Comparación de tres diferentes métodos para determinar la proliferación celular en líneas celulares de cáncer de mama

Resumen

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Resumen

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

Introducción

El gen supresor de tumor, p53, es un regulador esencial de una serie de procesos celulares, incluyendo la detención del ciclo celular, la apoptosis y senescencia ^1. Es responsable de mantener la estabilidad genómica, y por lo tanto es crucial para mantener el equilibrio de la muerte celular y el crecimiento celular. Las mutaciones en p53 son comunes en el cáncer y son la causa principal de la inactivación de p53 conduce a la proliferación de células de cáncer no controlado ^2. Curiosamente, las mutaciones en p53 sólo representan aproximadamente el 25% de los cánceres de mama ^3, lo que sugiere que otros mecanismos son responsables de la pérdida de la función p53. Las isoformas de p53 recientemente descubiertos se ha demostrado que se sobreexpresa en un número de cánceres humanos, y pueden modular la función de p53 ^{de 4,5.} Hemos demostrado anteriormente que la isoforma p53, Δ40p53, es la isoforma más altamente expresado en el cáncer de mama, y ​​se regula positivamente de manera significativa en las células de cáncer de mama, en comparación con TISS normal adyacenteue ^6. A raíz de esto, estable transduced la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 para sobreexpresar Δ40p53 utilizando el Lego-ig2-puro + vectorial (GFP +) ^7. Estas células se usaron para investigar si la expresión de alto Δ40p53 aumenta las tasas de proliferación celular en células de cáncer de mama.

Hay muchos métodos directos e indirectos de la medición de la proliferación celular de las células cultivadas in vitro ^8,9. Estos se pueden realizar ya sea como mediciones continuas en el tiempo, o ensayos de punto final como ^10. Los métodos convencionales son todavía útiles, tales como el recuento de células usando un hemocitómetro. Este ensayo es un bajo costo y medida directa del número de células, pero no se basan en el recuento de células grandes y la formación altamente especializada para minimizar el error y gran estándar desviaciones de los recuentos. La necesidad de realizar mediciones compatible con los formatos de alto rendimiento ha llevado al desarrollo de ensayos de múltiples pocillos de placa. Estos ensayos basados ​​en luminiscencia Measure el número de células sobre la base de una señal luminiscente que es proporcional a la actividad metabólica de la célula ^11,12. Más recientemente, la introducción de las plataformas de imágenes de alta contenido ha permitido nuevas herramientas que controlan la proliferación celular mientras que proporciona la recogida de datos fenotípica cuantitativa y cualitativa, e incluye una variedad de sistemas ^13. Todos estos métodos proporcionan vías para medir el crecimiento celular, ya sea por medio de ensayos de medición o de punto final continuas, y cada uno posee una serie de ventajas y desventajas con respecto a la sensibilidad, el rendimiento de los números de muestra, y la información de células, todo lo cual puede ser pesada en consecuencia dependiendo en la pregunta de investigación.

Este protocolo describe tres métodos diferentes para medir la proliferación celular in vitro, con cada método de utilización de diferentes gamas de sensibilidad, reproducibilidad y formatos de placas de múltiples pocillos. Este protocolo tiene como objetivo comparar el uso de una cha conteo de hemocitómetromber, un ensayo basado en luminiscencia viabilidad celular, y de imágenes de células, en la medición de la proliferación de células durante un tiempo de 96 horas. Para ello, el crecimiento de las células transducidas por vectores (MCF-7-LEGO) se comparó con células transducidas para sobreexpresar Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), utilizando tres diferentes densidades de células. La proliferación celular se midió cada 24 horas para un máximo de 96 hr. Se encontró que cada método para tener sus propias ventajas y desventajas, y en función del objetivo del experimento, cada uno todavía es un método valioso para proporcionar información sobre la tasa de proliferación.

Protocolo

1. Las células que se preparan para Ensayos de proliferación

Nota: Preparar las dos líneas celulares en la misma forma y semilla en el mismo formato para a analizar cada método.

1. Crecer MCF-7-Lego y MCF-7-Δ40p53 ⁷ células a 75-80% de confluencia en T 75 cm ² frascos de cultivo de tejidos usando fenol libre de rojo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) , 200 mM L-glutamina, 2 mg de insulina / ml y 1 mg / ml puromicina a 37 ° C con 5% de CO _2. Manejar las células en una cabina de bioseguridad de clase II estéril.
   Nota: La cantidad de tiempo que se necesita para crecer las células hasta confluencia varía en función de la dilución de la siembra. En preparación para el recubrimiento de las células para los ensayos de proliferación, las semillas de las células a una dilución 1: 3 en DMEM suplementado y mantener en condiciones normales de crecimiento durante 3 días hasta 75-80% de confluencia.
2. Para retirar las células del matraz, verter el medio enun contenedor de residuos. Inmediatamente se lava la capa de células con 2 ml de tripsina 2x pre-calentado. Aspirar tripsina. Añadir otros 2 ml de tripsina previamente calentada a la capa de células y el lugar en una incubadora durante 5 min a 37 ° C con 5% de CO _2.
   1. Una vez que las células se separan, se lavan las células con 10 ml calentado fresco suplementado DMEM. Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml estéril y se centrifuga a 491 xg durante 5 min a TA. aspirar con cuidado y desechar el sobrenadante.
3. Resuspender el sedimento celular en 5 ml de DMEM fresco suplementado. Realizar un recuento de células para determinar la densidad correcta para sembrar las células en placas de 96 pocillos.
   1. Diluir 100 l de la suspensión de células en 900 l de 1x solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS). Coloque un nuevo sensor de 60 micras en el contador de células automatizado. Mantenga presionado el émbolo y sumergir el sensor en la suspensión celular diluida. liberar lentamente el émbolo en el contador de células. Retire el sensor del COU celularnter cuando esté terminado.
      Nota: El número de células se mostrará en el contador de células en células / ml.
4. Se siembran las células en un volumen final de 100 l (en DMEM) en una placa de 96 pocillos a ~ 20% de confluencia para dejar espacio para el crecimiento celular y la medición de la proliferación durante 3-5 días (véase la Tabla 1). Sembrar todas las líneas celulares por triplicado.
   Nota: Para este experimento, se evaluaron tres densidades de células diferentes para determinar la densidad celular óptima. El número de células requeridas se resumen en la Tabla 1. Se siembran las células a una densidad más baja si se requiere la medición de más crecimiento a largo plazo.
   1. Para el hemocitómetro y ensayos basados ​​en luminiscencia, preparar una placa por punto de tiempo (es decir, 4 placas por ensayo). Para el ensayo de imágenes de células, preparar una sola placa para la duración del experimento.
5. Mantener las células a 37 ° C con 5% de _CO2 durante 24 hr.

2. La determinación de recuento de células con nosotrosing un hemocitómetro

1. Pre-caliente tanto medio y tripsina a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular, horno o baño de agua. Aspirar los medios de células en un contenedor de residuos, se lavan una vez con 30 l de tripsina 2x, y aspirar la tripsina.
2. Lavar las células de nuevo con 30 l de tripsina 2x, y se incuba durante 5 minutos a 37 ° C. Golpear suavemente borde de la placa para desalojar las células de la placa. Añadir 50 l de DMEM suplementado y las células de la mezcla mediante pipeteo hasta que las células forman una única suspensión celular.
3. Preparar hemocitómetro por la superficie y cubierta de cristal de la limpieza con etanol al 70%.
4. Coloque el cubre de vidrio sobre las cámaras de recuento y colocarán hasta 'anillos de Newton refracción' se pueden ver entre los bordes cubres y el hemocitómetro.
   Nota: Estos indican que el cubreobjetos se ha adherido correctamente al hemocitómetro.
5. pipeta suavemente 20 l de suspensión de células debajo de la cubierta antideslizante, llenando la cámara de recuento por el movimiento capilar.Coloque hemocitómetro bajo un aumento de 10x de un microscopio y visualizar las cámaras de recuento en el diseño de cuadrícula.
6. Recuento de células en las 4 plazas exteriores de la disposición de la rejilla. Para mejorar la eficiencia, la repetición de cargos de cuadrados externos adicionales si es necesario, o hasta que el recuento ha alcanzado 70 - 100 células ^14,15.
   1. Calcular la concentración de células por ml de la siguiente manera: recuento celular medio por el factor de dilución x cuadrado (si se usa) x 10 ⁴
7. Repita los pasos 2.1-2.8 cada 24 horas durante 96 horas después de la siembra.

3. Determinación de la proliferación de células utilizando un ensayo basado en luminiscencia

Nota: Esta es una medición de punto final. Una vez se añade el reactivo a las células, la placa solamente se puede cuantificar de una vez.

1. reactivo de luminiscencia deshielo en un baño de agua a 22 ° durante 30 minutos.
2. Mezclar suavemente reactivo por inversión de la botella para obtener una mezcla homogénea.
3. Equilibrar una placa de células sembradas (del paso1.5) a TA durante 30 min.
4. Añadir 100 ml de reactivo de luminiscencia a cada pocillo. Mezcle los contenidos en un agitador orbital durante 2 min. Permitir que la platina incubar durante 10 min a TA.
5. La creación de un experimento de la luminiscencia utilizando el multi-modo de software lector de placas.
   1. Encienda el lector de placas multi-modo y abrir el software. En el "administrador de tareas ', seleccione' experimentos 'y' crear new'.Select 'archivo' de barra de herramientas, y bajo" protocolo "pestaña, seleccione" procedimiento ".
   2. Seleccione 'Grenier fondo plano 96' del tipo de placas, y marca la casilla 'utilización tapa'. Seleccione la acción "leer" en la casilla «método de lectura '. Seleccionar método de detección de 'la luminiscencia'. Haga clic en Aceptar'.
   3. En el cuadro de paso leer, seleccionar los pozos que hay que analizar en la pestaña "plato lleno" y seleccione pozos para actuar como pozos en blanco.
   4. Establecer el conjunto de filtros para filtrar vacío (por ejemplo, el enchufe, Em: agujero, espejo: ninguno). Ajuste la ganancia de135, con un tiempo de integración de 0,5 segundos por pocillo y una altura de 6,5 mm leer. Haga clic en "Aceptar" para guardar la configuración para la lectura de luminiscencia.
6. Realización de una luminiscentes Lee
   1. Expulsar soporte de la placa seleccionando la pestaña 'control de instrumentos' y hacer clic en "placa out'.Place placa de 96 pocillos en el soporte de la placa, asegurando la tapa está encendido. Cierre el soporte de la placa haciendo clic en "placa de pestaña en" control de instrumentos '. Haga clic en "leer ahora" de la barra de herramientas para realizar lectura luminiscente.
   2. Exportar las mediciones relativas unidad luminiscente (RLU) para cada pocillo a una hoja de cálculo para el análisis adicional.
7. Repita los pasos 3.1-3.6 para registrar la proliferación cada 24 horas hasta 96 horas después de la siembra de células.

4. La determinación de recuento de células El uso de un generador de imágenes de la célula

1. La creación de un experimento de imágenes de células usando el software de imágenes de células multimodo
   1. Encienda el reproductor de imágenes de células multi-modo y TH abiertosoftware de correo.
   2. En el "administrador de tareas", seleccione la pestaña 'experimentos' y 'crear new'.On la' 'barra de herramientas, haga clic en "archivo" ficha y abierta' protocolo de actuación 'tab.Select' temperatura de ajuste de acción '. Establecer incubadora en 'on' y ajuste la temperatura a 37 ° C y comprobar 'precalentamiento' antes de continuar con el cuadro siguiente paso '. Haga clic en "Aceptar" para guardar la configuración.
   3. Seleccione la acción "leer". Haga clic en el método de detección "imagen", seleccione "punto final / kinetic leer el tipo y el tipo de óptica 'filtros'. Haga clic en 'OK'.Click en la pestaña plato lleno' y seleccione pocillos de la placa para formar imágenes. Haga clic en "Aceptar" para guardar la configuración.
   4. Seleccione el objetivo 2,5 veces en el menú desplegable Opciones 'objetivos'. En la pestaña de 'canales', seleccionar dos canales: GFP 469, 525 y campo brillante. Compruebe la exposición 'auto' para ambos canales y seleccione así la exposición automática.
   5. Para determinar auto ajustes de enfoque, seleccione "Ajustar el enfoque 'y haga clic en" opciones ". Para las opciones de enfoque automático, seleccione el método de 'escanear y luego enfoque automático'. Haga clic en "Aceptar" para guardar la configuración.
   6. Ajuste el horizontal y el desplazamiento desde el centro del pozo (m) vertical para 0.Select para escanear varias imágenes por pocillo en un montaje 3 x 2, con una separación horizontal (m) = 2881 y el espaciamiento vertical (m) = 2,127. Haga clic en 'Aceptar' para guardar los parámetros del procedimiento.
      Nota: Véase la Tabla 2 para parámetros de lectura.
2. Realización Lee Experimento en la placa seleccionada
   1. Haga clic en la pestaña 'control de instrumentos' y seleccionar el function.Place 'depositarse' placa de 96 pocillos en soporte de la placa, asegurando la tapa está encendido. En la pestaña 'control de instrumentos', seleccione el 'plato en "función. Seleccione 'leer ahora' de lengüeta de la placa. Repita leer cada 24 horas hasta 96 horas después de la siembra.
3. El análisis de recuento de células Utilizando elSoftware Imager celular.
   1. Para analizar una imagen, haga clic en la pestaña '' de datos en la placa de captación de imagen, 'foto [GFP 469, 525 + campo brillante]' select. Haga doble clic en un reflejado también.
   2. Haga clic en una imagen cargada. Seleccione 'analizar' y seleccionar una sola imagen del montaje que va a analizarse. Haga clic en 'OK'.Check la' GFP 'canal sólo, y establecer parámetros como se indica en la Tabla 3. Haga clic en "START" para aplicar parámetros a las células fotografiadas.
   3. Observe la máscara de recuento de células se coloca sobre las células fotografiadas, que se utiliza para determinar el recuento de células por imagen. Haga clic en "aplicar los cambios 'y mantener estos valores para cada plancha expuesta durante todo el experimento.
   4. Una vez de vuelta en la plancha expuesta, haga clic en el menú "datos" del menú desplegable y seleccione 'recuento de células'. Esto generará el recuento total de células por pocillo.
   5. Exportar todos los datos a una hoja de cálculo haciendo clic en la pestaña de "exportar" para su posterior análisis of los recuentos de células por pocillo.

Resultados

Para estudiar diferentes métodos de medición de la proliferación de las células cultivadas, la proliferación celular de las células MCF-7-Δ40p53 células transducidas se comparó con la línea celular de cáncer de mama MCF-LEGO-7 no transducidas. Los tres métodos que se compararon - la formación de imágenes método hemocitómetro convencional, ensayo de luminiscencia viabilidad de las células, y las células análisis- se describen en el diagrama esquemático (Figura ...

Discusión

En este protocolo se examinaron tres métodos diferentes de medir la proliferación celular en células cultivadas. Cada método era capaz de mediciones reproducibles y precisos de la proliferación celular en 96 horas, y los resultados fueron comparables entre cada uno de los métodos de prueba (Figura 2 y 3). Tanto el ensayo basado en luminiscencia y el método de formación de imágenes de células producen los resultados más robustos, mostrando aumentos lineales en la proliferación celular despué...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Cell Counter	Merck Millipore		Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom	Nunc	167008
Improved Neubauer Hemocytometer	BOECO Germany	BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope	Olympus	IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay	Promega	G9242	Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software	BioTek	GEN5