Preparación de núcleos de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina para ambos RNA y DNA Extraction

Resumen

Este protocolo modificado de extracción mejora de ARN y ADN rendimientos de las regiones seleccionadas, más precisamente de interés en los bloques de tejido histopatológicos.

Resumen

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

Introducción

La investigación de biomarcadores genómico busca identificar correlatos moleculares que reflejan con precisión y fiabilidad estado de la enfermedad, y lo hacen de una manera clínicamente útil. ¹ el desarrollo de biomarcadores es dependiente de análisis retrospectivo de muestras de tejido bien anotado. muestras de tejidos enfermos y normales se almacenan tejido como fresco congelado en bancos de datos genéticos especializados o como bloques fijados con formalina tejido incluido en parafina (FFPET) en archivos clínicos. Tejido fresco congelado permite la extracción de los ácidos nucleicos de alta calidad y ha sido ampliamente utilizado en estudios de descubrimiento de biomarcadores genómicos. ^2,3 Sin embargo, un menor número de muestras de tejidos están disponibles en bancos de datos genéticos y el estudio de tal tejido introduce un sesgo hacia muestras más grandes, categorías inusuales de la enfermedad, y los pacientes atendidos en centros especializados con mayores capacidades a banco de tejidos. ⁴ FFPET, por el contrario, es el método de almacenamiento por defecto para los tejidos humanos y animales enfermos. Mientras FFPET bloques mantienen m celularorphology, el proceso de fijación reticulaciones otros constituyentes celulares a los ácidos nucleicos. ARN y ADN reticulado son recuperables, pero sólo en formas degradadas, altamente fragmentadas. ^5,6 Sin embargo, estos fragmentos de ADN y ARN son susceptibles de análisis por una serie creciente de ensayos, incluyendo la expresión de ARNm, la hipermetilación del ADN, y la secuencia objetivo. ^7,8 de aprovechar esta oportunidad en la cantidad y variedad de FFPET disponibles para la investigación grande, hay una necesidad de un protocolo de extracción eficiente y fiable.

Una gran parte de la investigación de biomarcadores en el tejido especializado en cáncer. Como otros tipos de tejido enfermo, tejido de cáncer a menudo muestra significativa heterogeneidad regional en la conservación de células y tipo de células. Dado que la investigación de biomarcadores se basa en la capacidad de correlacionar constituyentes de tejido enfermo con características moleculares, un paso crítico de este proceso es la recolección precisa de tejido que está bien conservado y enriquecido para el dNFERMEDAD en estudio. En FFPET, dos técnicas de enriquecimiento se utilizan a menudo: la captura de microdisección por láser (LCM), y seccionamiento microtomo. LCM permite altamente enfocado recolección de tejido y se puede utilizar para aislar determinados tipos de células, bien conservados en los tejidos heterogéneos ^9,10. Sin embargo, LCM requiere equipo costoso y es de tiempo prohibitiva para un gran número de muestras. Seccionamiento Micrótomo es un proceso más ampliamente usado en secciones delgadas se cortan de FFPET bloques. ^11,12 secciones micrótomo de corte a menudo incluyen tejido que es heterogéneo en la conservación de células (por ejemplo, frente a necrótico bien conservado) y la composición (por ejemplo, cáncer vs. parénquima benigna), y por lo tanto puede conducir a la homogeneización de las características moleculares mejores investigados por separado. Por lo tanto, hay una necesidad de un método de alto rendimiento que enriquece para células de interés. Un tercer método, el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de núcleos de FFPET, ofrece este enriquecimiento, es adecuado para alta throughput protocolos, y ha sido utilizado por otros para aislar ARN o ADN de núcleos de tejido separadas. ^7,13,14

Un número de protocolos publicados especificar métodos de extracción de ácidos nucleicos a partir de FFPET (Tabla 1). Sin embargo, los protocolos donde ARN y el ADN se extraen del mismo tejido se han optimizado para secciones de tejido de micrótomo, pero no para núcleos de tejido. ^15,16 protocolos mismo modo, publicados que ofrecen una mayor especificidad de tejido, ya sea a través de núcleos de tejido o microdisecciones de diapositivas, especificar los procedimientos para la extracción de ADN, pero no el ARN. ^7,17 Aquí, un protocolo optimizado para la doble extracción de ADN y ARN a partir de la misma núcleo de tejido se demuestra. núcleos de tejido se cosechan mediante la inserción de los microarrays de tejidos (TMA) golpes en las regiones de interés aplicados sobre bloques FFPET. El mapeo se lleva a cabo por la anotación de un portaobjetos de microscopio con un rotulador y la transferencia de la anotación a la superficie de la correspondiente FFPEBloque T (Figura 1).

Antes de trabajo que condujo al desarrollo de este protocolo incluyó una comparación de varios sistemas de extracción de ácidos nucleicos disponibles en el mercado. En esta comparación, las modificaciones de los protocolos comerciales, como se describe a continuación proporcionan los rendimientos más altos de ADN y ARN y calidad (Selvarajah et al., En preparación). Núcleos de tejido son más gruesas que las secciones de micras 5-10 micras típicamente usadas en protocolos de extracción FFPET ^{11,12,14,18 - 20,} y pueden contener cantidades más variables de parafina. Para compensar esto, desparafinación se mejoró mediante la repetición de los tratamientos de xileno y etanol, y mediante la introducción de una etapa de homogeneización motorizado (Figura 1). Por otra parte, los tiempos de digestión de proteinasa K se alargaron para aumentar el rendimiento de ADN. En general, este protocolo es rentable y permite el establecimiento de vínculos entre las características moleculares e histopatológicas de la enfermedad en laRGE, las poblaciones bien caracterizadas. El protocolo en su totalidad se puede llevar a cabo de forma fiable dentro de 2 días, incluyendo 3 horas de práctica en el tiempo, con poca necesidad de equipo especializado o caro.

El protocolo paso a paso es de aquí en adelante como una versión modificada del protocolo del fabricante. ²¹ Por favor consulte la Tabla de Materiales / Equipo de reactivos específicos, equipos y fabricantes.

Protocolo

1. Tejido de Perforación

1. Revisar el portaobjetos de un microscopio y delinear la región (s) de interés utilizando un marcador permanente de punta fina. Cortar una sección de la película de parafina lo suficientemente grande como para cubrir la región de interés en el portaobjetos de un microscopio. Coloque firmemente en la película de diapositivas y plástico para envolver sobre los bordes para mantener la película se deslice. Utilizando un marcador permanente de punta fina, delinear todo el tejido y la región (s) de interés dentro del tejido, manteniendo el toque esquema - pero fuera de - la región (s).
2. Retire la película y transferirla al bloque de tejido correspondiente. Orientar la película por voltear o girar de manera que el contorno de todo el tejido coincide con la forma observada del tejido en el bloque (Figura 1). Pulsar la sección de la película firmemente a la superficie del bloque para evitar el deslizamiento.
3. Con la punta del marcador permanente, hacer muescas poco profundas pero visible (~ 0,2 mm) a lo largo del contorno de la región (s) de eninterés, a continuación, retire la película. Cargar 1 ml de lejía, 70% de etanol, y agua en 1,5 o 2,0 ml tubos de microcentrífuga separados.
4. Limpiar el punzón receptor (rojo) del punzón 0,6 mm fijado por deslizamiento el punzón hacia arriba y abajo varias veces mientras que la punta se sumerge en el agente de blanqueo tubo que contiene. Repita el paso anterior con un 70% de etanol y luego con agua (crítico para asegurar que el cloro se elimina).
5. Pulse el punzón en el tejido, dentro de la región de interés a una profundidad de 3 mm y retirar el punzón. Liberar el núcleo de unión en un tubo de 1,5 ml o 2 empujándolo fuera del punzón con el lápiz bajo. Almacenar los núcleos a -20 ° C (a largo plazo) o 4 ° C para su uso a corto plazo.
6. Limpiar el punzón según el paso 1.4 y continuar con las siguientes regiones o muestra.

2. Desparafinar los núcleos de tejido FFPE

1. desparafinación Carryout en 1,5 o tubos de 2 ml mediante la adición de xileno 1 ml para el núcleo del tejido y vórtex vigorosamente durante 10 seg. heat durante 3 min a 50 ° C.
2. Centrifugar durante 2 minutos a temperatura ambiente (TA) y la velocidad máxima (21.130 xg) y colocar el tubo en hielo durante 5 min (permite que el residuo de cera se solidifique en la parte superior).
3. Retire con cuidado la parafina acumulada alrededor de menisco con sobrenadante utilizando una punta de pipeta y repetir el tratamiento xileno (pasos 2.1-2.2).
4. Añadir 1 ml de etanol (100%) y agitar vigorosamente durante 10 seg. Centrifugar durante 2 minutos a temperatura ambiente (velocidad máxima), y deseche cuidadosamente el etanol. Repita el paso anterior una vez.

3. La homogeneización de los Núcleos de Deparaffinized

1. Resuspender los núcleos en 700 l de etanol (100%) antes de la homogeneización. El uso de un homogeneizador de tejidos motorizada, moler los núcleos en partículas finas de tejido (~ 1 min en posición media). Limpiar la sonda homogeneizador entre cada muestra para minimizar el traspaso de la contaminación.
   1. Llenar tubos de 15 ml con ~ 10 ml de lejía, solución neutralizante RNasa y 70% de etanol. Después de homo muestrahomoge-, lavar la sonda homogeneizador en cada una de las soluciones de limpieza en el orden indicado anteriormente. Ejecutar el homogeneizador de la velocidad más alta durante la fase de lavado.
   2. Limpie la sonda con el tejido y permitir que la sonda se seque completamente antes de homogeneizar la muestra siguiente. una inspección visual de las palas de la sonda de trozos de tejido residual. Si lo encuentra, limpiar la sonda de nuevo. Cambiar las soluciones de limpieza (lejía, etanol, y la solución de neutralización RNasa) al día.
2. Después de la homogeneización, llevar el volumen de la muestra a 1 ml mediante la adición de más 100% de etanol (~ 300 l). Centrifugar a máxima velocidad durante 15 min, aspirar cuidadosamente el etanol y pellet secar al aire durante aproximadamente 15 a 20 min antes de proceder con la extracción de RNA.

4. Digestión con proteinasa K

1. Resuspender el precipitado en 150 l de proteinasa K digestión Buffer y el tubo para aflojar el sedimento. Añadir 10 l de proteinasa K estable a la temperatura y se mezcla con un movimiento rápido (no hacervórtice del tubo). Incubar el contenido en el tubo a 56 ° C durante 15 min con agitación suave.
2. Permitir tubo para incubar en hielo durante 3 min. enfriamiento completo es importante para la precipitación eficaz en el siguiente paso. Centrifugar durante 15 min a velocidad máxima.

5. Separar ARN a partir del ADN

1. Transferir cuidadosamente el sobrenadante, sin alterar el sedimento, a un nuevo 1,5 ml para la purificación del ARN.
2. Mantenga la pastilla para la purificación de ADN (pellet se puede almacenar durante 2 horas a temperatura ambiente, durante un máximo de 1 día a 2-8 ° C, o por períodos más largos a -20 ° C).

6. Purificación de ARN

1. Incubar el sobrenadante que contiene ARN a 80 ° C durante 15 min (no exceda este tiempo). A continuación, se centrifuga brevemente el tubo para recoger gotas del interior de la tapa.
2. Añadir 320 l de tampón RLT para ajustar las condiciones de unión, y mezclar con la pipeta. A continuación, añadir 720 l de etanol (100%), y el vórtice.
3. transferencia 600 l de la muestra, incluyendo cualquier precipitado que se hubiera podido formarse, a la columna de ARN giro (suministrado en el kit) se coloca en un tubo de recogida de 2 ml y dejar de lado el contenido restante. Centrifugar durante 15 segundos a ≥8,000 xg, deseche el flujo a través de la reutilización y el tubo de recogida.
4. Transferencia de la muestra restante en una columna, incluidas las gotitas que se haya acumulado en la tapa del tubo de centrífuga, para 15 segundos a ≥8,000 xg, y desechar el flujo a través.
5. Añadir 350 l de tampón de FRN a la columna de centrifugación y centrifugar durante 15 segundos a ≥8,000 xg, desechar el flujo a través de la reutilización y el tubo de recogida.
6. Mezclar suavemente 10 l DNasa I de solución madre con 70 l de tampón de RDD, añadir directamente a la membrana de la columna de centrifugación, y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min.
7. Añadir 500 l de tampón de FRN a la columna de centrifugación, centrifugar durante 15 segundos a ≥8,000 xg y guardar el flujo a través para el uso en el siguiente paso. Para potenciar la recuperación de ARN pequeños, coloque la columna de centrifugación en unanuevo tubo de recogida de 2 ml y se aplica el flujo a través de la etapa anterior a la columna de centrifugación.
8. Centrifugar durante 15 segundos a ≥8,000 xg, deseche el flujo a través de la reutilización y el tubo de recogida en el siguiente paso. Añadir 500 l de tampón RPE a la columna de centrifugación y centrifugar durante 15 segundos a ≥8,000 xg, desechar el flujo a través de la reutilización y el tubo de recogida en la siguiente etapa.
9. Añadir 500 l de tampón RPE a la columna de centrifugación y centrifugar durante 15 segundos a ≥8,000 xg y desechar el tubo de recogida con el flujo continuo.
10. Colocar la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recogida de 2 ml, abra la tapa y centrifugar a máxima velocidad durante 5 min. Desechar el tubo de recogida con el flujo a través.
11. Colocar la columna de centrifugación en una nueva colección de 1,5 ml, añadir 20 l de agua libre de RNasa directamente sobre la membrana de la columna de centrifugación, y se incuba el tubo durante 1 min a TA. Centrifugar a la velocidad máxima durante 1 min para eluir el RNA. Almacenar la muestra de ARN se eluyó a -80 ° C.

7. purificación de ADN

1. Resuspender el precipitado obtenido durante la extracción de RNA por adición gradual de 45 l de tampón de proteinasa K (mM Tris 7.5 400, NaCl 400 mM, 3 mM MgCl _2, 4% de SDS); 45 l _{de H2O;} y 400 g de alta potencia a la proteinasa K.
2. Incubar la solución anterior a 56 ° C durante 24 horas (recomendado) o durante la noche. Performincubation a 90 ° C durante 2 horas sin agitación y brevemente Centrifugar el tubo de microcentrífuga para recoger gotas desde el interior de la tapa.
3. Dejar que la muestra se enfríe a temperatura ambiente y luego añadir 4 l de RNasa A (100 mg / ml). Incubar la muestra durante 2 min a TA.
4. Añadir 200 l de tampón AL a la muestra, y mezclar bien con un vórtex. A continuación, añadir 200 l de etanol al 100%, y mezclar bien con un vórtex. Transferir la totalidad de la muestra a la columna provista de centrifugado, el lugar en un tubo de recogida de 2 ml y centrifugar durante 1 minuto a ≥8,000 x g.
5. Desechar el tubo de recogida con elel filtrado y coloque la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recogida de 2 ml. Añadir 700 l de tampón AW1 a la columna de centrifugación, se centrifuga durante 15 segundos a ≥8,000 xg, desechar el flujo a través de la reutilización y el tubo de recogida.
6. Añadir 700 l de tampón AW2 a la columna de centrifugación, se centrifuga durante 15 segundos a ≥8,000 xg, desechar el flujo a través de la reutilización y el tubo de recogida. A continuación, añadir 700 l de etanol al 100% a la columna de centrifugación, se centrifuga durante 15 segundos a ≥8,000 xg y desechar el tubo de recogida con el flujo continuo.
7. Colocar la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recogida de 2 ml, abra la tapa de la columna de centrifugación y centrifugar a toda velocidad durante 5 min. Desechar el tubo de recogida con el flujo a través.
8. Colocar la columna de centrifugación en un nuevo tubo de 1,5 ml de recogida y añadir 25 l de agua libre de nucleasa climatizada (50 ° C). Incubar la columna y el tubo en 50 ° C durante 10 min. Se centrifuga durante 1 min a velocidad máxima, añadir 25 l de agua libre de nucleasa (RT) a la columna y se incuba durante1 min a TA.
9. Centrifugar durante 1 min a velocidad máxima (21.130 xg) y la cosecha de flujo continuo que contiene el ADN genómico (aproximadamente 50 l de ADN en total). Almacenar la columna a -20 ° C (en caso de que se requiere otro elución más adelante).

Resultados

Este protocolo representa un método optimizado para la recuperación de ADN y ARN a partir de núcleos de tejido, usando modificaciones de un sistema de extracción comercial diseñado para secciones de tejido. Optimización incluye la introducción de la homogeneización del tejido, la utilización de más potente proteinasa K para la extracción de ADN, y la extensión del tiempo de digestión de tejido. Los gráficos y análisis estadísticos incluyeron 2 vías ANOVA, regresión lineal y correlación.

Optimizaciones de digestión con proteinasa
El kit comercial incluye una solución estable de proteinasa K temperatura ambiente que fue sustituido con un más potente de proteinasa K, lo que resulta en un mayor rendimiento de ADN (Figura 2A). Para aumentar aún más los rendimientos de ADN, la digestión se extendió de 2 a 24 hr. No se observaron diferencias significativas entre los dos puntos de tiempo, pero la digestión 24 hr parecían proporcionar rendimientos más consistentes a través de samples. Sin embargo, una incubación adicional a 48 hr no mejoró aún más la recuperación de ADN (Figura 2B; p = 0,74).

Recuperación de ADN típico de muestras de tejidos FFPE del cáncer de próstata

Utilizando el protocolo optimizado, ARN y ADN fueron co-extraído de muestras FFPET cáncer de próstata 333 que van desde 3 a 14 años de edad de la muestra. De cada muestra, se utilizaron 3 núcleos de tejido (volumen de tejido total medio de 0,95 ± 0,13 mm ³⁾ como entrada. Mientras que hay otros métodos basados ​​en la electroforesis en gel de microfluidos que puede estimar las concentraciones y proporcionar evaluaciones de la distribución del tamaño de las moléculas de ácidos nucleicos, tales métodos no proporcionan reproducible ácidos nucleicos cuantificación, y no pueden distinguir entre el ARN y el ADN como ensayos basados ​​flourometrically-do. ²² Y, ya que los resultados de electroforesis en gel a base de microfluidos no son confiables para fragmentadaLos ácidos nucleicos derivados de FFPET, ²³ rendimientos de ácidos nucleicos se midieron mediante fluorometría (véase la lista de reactivos para más detalles). El rendimiento promedio fue de 2,270 ng de ARN y 820 ng de ADN (Figura 3A). Aproximadamente el 90% de todas las muestras FFPET analizados en este estudio arrojó ≥100 ng de ADN y ≥ 500 ng de RNA. Curiosamente, no hubo correlación significativa entre la edad de la muestra FFPET y de recuperación de ácido nucleico (Figura 3B). En general, el rendimiento de ARN y ADN se correlacionaron a través de muestras (R ² = 0,39; p <0,0001), aunque más del doble de ARN mucho que el ADN se recuperó de cada muestra (Figura 3C).

A medida que el piloto y la optimización del trabajo se realizó en tejidos de la próstata, el siguiente paso fue investigar el cumplimiento de este protocolo sobre unos tipos adicionales de archivo de tejidos. A partir de quirúrgicamente removidos y muestras de autopsia FFPET representando seahígado benigna (1 muestra de 1 caso), cánceres del cerebro (8 muestras de 1 caso), la vejiga urinaria (2 muestras de 2 casos), y mama (3 muestras de 3 casos), el protocolo produjo> 100 ng de DNA y el ARN de 90% de las muestras (Figura 3D). Mientras que los rendimientos de ácidos nucleicos fueron más bajos en los tejidos de la autopsia que en los tejidos quirúrgicos, los resultados representativos indican que el protocolo produce rendimientos similares a través de los cánceres derivados de diferentes sitios.

Evaluación de ARN y ADN Integridad y su rendimiento Representante en análisis de aguas abajo

análisis de expresión de ARN de 47 genes en 8 muestras de cáncer de próstata FFPET seleccionadas y un PC-3 muestra línea celular de cáncer de próstata fresco (como control positivo) se realizó usando una plataforma de expresión génica multianalito comercial que está optimizado para FFPET. Los recuentos de mRNA en PC3 eran por lo general más altos que los de FFPET samples (Figura 4A). Sin embargo, la comparación de la expresión relativa de todos los genes, las muestras de cáncer de próstata FFPET mostraron perfiles de expresión similares a PC-3 ARN, lo que indica que ambas fuentes de ARN son apropiados para el perfil de expresión de ARN.

Para demostrar el rendimiento de ADN genómico extraído con este protocolo, los extractos de ADN de bisulfito-convertida a partir de muestras FFPET fueron amplificados por PCR específica de metilación (MSP). ²⁴ MSP análisis de ALU elementos repetitivos, regiones altamente metilados presentes en millones de copias en el genoma humano, ²⁵ se utilizó como un control de la metilación genómica, y espera que muestre variaciones mínimas entre muestras. Como se muestra en la Figura 4B, hubo poca o ninguna variación observada entre diferentes muestras en los niveles de metilación MSP ALU. Además, los ensayos basados ​​en MSP GSTP1, un gen conocido por ser hypermethylated en cáncer de próstata, pero no en las muestras benignas, ²⁶ no mostraron amplif detectablemedica- en el ADN de las muestras benignas. Como era de esperar, se detectaron bajos valores de umbral de ciclo qPCR en el ADN de tejidos de cáncer, lo que indica el enriquecimiento de copias GSTP1 metilado. La utilidad de los ácidos nucleicos recuperados por este protocolo se probó en ensayos posteriores típicos, utilizando ácidos nucleicos recuperados de hígado benignos y de un cerebro (post mortem) y a partir de dos muestras de cáncer de mama extirpados quirúrgicamente. Tanto la expresión como MSP basado ensayos de RT-qPCR a cabo bien en el cáncer de mama y FFPET hígado, pero el ensayo de RT-PCR no amplificar un ARNm altamente expresada a partir de la muestra de tumor cerebral post-mortem (Figura 4C), lo que sugiere que el ARN se había degradado, probablemente debido a la fijación del tejido retardada.

Figura 1:. Descripción general del procedimiento de extracción de muestras FFPET La figura ilustra cómo un área de interés en unabloque de tejido se asigna sobre la base de la selección histopatológico de un portaobjetos de microscopio. Tres cilindros de tejido de 0,6 mm se obtienen luego de cada área de tejido mediante el uso de sacabocados, se homogeneizaron juntos y luego se sometió a extracción de ARN y ADN. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ácidos nucleicos (ADN y ARN) los rendimientos en ng / mm ³ de FFPET de dos proteinasa K (temperatura estable y de alta potencia enzimas), y probado en una serie de incubación veces para el último (a) la ejecución de la proteinasa K. de diferentes proveedores. extracciones de ADN se realizaron en una muestra representativa utilizando FFPET temperatura enzima estable suministrado con el kque frente a una más potente de la enzima de otro fabricante. (B) determinar el tiempo de incubación óptimo proteinasa K para maximizar el rendimiento de ADN. Rendimiento de alta concentración de proteinasa K digestión se evaluó en tres diferentes períodos de incubación utilizando 3 muestras FFPET. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3:. Ácidos nucleicos (ADN y ARN) los rendimientos en ng / mm ³ de FFPET en total, a través de años de la muestra y tipos de tejido representativo (A) Total recuperó ácidos nucleicos a partir de tejido incluido en parafina y fijado en formalina. Los ácidos nucleicos cantidades presentadas se basan en las extracciones de muestras 333 FFPET ucantar el protocolo optimizado. (B) gráfica de correlación entre el ADN y ARN total recuperado y la edad de las muestras FFPET. Las muestras extraídas FFPET utilizados se obtuvieron a partir de los años 2000 a 2012. La correlación (C) entre los rendimientos de ADN extraído simultáneamente y el ARN de 333 muestras de próstata. Existe una correlación positiva entre el ADN y ARN rendimientos. (D) Demostración del protocolo usando los tipos de tejido de archivos adicionales. El protocolo optimizado se utilizó para extraer los ácidos nucleicos a partir de 14 cáncer (de mama, vejiga y cerebro) y muestras normales (hígado). Las barras de error representan el SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: El rendimiento de ARN y ADN extraído de Co-TissuNúcleos de correos en las aplicaciones posteriores. (A) del ARNm que cuenta para los tejidos de cáncer de próstata y FFPE de control fresco PC-3 línea celular. Cada punto representa el promedio de 3 repeticiones técnica extraídos por separado. Los valores de ARN de línea celular PC-3 fresco se ilustran mediante barras amarillas y valores de tejido FFPET están representados por puntos de colores. Ensayos de PCR específicos (B) de metilación en el ADN de las muestras de cáncer de próstata FFPET. valores umbral ciclo se obtuvieron 10 muestras realizadas como se esperaba usando 50 ng / reacción de ADN convertido con bisulfito. ALU ensayos MSP de todas las muestras FFPET tenían valores de ciclo umbral similares (p> 0,67). Los ensayos mostraron niveles MSP GSTP1 en cáncer de próstata benigna de próstata que en mayor metilación (ciclo umbral inferior). (C) Evaluación de ADN y ARN de la calidad de los tipos de tejidos adicionales. de expresión génica de genes HPRT1 y Alu ensayos de metilación se realizaron en los ácidos nucleicos (ARN y ADN respectivamente) extraídos de niMal hígado (autopsia) y cerebrales (autopsia) y de mama (todos FFPET). Los resultados de la próstata se muestran para comparación. Nota: Se observaron resultados similares a partir de cada tipo de tejido, excepto para la amplificación de mRNA de una muestra no autopsia. Cada punto o barra representa una muestra, y las barras de error representan el SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

núcleos de tejido
	Entrada tisular (mm3)	Extraídas ácido nucleico	Validación		Verificación de la calidad: DNA			Verificación de la calidad: ARN
			(# De muestras)	Edad de la muestra (años)	Rendimiento total (ng)	tamaño de los fragmentos (pb)	PCR	Rendimiento total (ng)	tamaño de los fragmentos (pb)	PCR	NanoString
Pikor et al.	43-129	ADN	Sin datos	Sin datos	Sin datos	Sin datos
Montaser-Kouhsari et al.	18-29,5	ARN	763	0-25				843	Sin datos
Este papel	1.71	ADN y ARN	> 350	3-12	820	100 - 500		2270	100-500		/ftp_upload/54299/check_mark.jpg "/>
Las secciones de tejido
	entrada de tejido	Extraídas ácido nucleico	Validación		Verificación de la calidad: DNA			Verificación de la calidad: ARN
			(# De muestras)	Edad de la muestra (años)	Rendimiento total (ng)	tamaño de los fragmentos (pb)	PCR	Rendimiento total (ng)	tamaño de los fragmentos (pb)	PCR	NanoString
Heikal et al.	5 x 5 micras	ADN	12	7-22	88-300	103-351
Chung et al.	1 x 20 um	ARN	9	> 5				16.000 23.000	100-200
Antica et al.	2 x 4 micras	ARN	18	Sin datos				Desconocido (621 ng / l)	80-202 +
Ghatak et al.	5 x 5 micras	ADN y ARN	5	1	14 256	<1030		16 000	109-400 +
Hennig et al.	1 x 10 micras	ADN y ARN	210	1-25	Sin datos	Sin datos		Sin datos	Sin datos
Laser Capture microdisección
	Entrada de tejido (mm2)	Extraídas ácido nucleico	Validación		Verificación de la calidad: DNA			Verificación de la calidad: ARN
			(# De muestras)	Edad de la muestra (años)	Rendimiento total (ng)	tamaño de los fragmentos (pb)	PCR	Rendimiento total (ng)	tamaño de los fragmentos (pb)	PCR	NanoString
Snow et al.	1-2	ADN	110	0-2	430	Sin datos

Tabla 1:. Una comparación de los protocolos de ADN y ARN de extracción publicadas para núcleos de tejido, secciones y microdisecciones de captura con láser También se incluyen varios puntos finales de evaluación molecular de estos métodos que utilizan los ensayos de PCR y Nanostring.

Discusión

Para la extracción exitosa de ADN y ARN a partir de regiones de tejido de interés, de extracción de muestras exacta es crítica. Este protocolo describe el uso de un punzón de tejido para aislar 0,6 mm núcleos de diámetro y se describe el proceso para la transferencia de las notaciones de portaobjetos de microscopio para FFPET bloques correspondientes. Se necesitaron modificaciones a protocolo del fabricante para extraer eficientemente los ácidos nucleicos a partir de núcleos, que son aproximadamente 50 veces más gruesa que las secciones de micrótomo para la que se destina el protocolo. Dado que los núcleos pueden contener más cera de parafina con relación a las secciones de tejido, de deparaffinization eficaz de los núcleos a través de repetidas medidas de xileno y tratamiento de etanol se requiere. El éxito de los pasos posteriores a la desparafinación dependía adecuada mecánica núcleos de tejido homogeneización y proteinasa K digestión eficiente. La optimización adicional de la digestión con proteinasa K se puede realizar.

Vale la pena mencionar que este método de identificaciónfica áreas de interés en la superficie del bloque, según se identifican en las diapositivas de histopatología correspondiente. A medida que el tejido cosechas básicas que pueden ser de 3 o 4 mm de profundidad, los usuarios de este protocolo pueden estar preocupados por lo que las células o los tejidos se ponen debajo de la superficie del bloque. Si bien esto es una preocupación válida, múltiples estudios (revisado en la referencia ²⁷⁾ han demostrado que los núcleos de tejido representan fielmente la histológicos y las características moleculares de los bloques de tejido patológico, sobre todo cuando por duplicado o triplicado núcleos son la muestra de la zona de interés.

Como el kit de extracción comercial modificado adoptado en este protocolo permite la extracción simultánea de ambos ADN y ARN del mismo tejido, el protocolo ahorra material biológico precioso y permite una comparación directa entre los dos ácidos nucleicos que resultan de la misma muestra. extracción simultánea de ARN y ADN reduce el agotamiento de la mano de obra y el tejido por medio, y permite el análisis integrado precisa de expr genESIÓN, así como características epigenéticos y genéticos que se encuentran en el ADN. Dado que los rendimientos de ambos ARN y ADN de estos núcleos de tejido representativas típicamente superior a 600 y 300 ng, respectivamente, y dado que la mayoría de los actuales aplicaciones de la PCR y secuenciación de próxima generación requieren típicamente 10 a 100 ng, la mayoría de las muestras purificadas mediante este protocolo debe proporcionar una adecuada material para varios ensayos de aguas abajo. Este protocolo se ha demostrado que es reproducible en todos los laboratorios independientes (Selvarajah et al., En prep.). ARN a partir de este protocolo era de calidad suficiente para el análisis de la expresión génica utilizando RT-PCR o una plataforma multianalito popular, y el ADN se comportó bien en los ensayos de PCR específicos de metilación. Se necesitan estudios futuros destinados a evaluar la utilidad de los ácidos nucleicos recuperados en la secuenciación de próxima generación.

Por lo tanto, se realizaron varias modificaciones a un protocolo comercialmente disponible, diseñado para las secciones FFPET delgadas, lo que hace que sea adecuado for la co-extracción de ARN y ADN a partir de núcleos FFPET 0,6 mm. El protocolo demostrado consistentemente altos rendimientos en una gran cohorte de muestras de cáncer de próstata y en un conjunto limitado de muestras de cáncer de mama, cerebro y la vejiga. En general, el protocolo debe permitir a los usuarios llevar a cabo análisis basados ​​en genes específicos de las grandes colecciones de tejidos bien anotado. Es importante destacar que el protocolo permite el muestreo eficiente enfocado de regiones de interés en FFPET, relativamente pequeñas manos a la vez, y los rendimientos suficientemente altos para la mayoría de las aplicaciones posteriores.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'"	Bemis	RK-06720-40	Any generic paraffin film will work as a substitute
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach"	Likewise	53-2879-2	Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact.
Molecular biology grade absolute ethanol	Fisher BioReagents	BP2818-500	Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute
Molecular Grade H2O	G-Biosciences	786-293	Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O
0.6 mm Punch Set for Beecher Instruments	Estigen	MPO6[Yellow]	Make sure to use the red receiver punch from the set
Fine point permanent marker	Sharpie	10365796S	Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required
FFPE tissue block
Stained tissue slide corresponding to FFPE block
1.5 ml Micro-Centrifuge Tubes	Fisher BioReagents	05-408-137
2.0 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)	Eppendorf	22431048
1.5 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)	Eppendorf	22431021
Histology Xylene	VWR	CA 95057-822	Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute
Molecular Biology Grade 2-Propanol	Sigma	I9516
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit	Qiagen	80234	Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution	Qiagen	80234	Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21
Temperature stable proteinase K	Qiagen	80234
High potency proteinase K	Invitrogen	25530-049	Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY)	Molecular BioProducts	7003
RNaseA 100 mg/ml	Qiagen	19101
BD Integra Syringe 3 ml 21G x 1/2	BD	305274
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor)	Qiagen	9001271	Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute
-20 °C and -80 °C Laboratory Freezer
Micro-Centrifuge with rotor for 2 ml tubes
Digital Vortex Mixer
Pipettes and filter tips
Heating blocks or water baths
Tris Hydrochloride	Amresco	0234
Sodium Chloride	Amresco	0241
Anhydrous Magnesium Chloride	Sigma	M8266
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma	L4509
Acrodisc 25 mm syring filters with 0.45 µm Supor membrane	Pall	PN 4614
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3 ml	BD Integra	305274
Hydrochloric Acid	BDH	3026
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform)	Nanostring nCounter platform, Nanostring
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit)	Invitrogen