Un sensor basado en polianilina de ácidos nucleicos

Resumen

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Resumen

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Introducción

Conjugated polymers provide many options for molecular sensors. This includes fluorescence, electronic, and colorimetric responses¹. There have been many efforts to incorporate conjugated polymers in nucleic acid sensors. However, most systems require secondary detection, limiting sensing options². Recently, we reported a conjugated polymer-based sensor platform built on polyaniline (PANI) that exploits properties of this polymer, creating a label-free system³. PANI is an extensively conjugated electro-active polymer with properties such as fluorescence and resistance that are suitable for measuring biological systems⁴. The excitons within the structure are not localized leading to mobility of the positive charge between monomeric subunits. This provides a flexible scaffold of positive charges that can interact with the negatively charged backbone of DNA^5,6. Importantly, electrostatically attached DNA is orientated such that nitrogenous bases can participate in base pairing. Association with DNA alters the electronic properties of PANI, an effect that can be enhanced by UV irradiation (Figure 1)³. Using this system, oligonucleotides complementary to target nucleic acids can be immobilized on PANI. Multiple studies have demonstrated that upon hybridization electrostatically adsorbed oligonucleotides dissociate from PANI or other cationic matrices due to conformational changes caused by the switch to a double-stranded DNA structure^3,5,7.

In a sensor system where probe attachment modulates conjugated polymer properties, hybridization events can be transduced without labels or enzymatic modification of probes or target nucleic acids. Conjugated polymers offer great flexibility in detection methods, one of which is fluorescence. Through monitoring PANI fluorescence, concentrations of target nucleic acids as low as 10^-11 M (10 pM) can be detected³. Detection is rapid, occurring within 15 minutes of hybridization, and specific where a single mismatch in a target molecule can be differentiated³.

Fabrication of PANI-sensors is straightforward. High molecular weight PANI can be generated that is well-dispersed in water using standard synthesis procedures involving aniline monomer, surfactant, and controlled addition of an oxidant. Yield can be very high and unreacted oxidant removed by washing with water, ensuring no further PANI growth. PANI-probe association occurs spontaneously upon mixture, and complex formation is enhanced by mild UV exposure. Hybridization can be carried out immediately, and the changes in PANI fluorescence assayed following a short incubation. The simplicity of this technology makes it highly accessible to many laboratories.

Protocolo

1. Síntesis procesable PANI

1. Disolver anilina (1 ml, 11 mmol) completamente en 60 ml de cloroformo en un matraz de 250 ml de fondo redondo. Se agita a 600 rpm durante 5 min y se enfría a 0-5 ° C con hielo. Esto suele tardar 15-20 minutos (Figura 2A).
2. Añadir sodio dodecil benceno sulfonato (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) a la solución de anilina en un matraz de fondo redondo mientras se agitaba a 600 rpm.
3. Disolver persulfato de amonio (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) en 20 ml de agua y añadir todos de la misma gota a gota durante 30 minutos para evitar el sobrecalentamiento de la reacción.
4. Llevar a cabo la reacción a 0-5 ° C durante 24 horas, y permita que alcance la temperatura ambiente durante otras 24 horas.
5. Observar la mezcla de reacción encender inicialmente de color blanco lechoso después de 15 minutos, a continuación, de color marrón oscuro después de 2 horas, y finalmente a verde oscuro después de 24 horas (Figura 2B-F).
6. Filtrar la solución PANI-NaDBS con un embudo Buchner. Mezclar con 80 ml de cloroformo y 120 ml de agua en taneparation embudo (Figura 2G).
7. Incubar la solución durante 24 horas a temperatura ambiente y recoger el PANI verde oscuro desde el embudo de separación, dejando NaDBS sin reaccionar y APS en el sobrenadante acuoso.

2. Mezcla PANI-sonda y la irradiación UV

1. Diluir solución PANI 10x con cloroformo-agua (1: 3 v / v) y mezclar 200 l de PANI diluye con 6,4 mol de oligonucleótidos de ADN de la sonda por agitación suave durante 15 min en un tubo de microcentrífuga.
2. Irradiar la solución PANI-ADN con 1200 mu J / cm ² de UV en un agente de reticulación para 2 min. Es crítico que la exposición UV se limita a la cantidad indicada. La exposición prolongada a los rayos UV compromete el cambio de fluorescencia en el PANI, probablemente debido a la reticulación covalente del PANI y el ADN.
3. complejos de pellets por centrifugación a 17.000 xg durante 6 minutos, y se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se precipitan de nuevo y volver a suspender en PBS.

3. Hybridization del PANI-sonda

1. Añadir 8 l de 100 mM oligonucleótidos de ADN complementario o ácidos nucleicos diana de 200 l de complejos PANI-sonda.
2. Realizar la hibridación por balanceo mezcla en solución durante 15 minutos a 40 DO.
3. Se precipitan los complejos PANI por centrifugación a 17.000 xg durante 6 minutos. Lavar con PBS y resuspender en agua.

4. Emisión Steady Estado Medición de fluorescencia

1. Añadir PANI de diferentes tratamientos en una microplaca de 96 pocillos y medir la fluorescencia de emisión en el rango de 270 a 850 nm mediante excitación a 250 nm. Un pico de emisión para el PANI se debe observar alrededor de 500 nm.

5. microscopía de fluorescencia Medición de Hibridada Duplex

1. Caída de PANI abrigo en un cubreobjetos de vidrio de borosilicato y se seca a 40 ° C durante 48 horas.
2. Añadir la sonda (8 l de 100 mM) en una película de PANI seca e irradiar con luz UV (1.200 mu J / ^cm2 ) durante 2 min.
3. Se lava la película de PANI-sonda con PBS y se seca a 40 ° C durante 48 horas.
4. Realizar la hibridación durante 15 min mediante la adición de ácidos nucleicos diana. Esto podría ser una muestra biológica o un oligonucleótido objetivo de control (8 l de 100 mM). Siga con un lavado PBS.
5. Obtener las imágenes fluorescentes en un aumento de 40X, con un filtro de paso largo 500 nm.

Resultados

Figura 2A captura la configuración de la reacción en el comienzo del proceso de polimerización, es decir, antes de la adición de APS. La formación de micelas es el paso inicial en la reacción se produce la síntesis de proceso de PANI en la interfase micelar. La Figura 2B muestra una solución lechosa después de 5 min. 30 min después de APS se añade la reacción se convierte en un color ligeramente marrón. Figura 2C mu...

Discusión

Un sensor basado en PANI de los ácidos nucleicos requiere la solubilización del polímero en agua con el fin de interactuar con el ADN y el ARN. La dispersión de la PANI en el agua se logra usando agentes tensioactivos, que forman micelas como se informó anteriormente ^8. Además de los NaDBS utilizados aquí otros tensioactivos aniónicos, tales como éster de dodecilo de ácido 4-sulfoftálico, tensioactivos no iónicos como los etoxilatos de nonilfenol, o tensioactivos catiónicos tales como bromuro de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline	Fisher Scientific	A7401-500	ACS, liquid, refrigerated
Ammonium peroxydisulfate	Fisher Scientific	A682-500	ACS, crystalline
Sodium dodecylbenzene sulfonate	Pfaltz & Bauer	D56340	95% solid
Chloroform	Fisher Scientific	MCX 10601	Liquid
DNA primers	MWG operon	n/a	custom DNA sequence ~20 bps
Microplate	USA Scientific	1402-9800	96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform
Microplate Adhesive Film	USA Scientific	2920-0000	Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-D	PANI coated on UV irradiated cover glass
UV crosslinker	UVP	HL-2000	Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min
Hybridization Oven	VWR	01014705 T	Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min
Glass Apparatus	Fisher Scientific		Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel
Microscope	Leica Microsystems	Leica IMC S80	Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6
Microplate Reader	Molecular Devices	89429-536