Inducción de la Aterosclerosis Acelerada en Ratones: El Modelo de "Lesiones por Alambre"

Resumen

Este estudio describe un procedimiento invasivo para la inducción de la aterosclerosis acelerada en ratones. En comparación con otros métodos que utilizan lesiones inducidas por electricidad o crio, la lesión inducida por la mecánica imita la condición humana de la restenosis después de las terapias de revascularización y es ideal para el estudio de los mecanismos moleculares involucrados.

Resumen

La aterosclerosis es una enfermedad fibroinflamatoria proliferativa que se desarrolla en la pared arterial, lo que induce un flujo sanguíneo deficiente o una falta de flujo sanguíneo. Además, por ruptura de la pared vascular defectuosa, la aterosclerosis induce la formación oclusiva de trombos, que representa la principal causa de infarto de miocardio o accidente cerebrovascular y la causa más frecuente de muerte. A pesar de los avances en el campo cardiovascular, muchas preguntas siguen sin respuesta, y la investigación básica adicional es esencial para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos moleculares durante la aterosclerosis y sus efectos. Debido a estudios clínicos limitados, es necesario crear modelos animales representativos que recrean afecciones ateroscleróticas como la formación de neointima después de la implantación de stent, la angioplastia con balón o la endarterectomía. Dado que el ratón presenta muchas ventajas y es el modelo más utilizado para el estudio de los procesos moleculares, el estudio actual propone un procedimiento invasivo de denudación endotelial, también conocido como el modelo de lesión de alambre, que es representativo de la condición humana de la formación neointima en las arterias después de los procedimientos de revascularización.

Introducción

La aterosclerosis es la principal patología subyacente a eventos cardiovasculares como el infarto de miocardio o el accidente cerebrovascular. Los principales mecanismos que desencadenan los síndromes cardiovasculares agudos son la ruptura de la placa, la erosión superficial y la formación de trombos. Existen múltiples situaciones clínicas relacionadas con el desarrollo de la placa: placa aterosclerótica nativa, restenosis después de la endarterectomía, y restenosis después de la angioplastia con balón con/sin implantación de stent¹. Después de la lesión arterial, la supresión de los procesos inflamatorios^2,3 y la recuperación del compartimento endotelial son esenciales para prevenir complicaciones adicionales^1. La investigación clínica se limita a las muestras de tejido y sangre debido a consideraciones éticas, costos y falta de conocimiento en los mecanismos básicos. Por estas razones, es necesario estudiar los mecanismos moleculares en los modelos animales^4-6,que pueden recrear las condiciones clínicas. Nuestro modelo de formación de neointima acelerada en el contexto de la aterosclerosis es el resultado de muchos años de experiencia en la implementación de estos modelos en animales pequeños^7-11. El modelo de ratón es el modelo más atractivo para la investigación, debido a su facilidad de manejo, la capacidad de tener grandes grupos de animales debido a los bajos costos relacionados con la compra y el cuidado de animales, y la disponibilidad de varias cepas transgénicas y eliminatorias.

La principal desventaja del modelo de ratón es el pequeño tamaño de las arterias principales sometidas a enfermedad aterosclerótica (la arteria carótida, la aorta y la arteria femoral), que requiere experiencia quirúrgica calificada y habilidades para manipular los vasos e inducir invasivamente una placa aterosclerótica. Por lo tanto, el modelo de formación acelerada de neointima, en el contexto de la restenosis después de la enrectomía o la implantación de stent, propuesto en este documento se presenta con una guía paso a paso y sugerencias para facilitar la introducción del personal interesado. Otra desventaja es que la denudación se hace en la pared arterial normal, y por lo tanto, la formación neo-íntima será moderada en comparación con la situación clínica. El alto nivel de colesterol plasmático alcanzado en ratones apolipoproteína E knockout (Apoe^-/-) alimentados con una dieta alta en grasas crea un ambiente proinflamatorio adecuado necesario para la formación neointima.

La cirugía se realiza bajo un estereomicroscopio. La arteria carótida se expone mediante una incisión mediana en el área cervical ventral. Las estructuras anatómicas en la parte superior y alrededor de la arteria carótida se manipulan mínimamente para reducir la inflamación postquirúrgica. La bifurcación de la arteria carótida está expuesta. Para inducir la formación acelerada de neointima, las arterias carótidas internas y externas se preparan para el cese del flujo sanguíneo y la posterior denudación común de la arteria carótida. En conclusión, el método puede ser aprendido por personal con experiencia mínima en cirugías de animales.

Protocolo

Los experimentos presentados en este documento se realizan de acuerdo con la legislación alemana y con las directrices europeas de cuidado de animales. Los animales son criados en el centro de animales del Instituto de Ciencias Animales de Laboratorio, Hospital Universitario de Aquisgrán, Alemania, bajo la supervisión del Prof. Dr. R. Tolba y el Dr. A. Teubner (oficial de bienestar animal).

1. Cuidado de los animales

1. Mantener a los ratones en una unidad de atención especializada, asegurando un acceso adecuado a los alimentos y el control y tratamiento veterinario especializado. Si los animales son trasladados o comprados a terceros, asegúrese de un período de alojamiento de una semana antes de someterse al procedimiento.

2. Incentivo a la hiperlipidemia

1. Alimentar 6 - 8 semanas de edad, 18 - 20 g, hembra (opcionalmente) ApoE^-/- ratones con una dieta aterogénica (21% grasa, 0.15% colesterol, 19.5% caseína, wt/wt) una semana antes del procedimiento quirúrgico y continuar la dieta hasta que se realice el análisis de placa aterosclerótica.

3. Preparación quirúrgica

1. Anestesiar a los ratones utilizando una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de ketamina por peso corporal y 10 mg/kg de xilazina por peso corporal. Confirme la anestesia adecuada antes de la cirugía por la falta de reflejos y movimiento del bigote. Coloque una pequeña cantidad de pomada estéril en el ojo para minimizar el secado.
2. Asegurar el mantenimiento de condiciones estériles para evitar infecciones durante la cirugía mediante el uso de materiales e instrumentos estériles.
3. Afeitar los ratones en la región del cuello ventral. Desinfectar la piel con betadina antes de la incisión. Haga una incisión cutánea de 1 cm en la región mediana de la zona del cuello, en la parte superior de la tráquea.
4. Separe los dos cuerpos gordos para asegurar una visión adecuada sobre la región traqueal. Usa retractores para sostener la capa muscular y exponer la arteria carótida. Si está presente, realice la disección contundente de la capa muscular delgada que cubre la arteria carótida.
5. Usa fórceps curvados afilados para separar la arteria carótida del nervio vago y la vena yugular. Por lo tanto, el área de bifurcación con la arteria carótida interna y externa debe ser visible. Utilice 0.9% NaCl para evitar la sequedad del tejido durante el procedimiento quirúrgico.

4. Lesiones por cable

1. Coloque una sutura de seda de 7 cm de largo 0/5 debajo de la arteria carótida, proximal al arco aórtico. Haga un bucle abierto, listo para ser cerrado en cualquier momento.
2. Coloque dos suturas de seda 0/7 (cada una de 1,5 cm de largo) alrededor de la arteria carótida externa: un bucle cerca del punto de bifurcación y un bucle lo más distal posible. Prepárelos como un bucle abierto, listo para ser cerrado en cualquier momento.
3. Coloque una sutura de seda 0/7 (1,5 cm de largo) debajo de la arteria carótida interna. Prepárelo como un bucle abierto, listo para ser cerrado en cualquier momento.
4. Coloque la mesa del ratón con la cabeza del ratón hacia el operador para asegurar el posicionamiento adecuado para la inserción del cable guía durante la denudación (Figura 1A).
5. Bajo la vista microscópica, detenga el flujo sanguíneo a través de la arteria carótida común sosteniendo y tirando de los extremos de la sutura de seda 0/5 con fórceps de hemostat.
6. Inmediatamente después de la ligadura común de la arteria carótida, cierre firmemente los lazos de sutura colocados en la arteria carótida interna y la sutura distal en la arteria carótida externa(Figura 1B).
7. Realizar una pequeña incisión (arteriotomía, la mitad del diámetro del vaso) distal a la arteria carótida externa, entre los dos bucles, utilizando tijeras pequeñas (Figura 1C). Si la incisión es demasiado grande, siga las instrucciones de solución de problemas (consulte la discusión).
8. Utilice cables guía pulidos comercialmente o utilice personal especializado interno para pulir los cables guía. Desinfecte el alambre guía flexible pulido de 14 pulgadas con alcohol y humedezca en una gota de 0,9% de NaCl para asegurar un deslizamiento adecuado en el recipiente.
9. Inserte el alambre guía en la arteria carótida común a través de la arteriotomía transversal de la arteria carótida externa (Figura 1D). Obtenga la denudación endotelial pasando el alambre guía a lo largo del recipiente mientras gira. Repita este procedimiento tres veces. Mantenga la misma amplitud de movimiento rotacional en cada ratón para aumentar la reproducibilidad.
10. Cierre firmemente el lazo proximal de la arteria carótida externa. Restaure el flujo sanguíneo en la arteria carótida cortando la sutura alrededor de la arteria común y la sutura alrededor de la arteria carótida interna.

5. Sutura y recuperación

1. Retire los retractores y devuelva la capa muscular y los dos cuerpos grasos a la posición fisiológica.
2. Cierre la piel con tres suturas separadas 0/6, si se necesitan medidas ecocardiográficas. Si no se necesitan imágenes, utilice clips metálicos para cerrar la piel.
3. Poner el ratón en su lado izquierdo debajo de la luz infrarroja hasta que se despierte. No deje a un animal desatendido ni en compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
4. Para una identificación futura, marque el ratón utilizando el sistema local. Pregúntele al oficial de bienestar animal de la institución local.

6. Análisis de la placa aterosclerótica

1. Anestesiar a los ratones en el punto de tiempo final utilizando una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de ketamina por peso corporal y 10 mg/kg de xilazina por peso corporal. Confirme la anestesia adecuada por la falta de reflejos y movimiento del bigote.
2. Realizar la exsanguinación por punción retro-orbital o cardíaca y recoger la sangre para su análisis posterior².
3. Desinfectar la piel con betadina. Abra la cavidad torácica y retire el auriculum derecho del corazón. Perfuse solución tamponada de fosfato a través del ventrículo izquierdo para extraer la sangre restante del vaso y luego perfunde 4% PFA para fijar el tejido.
4. Si no se requiere fijación, explanar la arteria carótida inmediatamente después de lavar^2,4,11. Realizar protocolos estándar con análisis de interés: incrustación de parafina, criocisión, arnsm o análisis de proteínas, etc.
5. Para mediciones morfométricas, explane cuidadosamente la arteria carótida incluyendo la bifurcación, con una manipulación mínima, como proximal al arco aórtico utilizando fórceps curvos y tijeras pequeñas.
6. Incruste la arteria carótida en el bloque de parafina utilizando protocolos de incrustación estándar. Para realizar la sección transversal, coloque la arteria carótida en posición vertical sobre la bifurcación. Cortar secciones seriales de 5 m de espesor a partir de la bifurcación y recogerlas todas en diapositivas histológicas recubiertas (Figura 2A).
7. Mancha cada^10a sección usando la tinción Movat para resaltar las láminas^2,4,11. Después de recoger imágenes microscópicas de todos los vasos (utilizando un objetivo 10X), medir el lumen, así como la lámina interna y externa para cada sección, utilizando software especial diseñado^2,4,11, como se muestra en la Figura 2B. Calcular el crecimiento y los medios de los vasos.
8. Analizar las células musculares lisas y el contenido de macrófagos, o la recuperación endotelial en secciones seriales, utilizando la tinción inmunohistóloga habitual² (Figura 2C).

Resultados

El procedimiento de inducción de placa aterosclerótica toma 15 - 20 min y muestra una tasa mínima de mortalidad, principalmente debido al sangrado que ocurre durante el procedimiento. Después de la cirugía, los ratones se recuperan de la anestesia dentro de 20 - 25 min. Después de la cirugía no se observó ningún deterioro físico, como parálisis o alteración de la alimentación.

La lesión por alambre induce una desendotelialización, imitando lesiones vasculares después de la denudación del globo o la implantación de stent. Inmediatamente después de la lesión, la pared vascular denudada se cubrirá con una capa de trombocitos, que media y favorece la adhesión de los monocitos^12. Las células musculares lisas activadas de los medios proliferarán y migrarán a los espacios intimales, formando la neointima. Otros progenitores para las células musculares lisas migrarán de la sangre (se estima que son 40%) y contribuir al crecimiento neointim. La formación de la placa terminará después de la re-endotelialización completa, por lo general 4 semanas después de la lesión de alambre.

La formación de neointima se puede evaluar utilizando la tinción Movat. El tamaño de la placa se calcula para cada diapositiva utilizando el software como se muestra en la figura 2B. El tamaño total de la placa (arteria carótida izquierda) puede variar entre 70.000 - 100.000 m2, mientras que el tamaño del recipiente de control (arteria carótida derecha) puede variar entre 7.000 - 8.000 m2. Estos valores dependen en gran medida del cirujano. Por lo tanto, recomendamos encarecidamente usar el mismo cirujano durante los experimentos para el mismo estudio.

La placa desarrollada se asemeja a la restenosis stent, que consiste predominantemente en células musculares lisas proliferadas y migradas de los medios. La composición celular determinada por los procedimientos de tinción inmunológica muestra que el contenido de la célula muscular lisa es de aproximadamente 30 - 40%, mientras que los macrófagos se encuentran en 15 - 25% de la neointima del vaso lesionado. La re-endotelialización se puede medir después de la tinción para un marcador endotelial, y se calcula como el porcentaje de circunferencia manchada sobre toda la circunferencia del lumen. Por lo general, la re-endotelialización alcanza 80 - 90% después de 3 semanas, y debe ser casi completa después de 4 semanas(Figura 2C). Para realizar un seguimiento del crecimiento de la placa durante su desarrollo, se puede repetir el mismo análisis para cada punto de tiempo después de la lesión por alambre, dependiendo del interés y del sujeto estudiado (ver Tabla 1).

Figura 1. Representación esquemática del procedimiento operativo. (A) El posicionamiento de la mesa de operaciones hacia el operador durante el procedimiento de lesión por cable (B) Vista ampliada de la arteria carótida común y sus ramas, tal como aparece bajo el microscopio a un aumento de 10X (C) El tamaño de la incisión en la arteria carótida externa bajo el microscopio a una ampliación de 10X(D) Representación esquemática del procedimiento de lesión de alambre utilizando el cable guía de 14 pulgadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Análisis de la placa de Restenosis. (A) Representación esquemática del análisis de placa en la arteria carótida común, 4 semanas después de la inducción por lesión por cable (B) Formación neointima 4 semanas después de la lesión de alambre y representación esquemática de los principales parámetros utilizados para el análisis. Intima (área verde) es la diferencia entre el lumen (rojo) y el interna de la lámina (línea verde). El medio (área amarilla) es la diferencia entre la lámina externa (línea amarilla) e interna (línea verde). Barra de escala 100 m(C) Imágenes representativas de la tinción de los principales tipos de células implicadas en la formación de neointima. Células musculares lisas (actina muscular lisa -rojo, barra de escala 100 m), macrófagos (Mac 2- verde, barra de escala 100 m) y células endoteliales (CD31- rojo, flechas, barra de escala 50 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Hora	Trombus	Placa (m2)	Macrófagos (% de Placa)	Células musculares lisas (% de Placa)	Re-endotelialización (% circunferencia lumen)
1 día	Presente	0	0	0	0
1 semana	-	< 30 000	> 10	< 50	< 50
2 semanas	-	< 50 000	> 10	< 50	> 50
3 semanas	-	< 70 000	15-25	30-40	80-90
4 semanas	-	70 000 – 100 000	15-25	30-40	íntegro

Tabla 1. Desarrollo de la placa dependiente del tiempo.

Modelo	Animales	Ventajas	Desanvantages
Aterosclerosis nativa inducida por la dieta	Pequeño	imita la patología de la aterosclerosis facilidad de manejo sin cirugía sin estrés para los animales bajos costos relacionados con la compra y el cuidado de animales disponibilidad de varias cepas transgénicas y eliminatorias	baja reproductibilidad alta varianza aumento del número de animales requeridos aumento del tiempo de espera
	grande	imita la patología de la aterosclerosis facilidad de manejo sin cirugía sin estrés para los animales	baja reproductibilidad alta varianza aumento del número de animales requeridos
Dilatación de globos	Pequeño	imita la restenosis después de la angioplastia con balón bajos costos relacionados con la compra y el cuidado de animales disponibilidad de varias cepas transgénicas y eliminatorias	pequeño tamaño de las arterias principales requiere experiencia quirúrgica calificada globos muy caros denudación se hace en la pared arterial normal existencia de equipo adecuado riesgos de complicaciones como sangrado o parálisis
	grande	imita la restenosis después de la angioplastia con balón facilidad de manejo uso de dispositivos para humanos	denudación se hace en la pared arterial normal
Lesión por cable	Pequeño	imita la restenosis después de la angioplastia con balón facilidad de manejo tasa mínima de mortalidad bajos costos relacionados con la compra y el cuidado de animales disponibilidad de varias cepas transgénicas y eliminatorias sin impedimento físico	pequeño tamaño de las arterias principales requiere menos experiencia quirúrgica cualificada denudación se hace en la pared arterial normal existencia de equipo adecuado
Implantación de stent	Pequeño	imita la restenosis y la trombosis después de la implantación del stent bajos costos relacionados con la compra y el cuidado de animales disponibilidad de varias cepas transgénicas y eliminatorias	pequeño tamaño de las arterias principales requiere experiencia quirúrgica calificada pequeños stents no disponibles denudación se hace en la pared arterial normal aumento de la mortalidad existencia de equipo adecuado riesgos de complicaciones como sangrado o parálisis
	grande	imita la restenosis y trombosis después de la implantación del stent facilidad de manejo uso de dispositivos para humanos	denudación se hace en la pared arterial normal

Cuadro 2. Ventajas y Desventajas de los Modelos Existentes de Lesiones Arteriales.

Discusión

En este artículo, proporcionamos consejos útiles para realizar el procedimiento de lesión por cable incluso por personal con experiencia mínima en cirugías de animales. Hay dos pasos críticos en la realización de este procedimiento: la incisión de la arteria carótida externa y la inserción del alambre. La incisión en la arteria carótida externa debe realizarse en la medida de lo posible desde la bifurcación, con el fin de asegurar suficiente material restante (Figura 1C). La incisión no debe ser demasiado grande, debido al riesgo de cortar todo el vaso. El segundo paso crítico es el alto riesgo de sangrado durante la arteriotomía y la inserción del cable guía si el flujo sanguíneo no se interrumpe eficientemente. Además, es posible que no se realice una denudación endotelial o que la rotura arterial sea posible si el cable guía no se introduce correctamente en el recipiente lumen. Para evitar esto, la superficie del alambre guía debe ser cuidadosamente pulida antes de la operación.

Para optimizar el protocolo, la posición de la mesa de operaciones con la cabeza del ratón hacia el cirujano garantiza una mejor vista, accesibilidad y control para la manipulación adecuada del cable guía. Además, para aumentar la reproducibilidad, utilice el mismo cable guía en todos los estudios. Dado que el tamaño del cable no cambia, es importante considerar y eliminar todas las diferencias posibles entre los ratones mediante el uso del mismo sexo, edad y peso para todos los ratones incluidos en un estudio. A partir de entonces, la tinción Evans-Blue ayudará al cirujano a determinar la eficiencia de la denudación. La existencia de un equipo adecuado es un requisito previo para el éxito del procedimiento. Un estereomicroscopio 10X es esencial para realizar este procedimiento. La preparación adecuada del cable guía (por ejemplo, pulirlo) es crucial. Por lo tanto, recomendamos encarecidamente que la preparación del cable guía sea realizada por personal técnico especializado cuando esté disponible.

Hay muchos pasos de Troubleshooting en este protocolo. Si incigó la arteria carótida externa cerca de la bifurcación, ate cuidadosamente el externo, cerca de la bifurcación, por lo que no se produce sangrado. Durante el corte, no se puede ver la arteria carótida externa. Por lo tanto, considere la bifurcación a nivel de sutura de seda. Recoger secciones cuando la sutura de seda desaparece. Si la incisión en la arteria carótida externa es demasiado grande y el vaso se rompe, asegúrese de que el flujo sanguíneo hacia el communis carótido y la arteria carótida interna se interrumpa eficazmente y trate de encontrar la abertura del vaso utilizando fórceps. Después de introducir el alambre guía y realizar la denudación, atar el recipiente cerca de la bifurcación. Durante el corte, comience a recoger cuando la seda de la sutura comienza a desaparecer. Si se produce una ruptura arterial durante la denudación con el cable guía, compruebe bajo el microscopio si el cable guía está correctamente pulido.

A pesar de la similitud del modelo de lesión por alambre con las situaciones clínicas, muchos grupos se centran en la aterosclerosis nativa en ratones, o eligen inducciones invasivas de aterosclerosis, como la angioplastia con balón en ratas o conejos, debido a la falta de personal capacitado que pueda realizar pequeñas cirugías animales. A pesar de los beneficios del uso de conejos/ratas, por ejemplo, no hay necesidad de equipos miniaturizados, ni los modelos de ratas ni los modelos de conejo ofrecen una variedad de diferentes cepas knock-out, en términos de estudio de los mecanismos moleculares involucrados en el crecimiento neointima y la trombosis en stent.

Los modelos existentes para estudiar la restenosis in-stent en ratones son difíciles, requieren altas habilidades quirúrgicas y tienen altos riesgos de complicaciones como sangrado o parálisis. Por ejemplo, la lesión mecánica o la implantación de stent en la aorta torácica a través de la arteria femoral se acompaña de una alta tasa de mortalidad (35%) debido a la parálisis de las patas traseras o al sangrado^{de 13-15}. También describimos la implantación de stent en la arteria carótida de un^{ratón 16}. El procedimiento es similar; sin embargo, el procesamiento de tejidos para el análisis es complicado y no está disponible para todos los laboratorios¹⁶. La arteria carótida es directamente accesible, no sólo para los procedimientos de operación, sino también para los métodos de diagnóstico por imágenes existentes, como las imágenes por ultrasonido. Otras inducciones por lesiones en las arterias carótidas en ratones se pueden hacer utilizando dispositivos eléctricos¹⁷. Este método es fácil de realizar y garantiza una alta reproducibilidad. Sin embargo, induce lesiones en todas las capas de los vasos, que no es idéntica a la lesión mecánica. Las aplicaciones de globos tienen beneficios, por ejemplo, el ajuste al diámetro del recipiente de acuerdo con la práctica clínica y tiene una fuerte influencia en el resultado patológico. A pesar de que los globos de ratón están disponibles, son muy caros y por lo tanto, no son ampliamente utilizados. En su lugar, la lesión por alambre es el método establecido, imitando la estenosis in-stent.

La denudación se realiza en la pared arterial normal, aunque con un fondo aterosclerótico. Por lo tanto, la formación de neointima será moderada en comparación con la situación clínica. El elevado número de modelos preclínicos demuestra que ninguno de los modelos cumple todos los criterios necesarios para descubrir la totalidad de los mecanismos celulares y moleculares que conducen a la fisiopatología en humanos (véase el cuadro 2).

Después de realizar el procedimiento de lesión por cable, se pueden realizar otros análisis biológicos y moleculares para identificar células, proteínas, mRNAs, microARNas, genes u otros biomarcadores, que pueden utilizarse como dianas terapéuticas para desarrollar nuevas estrategias de tratamiento para la aterosclerosis, y en particular para la formación de neointimación después de la lesión vascular. Si está disponible, el crecimiento de la placa se puede monitorear mediante ultrasonido de alta frecuencia u otras técnicas de imágenes de alta resolución. Además, dominar esta técnica daría al operador la oportunidad de adaptar el protocolo a otros modelos invasivos de incentivo a la aterosclerosis, como la colocación del collar, la ligadura parcial o incluso la implantación de stent.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope	Olympus	SZ/X9	-
Forceps	FST, Germany	91197-00	standard tip curved 0,17 mm
Hemostat forceps	FST, Germany	13007-12	curved
Scissors	FST, Germany	91460-11	Straight
Vannas scissor	Aesculap, Germany	OC 498 R	-
Retractors	FST, Germany	18200-10	2.5 mm wide
Retractors	FST, Germany	18200-11	5 mm wide
Ketamine 10%	CEVA, Germany	-	-
Xylazine 2%	Medistar, Germany	-	-
Bepanthene eye and nose cream	Bayer, Germany	-	-
Silicon tube	IFK Isofluor, Germany	custom-made  product	diameter 500 µm,
section thickness 100 µm,
polytetrafluorethylene catheter
PROLENE Suture 6/0	ETHICON	8707H	polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13 mm, 3/8 Circle
7/0 Silk	Seraflex	IC 1005171Z	-
Michel Suture Clips	FST, Germany	12040-01	-
Clip Applying Forcep	FST, Germany	12018-12	-
14”Wire for Catheter	Abbot	1000462H	Use 10 cm from stiff part and equalize the ends
Mice	Charles River	Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background	-