Adquisición rápida de imágenes en 3D de alta resolución Usando Episcópico Microscopía

Resumen

We describe a detailed protocol using high-resolution episcopic microscopy to acquire three-dimensional (3D) images of mouse embryos. This improved protocol utilizes a modified tissue preparation method to enhance penetration of the fluorescent dye, thereby permitting morphometric analysis of both small and large-sized specimens.

Resumen

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) morphometric data. Here, we describe the detailed protocol to image the entire mouse embryo. The protocol consists of four major sections: sample preparation, embedding, image acquisition and finally, 3D visualization. The technology requires specimens to be stained with a fluorescent dye, which can be problematic for large or dense specimens. To overcome this limitation, we have improved the existing protocol to enhance tissue penetration of the dye by pretreating the specimen with a solution containing urea and sodium dodecyl sulfate. The protocol uses only routine laboratory equipment and reagents for easy adaptation in standard laboratory settings. We show that the resulting high-resolution 3D images faithfully recapitulate the detailed morphologic features of the internal organs of mouse embryos, thereby permitting morphometric analyses. Together, we present a detailed and improved protocol using standard laboratory equipment to acquire high-resolution 3D images of small and large sized specimens.

Introducción

The advent of 3D imaging technologies has opened the possibility of systemic analysis of detailed morphological features during fetal development. A variety of 3D imaging modalities is now available include micro-magnetic resonance imaging (micro-MRI), micro computed tomography, high frequency ultrasound, optical coherence tomography, optical project tomography and episcopic microscopy^1-4. Each modality has its own unique features in resolution, contrast, speed, cost, in utero capability and availability.

Episcopic fluorescence image capture (EFIC) and high-resolution episcopic microscopy (HREM) are episcopic microscopy imaging methods⁴. Here, high-resolution serial images are captured continuously from the block face instead of tissue sections. The resulting images faithfully reflect detailed morphological features with minimal or no tissue distortion. The acquired volumetric data is readily converted to high-resolution 3-D images suitable for accurate morphometric analysis. Because of relative low cost and high resolution, HREM and EPIC have become the superior alternatives for systemic assessment of mouse models of human birth defects^2,4-8.

Both EFIC and HREM methods require specimens to be embedded in the suitable medium. EFIC detects autofluorescence emitted from the embedded tissue. Because of this, it is limited to specimens emitting high levels of autofluorescence but not those with relatively weak autofluorescence such as early stage embryos⁹. To overcome the dependency of autofluorescence, specimens are stained with a fluorescent dye such as eosin for HREM imaging. The choices of dyes and staining methods also make HREM more compatible to detect molecular signals in the context of tissue architecture and morphology^4,10.

In this article, we present an improved HREM protocol suitable for whole body assessment of the late stage mouse embryos. To facilitate staining, we include a pretreatment step to increase tissue penetration, thereby enabling HREM imaging of older mouse embryos.

Protocolo

Todos los usos de animales son aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Hospital Infantil de Boston.

1. Preparación de muestras

1. apareamiento sincronizado
   1. Coloque una C57Bl6 tipo salvaje macho y una hembra juntos en la misma jaula.
   2. Comprobar la formación de un tapón de apareamiento mañana siguiente temprano. La clavija de acoplamiento (aka, la vagina o el enchufe de la cópula) es una deposición gelatinosa endurecida que bloquea la vagina.
   3. Ajuste la fecha enchufe como el día embrionario 0,5 (E0.5).
2. El aislamiento de los embriones de ratón
   1. La eutanasia a las mujeres embarazadas por asfixia con _CO2.
   2. Ponga los ratones en posición supina sobre una almohadilla absorbente y rociar región abdominal con un 70% de etanol.
   3. Levantar la piel y hacer una incisión de 5 mm inicial en la región abdominal caudal utilizando tijeras quirúrgicas. Cortar y quitar la piel abdominal para exponer completamente los órganos internos
   4. Cortar cerca de Vagina para extirpar todo el útero.
   5. Cortar entre sitios de implantación a lo largo de la trompa uterina. Cada segmento o producto de la concepción deben tener un solo embrión en su interior.
   6. Mantener los segmentos uterinos en solución salina 1x helada tamponada con fosfato (PBS).
3. la disección de embriones
   1. Coloque cada embrión en un plato aparte con helado de PBS en un estereoscopio.
   2. Retire los tejidos uterinos, la placenta y luego las membranas fetales utilizando secuencialmente pinza de disección finas.
   3. Transferir el embrión diseccionado a un tubo de 50 ml con 1x PBS enfriado con hielo usando un gran pipeta de transferencia. Evitar la captación de embriones directamente con fórceps para minimizar el daño tisular.
4. Fijación
   1. Fijar los embriones disecados en solución de formalina tamponada neutra al 10% a 4 ° C durante más de 24 horas con al menos 10 volúmenes de muestra de fijador.
5. El pretratamiento
   1. Preparar la solución clarificadora: 4M urea, 10% de glicerol, 4% dodecil sulfato de sodio (SDS) en agua bidestilada.
   2. Vuelva a colocar el fijador con la Solución de Compensación.
   3. gire suavemente la muestra sobre un balancín a temperatura ambiente durante 1 - 2 semanas. Intercambiar la solución de aclarado una vez en el segundo y el tercer día. El espécimen se convierte poco a poco clara y translúcida.
   4. Vuelva a colocar la solución de aclaramiento con formalina al 10% y dejar en un agitador durante 2 días.
6. Deshidración
   1. Se lavan las muestras pretratadas con 1 x PBS 3 veces durante 5 minutos cada uno.
   2. Deshidratar las muestras en una serie ascendente de etanol a temperatura ambiente en un agitador suave. Para los embriones E15.5, utilizar una serie de etanol ascendente incluyendo 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% y 100% de etanol, 2 hr cada paso. Para los embriones de más edad, el tiempo de incubación debe ser aumentado.
7. tinción
   1. Preparar la solución de tinción: añadir 0.1375 gramos de eosina Y sal disódica y 0,0275 gramos de naranja de acridina hemi (cloruro de zinc) de sal a 50 ml de etanol al 100%. Se agita durante 2 hr. Filtro con un papel de filtro. Almacenar a temperatura ambiente y evitar la luz cubriendo con papel de aluminio.
   2. Transferir la muestra a la solución de tinción durante 1 hora.
   3. Reemplazar con solución de tinción durante la noche fresca y mancha.
8. Infiltración
   1. Preparar solución de infiltración: combinar 100 ml de solución A de JB-4 kit incrustación, 1,25 g de catalizador C, 0.275 g de eosina Y sal disódica y 0,055 g de naranja de acridina hemi (cloruro de zinc) sal. Revuelva para mezclar (200 rpm) en un cubo de hielo durante 2 horas, y luego filtrar con papel de filtro.
   2. Almacenar la solución de infiltración a 4 ° C y evitar la luz cubriendo con papel de aluminio.
   3. La transferencia de los embriones a la infiltración de soluciones: solución de tinción (1: 1), y se incuba durante al menos 3 horas en un puente a 4 ° C.
   4. La transferencia de los embriones a la infiltración de soluciones e incubar durante 3 hr en un agitador en una habitación fría.
   5. Reemplazar solución de infiltración una vez al día, y dejar en un cuarto frío en un agitador suave durante tres días más.

2. Incorporación

1. Mantenga la solución B y la solución de infiltración en el hielo.
2. Hacer Solución incrustación (1:25 de la solución B y la solución de infiltración) inmediatamente antes de la incrustación.
3. Orientar el espécimen en un molde de inclusión, a continuación, vierta la solución incrustación fría en el molde de inclusión con suavidad. Vuelva a orientar con un alfiler, si es necesario.
4. Use un alfiler para examinar si la solución de incrustación se solidifica. Empuje a cabo primero la muestra, y el ajuste si es necesario.
5. Reorientar primero la muestra usando el molde separado para obtener una orientación transversal.
6. Poner un soporte de bloque en la parte superior del molde de inclusión. Vierta suavemente la solución incrustación en el molde hasta que el molde y el soporte del bloque están sumergidos mediante la incorporación de soluciones.
7. Mantenga la muestra en un recipiente secundario y dejarloen hielo durante 3 - 4 horas en una campana de humos.
8. Almacenar las muestras solidificadas en un 4 ° C.
9. Despegar el molde de inclusión. Ponga el bloque bajo el microscopio estereoscópico con iluminación oblicua a la posición de la muestra en el bloque de inspeccionar. En la cara del bloque, las líneas de cuadrícula en Todo el espécimen.
10. Recortar el bloque para eliminar el acceso cantidad de material aglomerante usando las líneas de la cuadrícula marcados como referencias.

3. Adquisición de imágenes

1. Colocar primero la muestra para el microtomo y obtener una superficie recién cortada. Establecer espesor de corte (por ejemplo, e9.5-10.5, 1,5 micras; e11.5-12.5, 2,0 micras; e13.5-15.5, 2,5 micras; E16.5-mayores, 3 M). Mantenga la muestra / de bloques en la posición inicial del microtomo.
2. Montar el microscopio estéreo con zoom horizontalmente hacia la superficie del bloque de la muestra.
3. Encienda el ordenador y el microscopio, y ejecutar el software de adquisición de imágenes.
4. Visualizar y enfocar la óptica al bloque carabajo la modalidad de "visualización en vivo" de software de imágenes.
5. Alinear microscopio y micrótomo si es necesario de modo que el bloque de cara está en el centro de visor.
6. Ajuste el zoom de modo que el bloque entero cara está dentro del visor.
7. Seleccione la proteína fluorescente (GFP) filtro verde (excitación 470 ± 20 nm, dicroico 495 nm, emisión 525 ± 25 nm) y reorientar, si es necesario.
8. Medir y ajustar el tiempo de exposición manualmente (por ejemplo, el 80 - 400 mini-seg).
9. Adquirir imágenes del bloque de cara después de cada corte fresco y guardar las imágenes automáticamente, si es posible.
10. parámetros importantes de registro incluida la resolución, el espesor de la sección y el zoom.
11. Después de terminar la totalidad de la muestra, la exportación y convertir todos los archivos de imagen a formato JPEG si es necesario.
12. Invertir todas las imágenes originales usando un software de procesamiento de imágenes y ajustar el brillo y el contraste.
13. Guardar todas las imágenes procesadas en una carpeta separada.

4. 3DVisualización

1. Sube todas las imágenes procesadas a un software de visualización 3D siguiendo las instrucciones.
2. Resolución de entrada y espesor de corte para convertir todas las imágenes en datos volumétricos (es decir, el tamaño del voxel) y guardar el archivo 3D.
3. Alinear todas las imágenes utilizando el modo automático. Ajustar las imágenes individuales de forma manual si es necesario.
4. Guarda la imagen alineada con un nuevo nombre de archivo.
5. Analizar las características morfométricas de la muestra utilizando el software de visualización 3D.

Resultados

Hemos informado imágenes HREM de alta calidad de los embriones de ratón entre E9.5 y E13.5 ^8. La calidad de imagen de los embriones por etapas finales de los años, sin embargo, se ve comprometida de manera significativa debido a la limitada penetración en el tejido de la eosina colorante fluorescente. Para aumentar la eficiencia de la tinción, hemos probado varios métodos de tratamiento previo que son compatibles con imágenes fluorescentes ^11. En concreto, lo...

Discusión

A continuación, presentamos un protocolo modificado mediante equipos de laboratorio de rutina para adquirir imágenes HREM de serie que son compatibles para la visualización 3D rápida y análisis morfométrico de las estructuras complejas. Debido a que las imágenes de alta resolución se toman directamente de la cara del bloque en lugar de secciones individuales, las características morfológicas finas se conservan y rápidamente reconstruidas digitalmente en un programa de visualización en 3D.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	The Jackson Laboratory	C57BL6
Ethyl Alcohol	Pharmco-Aaper	111000200	200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade
Formalin	Sigma	HT501128-4L
Urea	Sigma	U5128	Clearing Solution
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	Clearing Solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Invitrogen	15525-017	Clearing Solution
Eosin Y Disodium Salt	Fisher scientific	BP241925	Infiltration Solution
Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt	Sigma	A6014	Infiltration Solution
Whatman paper	GE	3030-153
JB-4 Embedding Kit - Solution A	Polysciences, Inc.	0226A-800	Infiltration Solution
JB-4 Embedding Kit - Solution B	Polysciences, Inc.	0226B-30	Embedding Solution
JB-4 Embedding Kit - Catalyst	Polysciences, Inc.	02618-12	Infiltration Solution
Embedding Molds	Polysciences, Inc.	23185-1	16 x 8 mm
Peel-A-Way Sharp Embedding Molds	Polysciences, Inc.	18986-1	22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
JB-4 Plastic Block Holders	Polysciences, Inc.	15899
Disposable Graduated Transfer Pipes	VWR	414004-014
Petrl Dish	VWR	25384-088	Embryo dissection
Forceps Inox Tip	ROBOZ	RS-5015	Embryo dissection
Graefe Tissue Forcep	ROBOZ	RS-5153	Embryo dissection
Delicate Operating Scissor	ROBOZ	RS-6700	Embryo dissection
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes	Falcon	352059
50 ml Polypropylene Conical Tubes	Falcon	352098
Ice Bucket	Magic Touch Iceware International Corp.	R19-343
100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-766
330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-770
Sodium Chloride	MP Biomedicals	102892	PBS Solution
Potassium Chloride	Sigma	P0662	PBS Solution
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5405	PBS Solution
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	PBS Solution
Digital Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Microtome	Leica	RM2265
Illuminator	Carl Zeiss	HXP 200C
Fluorescence Stereo Zoom Microscope	Carl Zeiss	Axio Zoom.V16
Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Fiber Optic Light Source	Leica	KL 1500 LCD
Disposable Microtome Blade	VWR	95057-832
Single Edge Dispenser	Personna	62-0330-0000
ZEN	Carl Zeiss	pro 2012
Photoshop	Adobe	CS6 v13.0
Amira 3D Software	Visage Imaging	5.4
Computer	Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory
Rocking Platform Shakers	VWR	40000-304
Standard Hot Plate Stirrer	VWR	12365-382
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S