Microfluidos intercambio de tampón para la Micro / célula de nanopartículas Ingeniería sin interferencias

Resumen

Este protocolo describe el uso de una estrategia de intercambio de tampón a base de microfluídica inercial para purificar células de ingeniería micro / nanopartículas con el agotamiento eficiente de partículas no unidos.

Resumen

células de ingeniería con cargadas con sustancias activas, micro / nanopartículas (NP) se está convirtiendo en un método cada vez más popular para mejorar las propiedades terapéuticas nativas, permitirá bio imágenes y controlar el fenotipo celular. Una cuestión fundamental todavía insuficientemente reconocidos es el importante número de partículas que permanecen sin unir después del marcaje de células que no se pueden eliminar fácilmente mediante centrifugación convencional. Esto conduce a un aumento en el ruido de fondo de imagen bio y puede impartir efectos transformadores en las células no objetivo vecinos. En este protocolo, se presenta una estrategia basada en la microfluídica inercial tampón de intercambio denominado como Decano de flujo de fraccionamiento (DFF) para separar eficientemente las células marcadas de PN libres en una forma de alto rendimiento. El microdispositivo espiral desarrollado facilita la recogida continua (> recuperación de células 90%) de células purificadas (THP-1 y MSC) en suspensión en una nueva solución tampón, mientras que el logro% agotamiento de colorante fluorescente no unido o NPs de tinte cargado (sil> 95ica o PLGA). Esto solo paso, la estrategia de purificación de células basadas en el tamaño hace posible un rendimiento de procesamiento de alta celular (10 ⁶ células / min) y es muy útil para la purificación de células a gran volumen de células micro / nanopartículas de ingeniería para lograr la aplicación clínica libre de interferencias.

Introducción

La ingeniería de células por micro / nanopartículas cargadas con agente (NPS) es un método de integración libre, versátil y sencilla, genómica para mejorar la capacidad de bioimagen y aumentar / suplementar sus propiedades terapéuticas nativos en la medicina regenerativa. ^1-3 modificaciones celulares se consiguen mediante el etiquetado de la membrana plasmática o el citoplasma con un exceso de concentración de agente PN-cargado para saturar los sitios de unión. Sin embargo, un inconveniente principal de este método es las cantidades significativas de partículas no unidas que permanece en solución después de los procesos de etiquetado de células, lo que potencialmente puede confundir la identificación precisa de las células de partículas de ingeniería o complicar los resultados terapéuticos ^4,5. Además, la exposición a NPs que contienen transformadora agentes (factores de crecimiento, corticoides, etc.) a concentraciones excesivamente altas pueden causar citotoxicidad y la exposición mal dirigida puede inducir consecuencias no deseadas en las células no diana. Incluso los vehículos en partículas que comprende Of materiales "biocompatibles" [por ejemplo, poli (co-glicólico ácido láctico), PLGA] pueden incitar respuestas de las células inmunes potentes bajo ciertas condiciones también. ⁶ Esto es especialmente arriesgado en individuos con inmunidad comprometida (por ejemplo, artritis reumatoide) que potencialmente retrasos . aclaramiento sistémico de nanopartículas ⁷ Por lo tanto, la eliminación eficaz de partículas libres antes de la introducción de las células de ingeniería de partículas es de gran importancia para minimizar el perfil de toxicidad y reducir la exposición a las partículas mal dirigido por agente cargado en vivo.

centrifugación en gradiente convencional se utiliza a menudo para separar las células de ingeniería de partículas libres pero es laborioso y operado en modo por lotes. Por otra parte, las tensiones de cizallamiento experimentadas por las células durante la centrifugación de alta velocidad y los constituyentes del medio de gradiente de densidad puede comprometer la integridad de las células y / o comportamiento de las células influencia. ⁸ microfluídica es una alternativa atractiva con sevtecnologías de separación va- incluyendo el desplazamiento lateral determinista (sistema antibloqueo de frenos) ^9, dieletrophoresis ^10,11 y ¹² acoustophoresis desarrollado para la separación de partículas pequeñas y aplicaciones de intercambio de tampón. Sin embargo, estos métodos sufren de baja rendimiento (1-10 l · min ^{- 1)} y son propensos a la obstrucción cuestiones. separaciones activos tales como los métodos basados ​​en dielectroforesis también requieren diferencias de fenotipos de células dielectroforética intrínsecas o pasos adicionales de etiquetado de células para conseguir la separación. Un enfoque más prometedor implica la microfluídica inercial - la migración lateral de partículas o células a través agiliza centrarse en posiciones distintas debido a las fuerzas de elevación dominantes (F _L) con alto número de Reynolds (Re) ¹³ Debido a sus condiciones de alto flujo y la resolución de tamaño superior. , a menudo ha sido explotada para aplicaciones de cambio de separación de células ^14,15 basados ​​en tamaño y de amortiguamiento. ^16-18 However, el rendimiento sigue siendo pobre intercambio de tampón con solución contaminante ~10-30% como las células separadas suelen permanecer cerca de la frontera entre las soluciones originales y nuevos de amortiguamiento. ^16-18 Más importante aún, la distribución del tamaño de las células diana tiene que ser similar para lograr inercial enfoque preciso y la separación de la solución tampón original que plantea un problema especialmente en el tratamiento de los tipos de células-heterogéneos de tamaño, tales como células madre mesenquimales (MSCs). ¹⁹

Anteriormente hemos desarrollado una nueva técnica de células de microfluidos inercial de clasificación denomina Dean flujo Fraccionamiento (DFF) para aislar las células tumorales circulantes (CTC) ²⁰ y ^{21 de} las bacterias de la sangre entera usando un 2-entrada, el dispositivo de microcanales espiral de 2 salidas. En este protocolo de vídeo, vamos a describir el proceso de etiquetado de las células THP-1 (línea celular de leucemia monocítica aguda humana) monocıticas suspensión (~ 15 m) y MSC (10-30 micras) con calceína-lNPs oaded, seguido por la fabricación y el funcionamiento del microdispositivo espiral DFF para la recuperación eficiente de células marcadas y la eliminación de NPs no unidos. ²² Esta estrategia solo paso de purificación permite la recuperación continua de suspensión etiquetados y las células adherentes en suspensión en solución tampón fresco sin centrifugación. Por otra parte, se puede procesar hasta 10 millones de células · ^mL-1, una densidad de células susceptibles de aplicaciones de la medicina regenerativa.

Protocolo

1. Las nanopartículas (NP) Etiquetado de las células madre mesenquimales y monocitos

1. células madre Cultura mesenquimales (MSC) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y antibióticos para ≥80% de confluencia antes de etiquetado. Del mismo modo, la cultura células THP-1 (ATCC) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% FBS a una densidad de ~ 10 ⁶ células / ml.
2. PN carga de sílice (~ 500 micras) con una solución de colorante calceína (200 M) con agitación durante la noche. Fabrique PLGA-calceína AM (CAM) utilizando un protocolo descrito previamente. ²²
   1. Disolver 250 g CAM y 100 mg de PLGA (50:50) en cloroformo a 4 ° C.
   2. Generar NPs emulsión individuales utilizando un homogeneizador de alta velocidad (13.600 xg, 60 sec) a temperatura ambiente. Evaporar el cloroformo en una campana química (≥3 hr) antes de la recogida usando centrifugación (3.400 xg durante 5 min), lavado (dobles distiagua llena), el secado por congelación y el almacenamiento de -20 ° C.
3. Incubar CAM-PLGA PN (1 mg) o NPs de sílice calceína (150 g) en poli-L-lisina solución 0,01% (PLL) a temperatura ambiente durante 15-20 min.
4. Centrifugar a 3400 xg durante 5 min para eliminar el exceso sobrenadante PLL antes de la resuspensión NPs en 1 ml de medio de cultivo respectivo.
5. Se incuban las células con PN (MSC o THP-1, ~ 1 - 2 x 10 ⁶ células en total) durante aproximadamente 24 horas (0,1 mg · ^ml-1 de concentración etiquetado).
6. Disociarse y la cosecha de las MSC adherentes marcadas utilizando 2 ml de tripsina al 0,25% (5 min, 37 ° C) y se apaga con 6 ml de DMEM. Centrifugar las células a 1000 (xg, 4 min) y se resuspenden a una concentración de 10 ^{05 al 10 06} células / ml para el procesamiento microfluídico. Utilice etiquetados células THP-1 (10 ^{05 al 10 06} células / ml) directamente para la purificación de microfluidos.

2. Preparación dispositivo de microfluidos

1. la fabricación de dispositivos
   1. Fabricar el dispositivo de microfluidos espiral (500 micras (w) x 115 mm (h)) con polidimetilsiloxano (PDMS) de un kit comercial usando pasos de litografía suave estándar. ²³
   2. Mezclar 30 g de prepolímero de base y 3 g de agente de curado a fondo en un recipiente de pesar. De-gas de la mezcla en un desecador durante 60 min para eliminar las burbujas de aire.
   3. Verter la mezcla de PDMS sobre el molde maestro oblea de silicio modelada con el diseño de canal espiral cuidadosamente a una altura de ~ 5 a 10 mm.
   4. De-gas de la mezcla en un vacío desecador durante 60 min de nuevo para eliminar cualquier burbuja de aire. Repita el proceso hasta que todas las burbujas se eliminan.
   5. Curar la mezcla de PDMS en un horno 80 ° C durante 2 horas hasta que el PDMS se establece. Asegúrese de que la oblea no se inclina durante el curado a tener una altura dispositivo constante.
   6. Cortar el dispositivo de espiral PDMS utilizando un bisturí y la cáscara con cuidado la losa de PDMS del molde maestro.
   7. Trim los bordes del dispositivo con un bisturí para asegurar que la superficie lisa para la unión.
   8. Haga dos agujeros (1,5 mm) para las entradas y dos agujeros (1,5 mm) para los puntos de venta en el dispositivo de PDMS usando un golpeador biopsia 1,5 mm.
   9. Lavar el dispositivo con isopropanol (IPA) para eliminar los residuos y seque el dispositivo en un horno a 80 ° C durante 5 min.
   10. Limpiar la superficie inferior del dispositivo de PDMS (con funciones de canal) usando cinta adhesiva.
   11. Clean un lado de una placa de vidrio (2 "por 3") utilizando cinta adhesiva.
   12. Colocar con cuidado y exponer las superficies a limpiar el dispositivo de PDMS y portaobjetos de vidrio en la cámara de un limpiador de plasma y someterlos al vacío durante 60 segundos. A continuación, active la alimentación de plasma al máximo y bajar la presión de la cámara hasta que la cámara se vuelve de color rosa.
       1. Exponer las superficies a plasma de aire durante 60 segundos. El plasma crea especies reactivas en las superficies expuestas de los PDMS y de vidrio que permite una unión apretada cuando se pone en physicAl contacto. Desconecte la alimentación de plasma y libere la presión del limpiador de plasma para recuperar el dispositivo y portaobjetos de vidrio.
   13. Unir el dispositivo de PDMS y portaobjetos de vidrio junto presionando las superficies de plasma expuestos herméticamente y asegurar que no hay burbujas quedan atrapadas entre las dos superficies.
   14. Calentar el dispositivo unido con una placa caliente puesta a 80 ° C durante 2 horas para reforzar la unión.
2. Funcionamiento del dispositivo
   1. Cortar dos piezas de tubo (1,52 mm DO) de ~ 15 - 20 cm para las jeringas de entrada y conectar un extremo de la jeringa (calibre 23) en un extremo de cada tubo.
   2. Cortar dos piezas de tubo (1,52 mm DO) de ~ 5 - 10 cm para los puntos de venta y se unen a los orificios de salida del dispositivo de PDMS.
   3. Antes de probar en marcha, primer manualmente el dispositivo con una jeringa que contiene 70% de etanol hasta que fluye fuera del tubo de salida. Permitir que el plantón de etanol durante 30 segundos a 1 minuto para esterilizar el dispositivo.
   4. Cargar 30 ml de filtrado(0,2 micras de poro) tampón de vaina (Phosphate Buffered Saline-(PBS) con 0,1% albúmina de suero bovino (BSA)) en la jeringa 60 ml y asegurar la jeringa en una bomba de jeringa. Poner la bomba en la configuración correcta (tamaño de la jeringa: 60 ml, Tomo: 60.000 l).
      Nota: La adición de BSA a PBS es reducir al mínimo la unión célula-célula y la unión no específica entre las células y el dispositivo de PDMS.
   5. Cargar 3 ml de células marcadas en la jeringa de 3 ml y asegurar la jeringa en una bomba de jeringa separada. Poner la bomba en la configuración correcta (tamaño de la jeringa: de 3 ml, Volumen: 3.000 l).
   6. Comprobar que no queden burbujas de aire atrapadas en las jeringas para asegurar un flujo estable. Eliminar cualquier burbuja de aire por expulsar suavemente unas gotas de líquido fuera de la boquilla.
   7. Conectar las puntas de jeringa de entrada y los tubos de las jeringas, e insertarlos en las respectivas entradas del dispositivo (funda y entrada de la muestra). Asegúrese de que no haya burbujas a lo largo de la tubería.
   8. Montar los dispositivos en un invertidoed microscopio de contraste de fase para la formación de imágenes en tiempo real durante el proceso de clasificación de células.
   9. Asegurar un vaso pequeño de residuos y dos tubos de 15 ml cerca del dispositivo en la platina del microscopio utilizando adhesivos.
   10. Coloque los tubos de salida en el vaso de residuos.
   11. Ajuste la relación de flujo para la muestra a un tampón de vaina a 01:10 y empezar a ambas bombas de jeringa para iniciar el proceso de clasificación (Ejemplo: 120 l / min para la jeringuilla de la muestra y 1,200 l / min para jeringa vaina; velocidad de flujo de canal ~ 0,38 m / sec ).
   12. Ejecutar el dispositivo para 1,5 min para la velocidad de flujo se estabilice. Esto puede ser confirmado por la presencia de células por inercia centrado cerca de la pared interna del canal bajo de campo brillante con el contraste de fase usando una cámara de alta velocidad (~ 5.000 - 10.000 fotogramas por segundo (fps), el tiempo de exposición: 10-50 microsegundos).
   13. Coloque los tubos de salida en diferentes tubos para recoger los eluyentes desde la salida de la celda y salida de residuos.

Resultados

Después de marcar las células con bio de imagen NPs agente cargado durante la noche, se cosechan las células marcadas (que contiene partículas libres) y se purificaron por microdispositivo espiral DFF para eliminar NPs libres en un solo proceso la etapa (Figura 1A). El 2-entrada, microcanal espiral de 2 salidas está diseñado por el software de ingeniería y microfabricado utilizando SU-8 fotoprotector. La oblea de silicio modelada se utiliza entonces como plantilla...

Discusión

La tecnología de purificación de células DFF descrito en este documento permite la separación rápida y continua de células marcadas en una forma de alto rendimiento. Este enfoque de separación es ideal para gran volumen de muestra o el procesamiento de muestras de alta concentración de células, y es mejor que la filtración a base de membrana convencional que es propenso a la obstrucción después de un uso prolongado. Del mismo modo, la separación magnética basada en la afinidad requiere pasos adicionales de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell lines & Media
Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Lonza	PT-2501
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Lonza	12-614F
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
THP-1 monocyte cells (THP-1)	ATCC	TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media	Lonza	12-702F
Reagents & Materials
0.01% poly-L-lysine (PLL)	Sigma-Aldrich	P8920
3 ml Syringe	BD	302113	Syringe 3 ml Luer-Lock
60 ml Syringe	BD	309653	Syringe 60 ml Luer-Lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Biowest	P6154-100GR
Calcein, AM (CAM)	Life Technologies	C1430
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Isopropanol	Fisher Chemical	#P/7507/17	HPLC Grade 2.5 L
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Lonza	17-516Q/12
Plain Microscope Slides	Fisher Scientific	FIS#12-550D	75 x 25 x 1 mm3
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	SYLGARD® 184
Scotch tape	3M	21200702044	18 mm x 25 m
Silica NPs (∼200 μm)	Sigma-Aldrich	748161	Pore size 4 nm
Syringe Tip	JEC Technology	7018302	23 G 0.013 x 0.25
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	25200-056
Tygon Tubing	Spectra-Teknik	06419-01	0.02 x 0.06" 100
Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50)	Sigma-Aldrich	P2191
Equipment
Biopsy punch	Harris Uni-Core	69036-15	1.50 mm
Dessicator	Scienceware	111/4 IN OD
High-speed Camera	Phantom	V9.1
Inverted phase-contrast microscope	Nikon	Eclipse Ti
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-002
Syringe Pump	Chemyx	CX Fusion 200