en nichos específicos dentro del microambiente de BM. Sin embargo, una asignación completa del microambiente del BM y de sus ocupantes aún está en progreso.

Cepas de ratón transgénico que expresan marcadores fluorescentes específicos de linaje o ratones genéticamente modificados para carecer de las moléculas en células específicas del nicho BM están ahora disponibles. Knock-out y linaje seguimiento de modelos, en combinación con métodos de trasplante, proporcionan la oportunidad de perfeccionar el conocimiento sobre el papel de específicas "niche" células para poblaciones hematopoyéticas definidas como HSC, de células B, células T, células mieloides y células eritroides. Esta estrategia puede ser potenciada aún más combinando el uso de la microscopía de dos fotones de la bóveda craneal. Proporcionando en vivo imágenes de alta resolución y 3D Render de la bóveda de BM, ahora podemos determinar precisamente el lugar donde subconjuntos hematopoyéticos específicos Inicio en el BM y evaluar la cinética de su expansión en el tiempo. Aquí, Lys-GFP ratones transgénicos (marcando las células mieloides)⁹ y RBPJ ratones knock-out (falta de señalización de Notch canónica)¹⁰ se utilizan en combinación con IVFM determinar el engraftment de células mieloides en un microambiente de BM defectuoso de muesca.

Introducción

La microscopia intravital de fluorescencia multifotón (IVFM) es una técnica de imagen de gran alcance que permite la alta resolución y en tiempo real la proyección de imagen de tejidos con profundidad hasta 1mm, dependiendo del tejido. Cuando se aplica a la bóveda del ratón, permite observar el comportamiento de las células hematopoyéticas en el BM en una manera no invasiva hasta 60-100 μm¹¹. Aquí se utiliza este enfoque para determinar la cinética del engraftment de progenitores mieloides normales en los ratones knock-out de BM de RBPJ falta de señalización de Notch canónica.

Trabajos recientes de nuestro grupo demostraron defectuosa señalización canónica de muesca en el BM microambiente conduce a una Enfermedad mieloproliferativa como¹². Pérdida de la señalización de Notch se obtuvo por supresión condicional del dominio de unión de ADN de RBPJ, el factor de transcripción crítico aguas abajo de la muesca canónica de señalización, utilizando Mx1-Cre inducida por recombinación¹⁰. En este estudio, se utilizó el modelo de ratones de Mx1-Cre/RBPJ^lox/lox . Supresión condicional adorno DNA-obligatorio del RBPJ de resultados en la pérdida de la señalización de los receptores Notch. En el modelo Mx1-Cre Cre expresión es conducida por el promotor de Mx1 activado tras la administración de polyI:C dando por resultado la inducción específica de canceladura del gene en células de la sangre así como en componentes stromal de múltiples órganos, incluyendo el BM, el bazo y el hígado.

MX1-Cre⁺/RBPJ^lox/lox y Mx1-Cre^–/RBPJ^lox/lox ratones inducidos con polyI:C (aquí en adelante denominadas RBPJKO y RBPJWT, respectivamente) fueron irradiados letalmente y trasplantados con las células hematopoyéticas normales, tipo salvaje. A partir de la 4 semana después del trasplante, los receptores RBPJKO desarrollaron leucocitosis significativa seguido por esplenomegalia. Aunque ratones RBPJKO presentaron mayor porcentaje de progenitores mieloides en el BM en la semana 8 después del trasplante y en momentos más adelante, el análisis de BM en las semanas 4 y 6 no reveló diferencias llamativas en su contenido de células mieloides en comparación con el control RBPJWT destinatarios. Esta observación, junto con el hecho de que Cre Mx1 se expresa en diferentes órganos hematopoyéticos, planteó la cuestión de si el microambiente del BM tuvo impacto directo en la iniciación del fenotipo mieloproliferativo.

Para determinar si el BM era un sitio crítico inicial de desarrollo de la enfermedad, IVFM de la bóveda de ratón se usa en combinación con BM trasplante el modelo knock-out RBPJ y un sistema de seguimiento de linaje. Ratones transgénicos que expresaban EGFP bajo el control del promotor (Lys-GFP) lisozima específico⁹ fueron utilizados para obtener células de un donante que podrían visualizarse durante BM imagen después de BMT. Expresión de lisozima es específica de las células mieloides y Lys-GFP marca células del progenitor mieloide común (CMP) para los granulocitos maduros¹³.

IVFM del BM en diferentes puntos temporales demostró que las células GFP Lys alojados de manera similar a los destinatarios BM de RBPJWT y RBPJKO, pero ampliaron y engrafted rápidamente en los receptores de la BM de RBPJKO. Esta diferencia fue dramática en el momento anterior (semana 2) y disminuye con el tiempo (semanas 4 y 6). Sin embargo, en estos momentos más adelante, evaluación del compartimiento hematopoyético en el mismo recipiente demostró un aumento constante del número de células mieloides circulantes en la PB y localizados en el bazo de los ratones RBPJKO, lo que indica un aumento de la producción de células del BM en la circulación. Análisis de localización de células Lys-GFP en el BM de ratones trasplantados a las 6 semanas reveló que las células mieloides residían más lejos de la vasculatura en el microambiente de la RBPJKO que en el control.

Colectivamente, la combinación de IVFM con estos modelos animales específicos proporciona penetraciones en la dinámica del engraftment de células mieloides en el microambiente RBPJKO BM. El diseño experimental y el enfoque cuantitativo que se descrito aquí se propone como un paradigma que puede ser aplicado para hacer frente a preguntas similares. Por ejemplo, puede permitir el uso de otro linaje específico celular seguimiento de modelos, tales como GFP RAG1¹⁴ o Gata1-GFP¹⁵ ratones, siguiendo el comportamiento de linfoide o progenitores eritroides, respectivamente, en el BM.

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Protocolo

Se realizaron todos los procedimientos que implican el uso de animales con autorización de cuidado Animal y Use Comité de Indiana University School of Medicine. Asegurar que se adhieran a la legislación sobre experimentación animal del país donde se realiza el trabajo.

1. preparación de Mx1CreRBPJ^{- / -} ratones receptores

1. Cruzar ratones RBPJ^lox/lox ratones¹⁰ para obtener Cre Mx1 Mx1-Cre⁺ positivo ^RBPJlox/lox ratones¹² y Mx1-Cre negativo hermanos de camada de^lox/lox RBPJ utilizar como controles. Verifique que el genotipo por PCR¹⁰.
2. Use 6-8 semanas-viejo Mx1Cre⁺/RBPJ^lox/lox y Mx1Cre^–/RBPJ^lox/lox ratones con realizar la inducción de polyI:C.
3. Inyectar polyI:C 200 μg i.p. en Cre⁺ y Cre^– ratones. Dar una inyección de polyI:C diariamente durante 3 días la primera semana. Dar una inyección de polyI:C la segunda semana, 7 días después de la inyección anterior (cuatro inyecciones en total).
   1. Usar RBPJKO (inducida por Mx1Cre⁺/RBPJ^lox/lox) y RBPJWT (inducida por Mx1Cre^–/RBPJ^lox/lox) ratones como destinatarios 3 semanas después de la última inyección de polyI:C.
      Nota: Se recomienda utilizar ratones inducidos por pI: pC 3 semanas después de la inyección. La respuesta IFNα desencadenada por polyI:C induce cambios significativos en el BM, dando como resultado la expansión de immunophenotypic de HSC y disminución del gasto de progenitores maduros en la sangre periférica^16,17. Representación de los subconjuntos hematopoyéticos es normalizados 3 semanas después de la inyección y los ratones pueden ser utilizados sin los efectos de confusión de la inflamación. Este protocolo de inducción ha sido optimizado para RBPJ. Si eliminar un gen distinto, el protocolo de inducción puede variar dependiendo de la construcción, y eliminación debe estar validada. Validamos la canceladura de ~ 100% de la región RBPJ entre loxP sitios por RT-PCR después de un total de cuatro inyecciones de polyI:C.

2. preparación de células de Lys-EGFP donantes de médula ósea para el trasplante

1. Eutanasia a un ratón de Lys-EGFP (dióxido de carbono seguido por dislocación cervical) 1 o 2 h antes del trasplante.
2. Rocíe la superficie del cuerpo animal con etanol al 70%.
3. Utilice tijeras quirúrgicas para hacer una incisión en la piel en ambas piernas alrededor del tobillo y con fórceps quirúrgico separe la piel y piel para exponer tejido muscular limpio.
4. Utilice tijeras quirúrgicas para quitar tanto músculo de las piernas como sea posible. Utilizando unas tijeras, cortar los huesos (en la rodilla y la articulación del tobillo) y limpie cualquier tejido remanente del músculo de los fémures y tibias usando esponjas de Gasa. Coloque los huesos (dos fémures y dos tibias) en una placa de 6 pozos con DMEM 10% FBS.
5. Machacar los huesos en un mortero con 10 mL frío 2mM EDTA PBS y pipetear las células de la médula ósea para poner las células en suspensión unicelular. También lavar los huesos con tiempos de 2 mM EDTA PBS 3 de cada lado con una jeringa de 1 mL.
6. Filtro de las células de la médula ósea mediante el uso de un filtro de 70 μm en un tubo de centrífuga de 15 mL. Enjuague el filtro con 2-3 mL de PBS. Centrifugar las células a 10 min a 460 x g y resuspender las células en 10 mL de DMEM fresco 10% FBS.
7. Contar las células de la médula ósea en un hemocitómetro y ajustar la concentración a 1.5 x 10⁷ células/mL de IMDM sin suero. Utilice el 3 x 10⁶ células por animal con un volumen de 200 μl. Células de aproximadamente 1/3 del total BM son células GFP + mieloides. Dejar las células en hielo hasta que esté listo para la inyección. Usar 0,5 x 10⁵ células para determinar la expresión de GFP por FACS⁹.

3. médula ósea trasplante de Lys-GFP de células en ratones RBPJKO

1. Refrenar el receptoras ratones en una jaula de pie. Irradiar a ratones con una dosis letal de radiación gamma (1.200 Rad) en un irradiador de 137 Cs. Utilizar un protocolo de dosis divididas: 900 rads en la noche seguido por 300 rads a la mañana siguiente (16 h aparte).
2. Trasplante los ratones receptores RBPJWT y RBPJKO letalmente irradiados 5-6 h después de la segunda dosis de la radiación. BM de inyectar células de ratones de Lys-EGFP en una concentración de 3 x 10⁶ células por animal vía cola inyección en la vena (ver detalles para la recolección de las células en la sección 2).
3. Cohortes independientes de ratones trasplantados por IVFM en momentos diferentes de la imagen: 24 h y a las semanas 2, 4 y 6, como se describe a continuación (véase la sección 4 y 5 para en vivo imágenes de procedimiento).

4. quirúrgico preparación imagen Intravital

1. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos. Dos finas pinzas (una recta, un ángulo), un par de tijeras finas y un par de sostenedores de la aguja. Preparar el área operativa con todos los suministros necesarios para el procedimiento.
2. Poner el ratón una inyección IP de ketamina anestésico cóctel (xilacina 2.5-5 mg/kg + acepromacina 1.0-2.5 mg/kg + ketamina 90-100 mg/kg) utilizando una jeringa de aguja de 26-28 G.  Animal se monitorearán cada 15 min durante el procedimiento y anestesia se complementarán según sea necesario en 1/4 de la dosis original.
3. Coloque el ratón sobre una fuente de calor adecuada (37 ° C almohada, animal protegido del contacto directo con el cojín de calefacción) y monitorear visualmente la frecuencia respiratoria.
4. Controlar reflejos utilizando el dedo pizca de respuesta. Asegúrese que el animal esté completamente bajo anestesia antes de iniciar cualquier procedimiento quirúrgico.
5. Uso un 26-28 calibre aguja jeringa darle ratones una inyección de vena de la cola de un marcador fluorescente vascular (dextrano, 100 μL de solución de 20 mg/mL).
6. Aplicar ungüento oftálmico de veterinario en ambos ojos. Clip de la superficie dorsal de la cabeza del animal con cortauñas eléctricos pequeño. Aplicar una crema para esponjas de Gasa de uso 5 minutos retirar la crema y luego enjuague con una solución salina de la depilación. Preparar el cuero cabelludo limpio con alcohol al 70% utilizando un hisopo de algodón.
7. Use finas pinzas y tijera para hacer una incisión en la piel pequeña de la línea media (10-20 mm) en el cuero cabelludo para exponer la superficie dorsal del cráneo subyacente. Utilizar seda quirúrgica de 5-0 colocar dos suturas de estancia en la piel a cada lado de la incisión, creando una aleta para dejar al descubierto la calota para la proyección de imagen.
8. Coloque el ratón en su parte posterior y sumerja el cuero cabelludo expuesto en un plato de fondo de cristal con aceite de microscopio. Transportar al animal a la mutiphoton sala de proyección de imagen.
9. Coloque el animal en la platina del microscopio con la bóveda craneal colocado sobre el plato de vidrio sobre el objetivo y luego cubrir con una 37cojín de calentamiento ° C (el animal debe ser protegido de contacto directo con el calor).

5. in Vivo proyección de imagen de alta resolución de la bóveda de ratón

1. Utilizar un sistema confocal invertido modificado para la proyección de imagen multifotón (véase tablade materiales ). Siguientes instrucciones sintonizar un laser de 2 fotones a 830 nm, ponga un 20 X W, NA 0.95 objetivo en el pedazo de nariz de microscopio y comprobar la alineación de haz láser.
   Nota: Sistemas de microscopio vertical son más comúnmente utilizados para estos estudios, pero también puede utilizarse un sistema invertido de multifotón. En este estudio, se utilizó un dispositivo estereotáctica personalizado diseño atraumático. Aunque hay varios dispositivos disponibles comercialmente estereotáctica para sistemas del microscopio vertical, no hay ningún dispositivo estereotáxicas comercialmente disponible para un sistema de microscopio invertido encaminado a lograr el cráneo de ratón. Como alternativa a un dispositivo estereotáctica personalizado, el cráneo puede fijarse en posición sobre el objetivo utilizando varios métodos de cinta o goma para la estabilidad.
2. Abra un software de adquisición de imagen. En la"adquisición" panel comprobar si se ha seleccionado un modo de análisis direccional. Configurar la velocidad de escaneo de 4 μs/píxeles, velocidad de fotogramas a 512 x 512 píxeles y zoom a 1,5. Seleccione el objetivo 20 X W Na 0.95 de la lista de disponibles lentes del objetivo para que coincida con la lente colocada en la boquilla.
3. Acceder a la "lista de tinte» desde el panel de"Control de adquisición de imagen"y seleccione"Dos fotones". Abrir la ventana de "Luz camino y colorantes" y seleccione DM690 980 excitación DM. abierto el obturador de laser P 2 marcando la casilla de verificación en la unidad de láser 2. En la ventana "Controlador de microscopio", seleccione RDM690 espejo.
4. Selecciona "Lámpara EPI", elegir cubo de epi-filtro B/G y enfocar el objetivo en la muestra para visualizar el flujo vascular y el nicho de la médula ósea bóveda craneal, utilizando como referencia la bifurcación de la vena central (a) y la sutura coronaria (b) (figura 2A).
5. Recoger imágenes usando el modo no descanned. Seleccione tres detectores externos: detector1 PMT para recoger señal SHG de colágeno (filtro de emisión - 430/100 nm), detector2 de GaAsP para recoger señal GFP (filtro de emisión - 525/50) y detector3 de GaAsP para recoger señal de dextrano TRITC (filtro de emisión - 605/90 nm).
   1. Realizar la proyección de imagen a una velocidad de exploración de 4μs/pixel con ningún promedio para minimizar la fototoxicidad. Recoger imágenes en un aumento de potencia y detector de láser constante ajustado para utilizar el rango dinámico completo del detector con mínima saturación.
   2. Recoger serie de secciones a través de la profundidad del tejido (60 x 1 μm Z stacks) de 6 regiones de la médula de la bóveda craneal. Utilizar la configuración de tamaño de paso de 1 μm, zoom de 1,5 y tamaño de fotograma de 512 x 512 píxeles (423 μm x 423 μm).
      Nota: En general el tiempo total requerido para un ratón de la imagen es 1-1.5 h.

6. análisis cuantitativo

1. Realizar las reconstrucciones de cuantificación y 3D de imagen utilizando un software de cuantificación y visualización de imagen 3D/4D dedicada según las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales). Visualizar interactivamente Z-pilas en 3D utilizando proyección de intensidad máxima (MIP), mezcla de alfa o algoritmos de renderizado de volumen de proyección de sombra.
2. Segmento las células GFP utilizando el "módulo de segmentación de punto objeto". Aplicar el procesamiento aritmético de pila (resta de canal) para eliminar falsos positiva cuenta de células GFP (Esto elimina la señal de las células óseas mostrando fuerte fluorescencia en los canales rojos y verdes).
3. Realizar segmentación de vasculatura y hueso superficie utilizando el módulo de la segmentación superficial. Si es necesario, calcular distancias de células a cualquiera de las anteriores superficies aplicando algoritmos de X-tension, denominadas "distancia de punto a la superficie".

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Resultados

Cohortes de 2 RBPJKO y 2 RBPJWT beneficiarios se reflejada en una sesión de imágenes individual en diferentes puntos temporales: 24 h y 2, 4 y 6 semanas después del trasplante de las células del BM Lys-GFP (flujo de trabajo se ilustra en la figura 1A).

En cada ratón, se adquirieron imágenes de 6 regiones estándar de la bóveda de la BM, identificados por su posición en relación con la bifurcación de la...

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Discusión

Este protocolo describe un diseño optimizado para estudiar la cinética del engraftment de células hematopoyéticas por microscopia Intravital de fluorescentes. En este estudio, la expansión de las células progenitoras mieloides en un BM de WT o en una muesca señalización defectuosa BM fue localizada en la bóveda ósea por células mieloides positivas siguientes de Lys-GFP después de BMT en recipientes RBPJWT o RBPJKO. Este enfoque se propone como un modelo que puede aplicarse para responder preguntas similares, ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine cocktail	IU School of Medicine		Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran	Tdb Consultancy	TD150-100mg	Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer	Braintree Scientific	CLP-323 75
Gauze sponge	Med Vet International	PK224	4-ply, 2 x 2
Nair depilatory cream	Commercial store
Saline	Med Vet International	RXSAL-POD1LT	0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe	Fisher Scientific	14-826-79	28 g, 1/2 cc
Fine Forceps	Fine Science Tools	00108-11, 00109-11	straight forcep, angled forcep
Scissor	Fine Science Tools	15018-10
Needle holder	Fine Science Tools	12002-14
5-0 silk suture	Fisher Scientific	MV-682	Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish	WillCo	GWSt-5040
Optical microscope oil	Leica
Stereotaxic stage insert	IU School of Medicine	Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system	Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective	Olympus
Small heating pad	Commercial store		Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software	Bitplane		3/4 D Image Visualization and Analysis software