Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

Resumen

Se presenta un protocolo mediante el uso de células activadas por fluorescencia para aislar las células dendríticas plasmacitoides (PDC) con alta pureza a partir de la médula ósea de ratones propensos al lupus para los estudios funcionales de PDC.

Resumen

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

Introducción

Efficient separation of a cell population of choice from other cells enables studies of the population that may not be possible otherwise. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a method to enrich an interesting cell population with high purity. ^1,2 Different cell types usually express unique molecules, or a unique combination of several molecules, on the plasma membrane that can distinguish one cell population from another. Upon binding of these cell surface molecules by specific fluorescence-conjugated antibodies, a detecting machine called flow cytometer/sorter is able to excite and detect the light signals of different fluorescent dyes that represent different molecule markers on the cells at the single cell level. The combined information consisting of either the presence of a light signal (representing positive expression of the corresponding surface molecule) or the absence of a light signal (representing negative expression of a molecule) defines the phenotype of the cell. After passing through the detector, cells with the same phenotype of interest are diverted towards a designated collecting tube based on electrical charge.

FACS is broadly applied in various studies as long as the population to be enriched is labeled with fluorescence.^3-7 It has been used to separate immunoglobulin (Ig)A-coated bacteria from non-IgA coated bacteria in the gut microbiota ⁸ and sort genetically engineered cell populations expressing fluorescent proteins. ⁹ Importantly, it has the capacity to separate more than one population simultaneously, which not only saves time and reagents but also allows for more sophisticated study designs. ¹⁰ However, FACS also has its limitations. If a population of interest is very rare (less than 1%), the sorting efficiency may be reduced, causing significant cell loss. In addition, some antibody binding may activate intracellular signal transduction that induces functional changes of the sorted cell population. ¹¹ Therefore, the phenotype used for sorting should be selected carefully.

Other methods exist besides FACS that are also based on cell surface markers for the enrichment of specific cell populations, such as magnetic-activated cell sorting (MCS). ¹² Similar to FACS, magnetic beads-conjugated antibodies can target specific cell surface molecules. Upon antibody-antigen interaction, magnetic beads-coated cells can be separated from non-coated cells after passing through a magnetic field. However, only a limited number of molecules can be targeted in MCS, as magnetic beads are, unlike various fluorescent colors in FACS, undistinguishable. It is thus difficult for MCS to define a cell phenotype with a complicated combination of surface markers. ^13,14 In addition, MCS is also able to cause unintended activation of target cells.

In our studies of a mouse model of systemic lupus erythematosus (SLE), ¹⁵ we intended to purify plasmacytoid dendritic cells (pDC) to investigate their functional changes with disease progression. We first used MCS to enrich pDC from the bone marrow by targeting PDCA-1, a molecule highly and uniquely expressed on murine pDC at steady state. ¹⁶ However, the cell purity was unexpectedly low, likely due to the upregulation of PDCA-1 on other cell populations in an inflammatory environment such as SLE.¹⁶ Ultimately, we have used FACS with a combination of four surface markers (CD11c, CD11b, B220 and PDCA-1) to separate high-purity pDC as CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+ population. Murine pDC has another specific surface marker Siglec-H. We decided not to use Siglec-H, as antibody binding of this molecule represses the function of pDC to produce IFNα. ¹¹

Protocolo

NOTA: MRL / Mp-Fas ^lpr (MRL / lpr) ratones propensos al lupus fueron criados y mantenidos en una instalación libre de patógenos específicos según los requisitos de Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) en Número de Virginia Tech (Animal Aseguramiento de Bienestar: A3208-01). Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Todos los experimentos con animales se realizaron bajo IACUC protocolo # 12-062.

1. Cultivo Celular Medio y ordenación de búfer

1. Preparar medio de cultivo celular completo (C10) usando RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, piruvato de sodio 1 mM, 1% 100 MEM aminoácidos no esenciales, HEPES 10 mM, 55 mM 2-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina y 100 U / ml de penicilina-estreptomicina.
2. Preparar tampón de clasificación (HBSS-completo) usando 1X solución de salina equilibrada de Hank (HBSS) suplementado con HEPES 10 mM, 2,5 mg / ml de albúmina de suero bovino,0,05 mM MgCl ₂ y 0,2 U / ml de DNasa I.

2. Disección del ratón

1. Preparar dos platos de diámetro de 6 cm que contenían 4 ml C10. Colocar las cápsulas en el hielo.
2. La eutanasia a los ratones por inhalación de _CO2.
3. Se recoge el bazo y guardarlo en un plato con C10 en hielo.
   1. Pin el ratón hacia abajo con el vientre hacia arriba en la placa de disección. Esterilizar el cuerpo por pulverización de 70% de etanol.
   2. Cortar la piel y separar la piel de la pared muscular debajo a lo largo de la línea media ventral desde la sínfisis púbica hasta el cuello.
   3. Cortar la piel a lo largo de la extremidad posterior de la primera incisión en el tobillo.
   4. Pin de la piel de la espalda en los lados y cortar la pared muscular a lo largo de los lados del primer lugar de la incisión al diafragma.
   5. Pin de la pared del músculo de la espalda en el lado derecho de la cabeza.
   6. Busque el bazo en el lado derecho del ratón debajo del intestino delgado y al lado del estómago. Recoger a un extremo de THe bazo y separarlo del estómago.
4. Cortar ambas extremidades traseras a cabo, incluyendo fémur y la tibia, y eliminar todos los músculos tanto como sea posible.
   1. Cortar los músculos a lo largo de la extremidad posterior de la articulación de la pelvis / cadera hasta el tobillo con una tijera afilada, tratando de evitar los vasos sanguíneos.
   2. Se separa la extremidad posterior a cabo cortando en la articulación de la pelvis / cadera y la articulación del tobillo / pie sin la exposición de los contenidos de la médula ósea.
   3. restantes músculos limpias en los huesos por el rascado con una hoja de afeitar en varias ocasiones y cortar los músculos en los puntos de conjuntos.
5. Mantener los huesos en una placa de 6 cm que contiene 4 ml C10 en el hielo. Proceder a la disección de la próxima ratón.

3. El aislamiento de esplenocitos

1. Homogeneizar el bazo suavemente con un émbolo de la jeringa contra un filtro de células de 70 micras en la parte superior del plato que contiene 4 ml C10 hasta que no piezas rojas son visibles.
2. Añadir adicional C10 6 ml en el plato a través del filtro unand a continuación, transferir la suspensión total de células 10 ml a un tubo cónico de 15 ml.
3. Centrifugar el tubo cónico a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
4. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 2 ml de tampón de lisis 1 x de glóbulos rojos (RBC). Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
5. Después de la incubación, se centrifuga el tubo cónico a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
6. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 1 ml C10. Desechar los grumos grandes (células muertas) y mantener el tubo en hielo para más tarde.
   NOTA: Si hay muchos pequeños grumos, utilizar un filtro de células de 70 micras para filtrar la suspensión celular una vez.
7. Contar el número de células con azul de tripano usando un contador de células automatizado.

Aislamiento de células de médula ósea 4.

1. La transferencia de los huesos con 4 ml de C10 en un mortero y añadir 6 ml C10 para hacer un volumen de 10 ml en C10 total.
2. Romper los huesos suavemente en el mortero mediante el uso apEstle.
3. Agitar suavemente con la mano del mortero para liberar la médula ósea en C10.
4. La transferencia de los C10 de 10 ml que contienen la médula ósea en un tubo cónico de 50 ml en hielo a través de un filtro de células de 70 micras. Añadir C10 10 ml fresco en el mortero que contiene todavía los huesos.
   NOTA: Pipetear la solución que contiene la médula ósea hacia arriba y abajo varias veces antes de pasar a través del filtro si aparecen grumos rojos son visibles.
5. Repita los pasos 4.2 a 4.4 veces. Después del último lavado, los huesos deben aparecer blanco.
6. Centrifugar el tubo cónico de 50 ml a 800 xg durante 5 min, 4 ° C. Mientras tanto, preparar 5 ml de medio de gradiente de densidad lista para su uso en un tubo de centrífuga cónico de 15 ml a temperatura ambiente.
7. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml C10.
8. capa lentamente la suspensión 10 ml de células en la parte superior del medio de gradiente de densidad de 5 ml, manteniendo interfaz clara entre las dos fases. Centrifugar a continuación el tubo cónico de 15 ml a 1.363 g durante 30 min aRT (20 ° C) con el conjunto de aceleración y desaceleración 9 establece como 0 (u OFF de freno).
9. Después de la centrifugación, eliminar la solución de la parte superior 8 ml cuidadosamente y recoger la capa leucocitaria 2 ml en la interfaz (una capa de células mononucleares) en un nuevo tubo cónico de 15 ml.
10. Añadir C10 12 ml de hielo frío a los 15 ml tubo cónico que contienen células mononucleares de médula ósea, tapa e invierta varias veces para mezclar bien y centrifugar el tubo a 800 xg durante 10 min, 4 ° C.

5. celular tinción de la superficie de FACS

1. tinción de las muestras
   1. Preparar CD16 / 32 solución de anticuerpo anti-ratón (dilución 1 a 100 en HBSS-completo, 5 mg / ml de concentración final).
   2. Después de la centrifugación en la etapa 4.10, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en solución de anticuerpo 100 l anti-ratón CD16 / 32 para bloquear los receptores Fc en las células mononucleares. Incubar en hielo durante 10 min.
   3. Preparar la mezcla de anticuerpos de fluorescencia de conjugado (hormigadilución i-ratón CD11c-PE 1:40, anti-ratón de dilución CD11b-APC-CY7 1:80, anti-ratón de dilución PDCA-1-FITC 1:40 y anti-ratón B220-V500 dilución 1:40 en HBSS completa según lo recomendado por el fabricante en un volumen final de 100 l por muestra).
      NOTA: Es importante para titular anticuerpos antes de su uso.
   4. Después de 10 min de incubación en el paso 5.1.2, añadir 4 ml de hielo frío HBSS-completo y se centrifuga a 800 xg durante 5 min, 4 ° C para eliminar el no unido anti-ratón CD16 / 32.
   5. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 100 mezcla de anticuerpos de fluorescencia conjugado l. Incubar en hielo durante 15 min en la oscuridad.
   6. Después de 15 min de incubación, añadir 4 ml de hielo frío HBSS-completo y se centrifuga a 800 xg durante 5 min, 4 ° C para eliminar los anticuerpos de fluorescencia conjugado no unidos.
   7. Preparar la solución de carga FACS (500 ng / ml DAPI en HBSS-completo).
   8. Después de la centrifugación en el paso 5.1.6, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 500 μ; L FACS solución de carga. Transferir la suspensión celular en un 12 x 75 mm de tubo de fondo redondo (tubo FACS) y mantener el tubo en hielo en la oscuridad hasta la clasificación dentro de 1 hr.
2. La tinción para la compensación
   1. Etiqueta de 6 tubos de FACS como PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI o sin teñir. Esplenocitos alícuotas de células de 1 x 10 ⁶ / tubo en los tubos de FACS, y se lava con 4 ml de HBSS de su capacidad a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
      NOTA: colorante fluorescente, DAPI, Uso de unión al ADN para distinguir las células vivas de las células muertas. DAPI puede pasar a través de la membrana plasmática de las células muertas (pero no de células vivas) y el ADN cromosómico se unen.
   2. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 100 l HBSS-completo.
   3. En cada tubo de FACS correspondiente, añadir uno de los siguientes anticuerpos: anti-ratón de dilución CD19-PE 1:40, anti-ratón de dilución CD11b-APC-CY7 1:80, anti-ratón de dilución PDCA-1-FITC o 1:40 B220-V500 anti-ratón dilución 1:40 según lo recomendado por el manufacturer. Deje el ^5º (DAPI) y ^6º (sin teñir) FACS tubos, ya que son. Mezclar bien por agitación e incubar todos los tubos de FACS en hielo en la oscuridad durante 15 min.
   4. Después de la incubación, añadir 4 ml de hielo frío HBSS-completo en cada tubo y centrifugar los tubos de FACS a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
   5. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 500 l de hielo frío HBSS-completo excepto por el pellet en el tubo etiquetado DAPI, que se resuspendió en solución de carga de l 500 FACS. Mantener los 6 tubos en hielo en la oscuridad hasta la clasificación.

6. Clasificación en el clasificador de células

NOTA: El funcionamiento del procedimiento de clasificación en el citómetro y el software ha sido estandarizada con una instrucción detallada proporcionada por la empresa. Brevemente, utilizamos 100 micras boquilla a 20 psi, ajustar la concentración de células objetivo entre 5 hasta 10 millones por ml, y ajustar la eficiencia de 70% o más (es decir, conflictos mantienen bajo 30%).

1. Preparar tubos de recogida de FACS con 500 l de FBS / tubo que contiene 100 U / ml de penicilina-estreptomicina.
2. Ajustar los parámetros de compensación del clasificador de células usando tubos de compensación de una sola mancha desde el paso 5.2.
   1. Registrar 10.000 células en tubos sin teñir para fijar la puerta negativo para cada intensidad de fluorescencia.
   2. Registrar 10.000 células en otros tubos de compensación de una sola mancha para fijar puerta segura para cada intensidad de fluorescencia.
      NOTA: El software calcula automáticamente los parámetros de compensación.
3. Utilice una muestra de la etapa 5.1 para configurar las puertas de las poblaciones de células clasificadas mediante el registro de 3.000 células. El uso de la intensidad de fluorescencia como parámetros de X y la gráfica del eje Y, población de células diana puerta manualmente como un grupo de puntos aparentemente separados de otros puntos.
   NOTA: Este conjunto gating es flexible y arbitraria en base a los requisitos de los investigadores. Si los investigadores esperan mayor pureza basado en uno o más marcadores, mover la puertasuperior basado en la intensidad de fluorescencia correspondiente.
4. Cargar un tubo de recogida y empezar a ordenar la población de células diana.
5. Mantenga el tubo de recogida en el hielo después de la clasificación hasta que todos los tubos de muestras se realizan.
6. Añadir hielo frío C10 al tubo de extracción de hasta 4 ml, tapa e invierta para mezclar.
7. Centrifugar el tubo de recogida a 800 xg durante 5 min, 4 ° C, y luego aspirar el sobrenadante, dejando alrededor de 200 l con sedimento de células intactas.
8. Añadir 1 ml de hielo frío C10 para volver a suspender el sedimento celular y transferir toda la suspensión de células en un tubo de centrífuga de 1.5 ml.
9. Centrifugar el tubo 1,5 ml a 800 xg durante 5 min, 4 ° C y aspirar el sobrenadante, dejando 100 l con el sedimento de células intactas.
10. Almacenar las poblaciones de células ordenados en hielo hasta su uso.

Resultados

El objetivo de enriquecer la médula ósea PDC con alta pureza, y sin la influencia de otros tipos de células, de MRL / lpr ratones propensos al lupus tanto de la edad joven y viejo para estudiar los cambios funcionales del PDC en cuanto a su capacidad de producir IFN. La primera estrategia de purificación usado fue MCS, que, como muestra la Figura 1, condujo a solamente 7,75% de pureza después de la enriquecimiento. En comparación con los MCS, FACS enriquecido PDC c...

Discusión

The protocol described in this manuscript is for high purity enrichment of live pDC that retain the ability to produce IFNα. The applications of this protocol include, but are not limited to, purification of pDC and/or any other mononuclear cells from the bone marrow of MRL/lpr and any other mouse strains for studies of cellular and molecular functions. Several critical steps in this protocol are to ensure high viability and purity of the sorted pDC. The first key step is the release of bone marrow from bones. To mi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
Fetal bovine serum	HyClone	SH30396.03
Sodium pyruvate	gibco by life technologies	11360-070
MEM non-essential amino acids	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
2-mercaptoethanol	gibco by life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco by life technologies	25030-164
Penicillin-Streptomycin	gibco by life technologies	15140-122
1x Hank’s Balanced Salt Solution	gibco by life technologies	14175-079
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376
MgCl2	SIGMA	M8266
DNase I	SIGMA	D4527
Red blood cell (RBC) lysis buffer	eBioscience	00-4300-54
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Ficoll-Paque Plus
anti-mouse CD19-PE	BD Pharmingen	553786
anti-mouse CD11c-PE	eBioscience	12-0114-82
anti-mouse CD11b-APC-CY7	BD Pharmingen	557657
anti-mouse PDCA-1-FITC	eBioscience	11-3172-81
anti-mouse B220-V500	BD Pharmingen	561226
DAPI	invitrogen	D3571
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec	130-092-786
BD FACSAria I flow cytometer	BD Biosciences	643178
BD FACS Diva version 6	BD Biosciences