Utilizando el compuesto que libera etileno, ácido 2-cloroetilfosfónico, como una herramienta para estudiar la respuesta de etileno en bacterias

Resumen

The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.

Resumen

Ethylene (C₂H₄) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.

Introducción

El etileno olefina (C ₂ H ₄₎ fue descubierto por primera vez como una hormona vegetal en 1901 cuando se observó que las plántulas de guisante, cultivadas en un laboratorio que utiliza lámparas de gas de carbón, exhiben una morfología anormal en la que los vástagos (hipocotilos) eran más cortas, más gruesas y dobladas hacia los lados en comparación con las plantas de semillero de guisantes normales; un fenotipo más adelante llamado el ^1,2 respuesta triple. Estudios posteriores demostraron que el etileno es una fitohormona vital que regula numerosos procesos de desarrollo tales como el crecimiento, la respuesta al estrés, la maduración del fruto y la senescencia ^3. Arabidopsis thaliana, un organismo modelo para la investigación de biología vegetal, ha sido bien estudiado en cuanto a su respuesta al etileno. Varios mutantes de respuesta de etileno se han aislado mediante la explotación del fenotipo triple respuesta observada en la oscuridad de cosecha A. plántulas thaliana en presencia de etileno ^1,4,5. El precursor biosintético para la producción de etileno en las plantas es 1-aácido minocyclopropane carboxílico (ACC) ⁶ y es comúnmente usado para el ensayo de triple respuesta para aumentar la producción de etileno endógeno que conduce a la triple ^1,4,5 fenotipo de respuesta.

Aunque la respuesta de etileno es ampliamente estudiado en las plantas, el efecto del etileno exógeno sobre las bacterias es muy poco estudiado a pesar de la estrecha asociación de bacterias con plantas. Un estudio informó de que ciertas cepas de Pseudomonas pueden sobrevivir usando etileno como única fuente de carbono y energía ^7. Sin embargo, sólo dos estudios han demostrado que las bacterias responden a etileno. El primer estudio demostró que las cepas de Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, y P. syringae eran quimiotáctica hacia etileno usando un ensayo de tapón de agarosa en el que agarosa fundida se mezcló con un tampón de quimiotaxis equilibrada con gas etileno puro ^8. Sin embargo, hasta donde sabemos, no ha habido Furthinformes er utilizando gas de etileno puro para caracterizar la respuesta de etileno bacteriana, probablemente debido a la dificultad de manejo de gases en el laboratorio sin equipo especializado. El segundo informe de respuesta a etileno bacteriana demostró que el etileno se incrementó la producción de celulosa bacteriana y la expresión génica influido en la bacteria asociada a fruta, Komagataeibacter (anteriormente Gluconacetobacter) xylinus ^9. En este caso, el compuesto que libera etileno, se utilizó ácido 2-cloroetilfosfónico (CEPA) para producir etileno in situ dentro del medio de crecimiento bacteriano, evitando la necesidad de gas de etileno puro o equipo especializado.

CEPA produce etileno a una proporción de 1: 1 molar por encima de pH 3.5 a través de un ^10,11, la reacción ¹² de primer orden catalizada por base ^{- 14.} La degradación de la CEPA se correlaciona positivamente con el pH y la temperatura ^13,14 y los resultados en la producción de acetato deeno, cloruro y fosfato. CEPA proporciona a los investigadores interesados ​​en el estudio de las respuestas bacterianas de etileno con una alternativa conveniente a etileno gaseoso.

El objetivo general de los siguientes protocolos es proporcionar un método simple y eficaz para estudiar la respuesta de etileno bacteriana e incluye la validación de los niveles fisiológicamente relevantes de la producción de etileno a partir de la descomposición CEPA en medio de crecimiento bacteriano, el análisis de pH del cultivo para asegurar CEPA descomposición no se vea afectada durante el crecimiento bacteriano, y la evaluación del efecto del etileno sobre la morfología y el fenotipo bacteriano. Demostramos que utilizan estos protocolos K. xylinus, sin embargo, estos protocolos se puede adaptar para estudiar la respuesta de etileno en otras bacterias utilizando el medio de crecimiento apropiado y análisis fenotipo.

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Protocolo

1. Productos químicos

1. Preparar una solución de CEPA 500 mM (144,49 g / mol), y una solución que consiste en tanto NaCl 500 mM (58,44 g / mol) y 500 mM NaH ₂ PO ₄ · H ₂ O (137,99 g / mol) en acidificada (pH 2.5) agua ultra-pura o HCl 0,1 N. Mezclar utilizando un vórtice hasta que las soluciones son claras.
2. En serie diluir (10x) las soluciones 500 mM en el mismo disolvente para obtener 5 mM y 50 mM de existencias.
3. Preparar una solución de 10 mM de 1-aminocyclopropane ácido carboxílico (ACC; 101,1 g / mol) en agua ultra-pura.
4. Filtro-esterilizar las soluciones madre y almacenar alícuotas a -20 ° C.
5. Filtrar esterilizar celulasa. alícuotas se almacenan a 4 ° C.

2. Verificación de Producción de etileno a partir de 2-cloroetilfosfónico Ácido descomposición: Ensayo de Respuesta Triple

1. Superficie-esterilizar Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia Semillas Uso de la fase de vapor Método:
   PRECAUCIÓN: El siguiente paso produce tóxica gas de cloro. Llevar a cabo la esterilización de semillas en una campana de humos.
   1. Obtener un recipiente hermético suficientemente profunda como para dar cabida a un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml para la esterilización de semillas y lo coloca en una campana de humos.
   2. Añadir A. thaliana semillas a un tubo de microcentrífuga y colocar el tubo en una gradilla. Coloque el bastidor que contiene el tubo abierto en el recipiente hermético.
      Nota: No llenar tubos individuales sobre medio lleno para que el gas de cloro para penetrar en las semillas inferiores.
   3. Colocar un vaso de precipitados de 250 ml que contiene 100 ml de lejía comercial en el recipiente sellable. Añadir cuidadosamente 3 ml de HCl concentrado a la lejía y sellar inmediatamente el recipiente con su tapa.
      PRECAUCIÓN: El cloro y HCl reaccionan para producir gas de cloro tóxico que actúa a la superficie a esterilizar las semillas.
   4. Se incuban las semillas en la presencia de gas cloro durante 4 horas en la campana de humos.
      Nota: Los tiempos de esterilización más largos reducen la eficiencia de la germinación.
   5. Después de la esterilización, permitir que el chlorine de gas de ventilación en la campana de humos durante al menos 1 hora y luego sellar el tubo de microcentrífuga. Deje la mezcla de cloro y HCl en la campana de humos durante al menos 24 horas antes de desechar.
      Nota: Las semillas esterilizadas se pueden almacenar a temperatura ambiente para su uso inmediato.
   6. Mantenga semillas a 4 ° C para el almacenamiento a largo plazo. Llevar las semillas a temperatura ambiente antes de abrir el tubo de microcentrífuga para evitar la condensación. Guarde las semillas en la oscuridad.
2. Preparar las placas de agar en placas de Petri 4 del sector (90 x 15 mm):
   1. Preparar 110 ml de medio de crecimiento para A. thaliana plántulas: 1x Murashige y Skoog (MS) medio basal ¹⁵ (4,33 g / L) que contenía 1% (w / v) de sacarosa y 0,8% (w / v) de agar. Ajustar el medio MS a pH 6 con NaOH.
   2. Preparar 100 ml de medio de crecimiento bacteriano para la descomposición CEPA: Schramm y Hestrin (SH) medio ¹⁶ que contiene 1,5% (w / v) de agar. Ajustar el medio SH a pH 7 con NaOH.
   3. Esterilizar en autoclave y medios temper en un baño de agua a 55 ° C.
   4. Una vez que el agar MS ha templado, añadir 40 ml a un matraz estéril. Para preparar el medio de crecimiento control positivo para A. thaliana plántulas, complementan la alícuota 40 ml de agar MS con 40 l de ACC 10 mM para obtener una concentración final de 10 mM ACC.
   5. Añadir 5 ml de medio a los cuadrantes correspondientes de los platos de Petri sectorizadas (Figura 1) y permitir que el agar se solidifique. Preparar todas las placas por triplicado.
      Nota: CEPA no se añade al medio de crecimiento hasta más tarde en el protocolo.

Figura 1:. Configuración de placas de agar utilizados para el ensayo de respuesta triple con CEPA Un diagrama esquemático ilustra los cuadrantes específicos para el control negativo (A), control positivo (B), y las placas experimentales (C). Esta cifra ha sido modificado a partir de Augimeri y ⁹ de la correa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Estratificar A. Las semillas thaliana para asegurar una germinación sincrónico:
   1. Añadir aproximadamente el cincuenta por A. semillas thaliana en cada cuadrante que contiene MS o MS + ACC agar. Asegurarse de semillas se distribuyen uniformemente para facilitar la extracción y el análisis de las plántulas.
   2. Incubar las placas que contienen semillas en la oscuridad a 4 ° C durante 3-4 días.
4. Descomponer CEPA el crecimiento bacteriano Medio (SH) y realizar Triple ensayo de respuesta:
   1. Después de la estratificación, exponer las semillas a la luz fluorescente durante 2 horas.
   2. Spread 10 l de la CEPA mM solución madre 500 en los cuadrantes de las placas de agar que contienen experimentales SH (pH 7; Figura 1) para obtener una concentración final CEPAde 1 mM.
   3. Sellar las placas con película de laboratorio y cubrir con papel de aluminio para crear un ambiente oscuro para las semillas.
   4. Germinar las semillas mediante la incubación de las placas en la oscuridad a 23 ° C durante 3 días con el agar hacia abajo.
      Nota: Las placas pueden ser apiladas, pero los controles negativos se deben colocar en la parte inferior desde el etileno es más ligero que el aire.
5. Analizar Triple respuesta del ensayo de datos:
   1. Con unas pinzas esterilizadas a la llama, retire una plántula de una placa correspondiente a cada tratamiento y vistas bajo un microscopio de disección o digital USB. Asegúrese de que la parte inferior de las plántulas están alineados y la fotografía.
   2. Retire 30 plántulas de cada cuadrante (60 plántulas por repetición biológica y 180 plántulas por tratamiento). Alinear en una superficie con un fondo negro y una fotografía con una regla.
   3. Medir la longitud del hipocotilo (mm) de las plántulas replicados utilizando el software ImageJ ^17. Establecer la escala haciendo clic y arrastrando el recto * *herramienta para seleccionar una longitud de 10 mm. Seleccione "Escala de Ajuste" en la pestaña "Analizar" y ajuste la distancia conocida a 10. Con la herramienta * * segmentado, haga clic y arrastre para seleccionar la longitud del hipocotilo y pulse M para medir la distancia. Comparar las medias de réplicas biológicas utilizando un ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Las diferencias se consideraron significativas si p <0,05.

3. Análisis de pH en todo el crecimiento bacteriano

1. Crecer y cuantificar Komagataeibacter culturas xylinus arranque por triplicado:
   1. Se inocula una sola colonia de K. xylinus en 5 ml de medio SH (pH 5) suplementado con 0,2% (v / v) celulasa esterilizada por filtración. Incubar cultivos a 30 ° C con agitación a 150 rpm hasta una DO ₆₀₀ se alcanza de 0,3 a 0,4 (alrededor de 72 hr).
   2. Cosecha cultivos iniciadores por centrifugación (2.000 xg, 4 ° C, 10 min). Con 5 ml 0,85% estéril (w / v) NaCll solución, lavar las células dos veces y resuspender el sedimento celular. Mantener las células en hielo.
   3. Cuantificar las células utilizando una cámara de recuento de Petroff-Hausser.
2. Inocular cultivos para el análisis de pH:
   1. Añadir 150 ml de caldo de SH (pH 7) suplementado con 0,2% (v / v) de celulasa esterilizada por filtración a doce 500 ml frascos con tapas de aluminio. Inocular matraces con K. cultivos iniciadores xylinus a una concentración de 10 ⁵ células / ml. El uso de los tres cultivos iniciadores, se preparan tres repeticiones por tratamiento biológico.
   2. culturas suplemento con 300 l de las soluciones madre de CEPA mM 5, 50, o 500 para obtener concentraciones finales de CEPA de 0,01, 0,1, y 1,0 mM, respectivamente. Suplemento los cultivos de control no tratados con 300 l de disolvente utilizado para disolver CEPA.
   3. Sellar los matraces con cinta adhesiva firmemente las tapas de papel de aluminio a los matraces y se incuban los cultivos durante 14 días a 30 ° C con agitación a 150 rpm.
3. Cada día, asepticaLLY eliminar muestras de 5 ml de cada matraz y las células de pellets por centrifugación (2.000 xg; 4 ° C; 10 min). Transferencia de los sobrenadantes a un tubo limpio y medir el pH de cada réplica biológica utilizando un medidor de pH.
4. Analizar los datos de tiempo-por supuesto graficando el pH promedio de las réplicas biológicas.
   Nota: Es importante que el pH del cultivo no sea inferior a 3,5; un pH del cultivo de 5 reduce significativamente la liberación de etileno a partir de CEPA, y un pH inferior a 3,5 inhibe completamente la liberación de etileno.
5. Para el control de los niveles de cloro y fosfato, lleve a cabo un experimento idéntico utilizando 0,01, 0,1, y 1,0 mM de la solución de NaCl-NaH ₂ PO ₄ utilizando los, 50, las existencias 5 y 500 mm, respectivamente.

4. Morfología de colonias

1. Crecer K. Los cultivos xylinus de arranque, por triplicado:
   1. Se inocula una sola colonia de K. xylinus en 5 ml de medio SH (pH 5) suplementado con 0,2% (v / v) celulasa esterilizada por filtración. Incubadorasculturas TE a 30 ° C con agitación a 150 rpm hasta una DO ₆₀₀ de 0,3 a 0,4 se alcanza (aproximadamente 72 hr).
   2. Cosecha cultivos iniciadores por centrifugación (2.000 xg, 4 ° C, 10 min). Con 5 ml de solución salina estéril, se lavan las células y luego resuspender el botón celular. Mantener las células en hielo.
2. Preparar 24 placas de agar que contienen 25 ml de SH (pH 7) medio con 1,5% (w / v) de agar.
3. Una vez que el agar se ha solidificado, se extendió 50 l de la 5, 50, y 500 de CEPA mM de soluciones madre en el agar para obtener concentraciones finales de CEPA de 0,01, 0,1, y 1,0 mM, respectivamente. Creados placas de control no tratados y de disolvente, que constan de ninguna modificación y difusión de 50 l de disolvente usado para disolver los compuestos de ensayo.
4. Placas de imagen unidimensional para las colonias aisladas con un bucle completo (~ 5 l) de K. xylinus cultivo iniciador y sellarlos con película de parafina. Inocular todas las placas por triplicado. Incubar las placas durante cinco días a 30 ° C.
5. Fotoograph colonias de 20 aumentos con un microscopio digital USB y la evaluación cualitativa de producción de celulosa y la morfología colonial en medio sólido.
   Nota: Celulosa aparece como una sustancia nebuloso lo largo del margen de la colonia.
6. Para el control de los niveles de cloro y fosfato, lleve a cabo un experimento idéntico utilizando 0,01, 0,1, y 1,0 mM de la solución de NaCl-NaH ₂ PO ₄ utilizando los, 50, las existencias 5 y 500 mm, respectivamente.

5. Ensayos de película

1. Crecer y cuantificar K. Los cultivos xylinus de arranque, por triplicado:
   1. Por triplicado, inocular una única colonia de K. xylinus en 5 ml de medio SH (pH 5) suplementado con 0,2% (v / v) celulasa esterilizada por filtración. Incubar cultivos a 30 ° C con agitación a 150 rpm hasta una DO ₆₀₀ se alcanza de 0,3 a 0,4 (alrededor de 72 hr).
   2. Cosecha cultivos iniciadores por centrifugación (2.000 xg, 4 ° C, 10 min). Con 5 ml de solución salina estéril, lavar tél células dos veces y volver a suspender el sedimento celular. Mantener las células en hielo.
   3. Cuantificar las células utilizando una cámara de recuento de Petroff-Hausser.
2. Preparar las mezclas maestras para inocular placas de 24 pocillos:
   1. Suplemento 60 ml de medio SH (pH 7) con 120 l de la 5, 50, y las poblaciones de 500 mM de CEPA para obtener concentraciones finales de CEPA de 0,01, 0,1, y 1,0 mM, respectivamente. Suplemento otros 60 ml de medio SH (pH 7) con 120 l de disolvente utilizado para disolver CEPA. Vórtice para mezclar.
   2. Dividir cada una de 60 ml de CEPA que contienen medio en cuatro alícuotas de 14 ml. Inocular tres de los 14 ml alícuotas con réplicas biológicas de cultivo iniciador a una concentración de 10 ⁵ células / ml. Mantenga los tubos con las células en hielo para evitar la producción de celulosa.
      Nota: La alícuota restante 14 ml se utilizará para los pocillos de control estériles.
3. Inocular placas de 24 pocillos:
   1. Pruebe cada tratamiento en su propio plato con tres filas de réplicas biológicas yuna fila de controles estériles (Figura 2).

Figura 2:. Diagrama de flujo que ilustra el protocolo utilizado para el ensayo de película y el análisis complementado-CEPA Stock medio SH pH 7 (60 ml) se dividió en alícuotas de tres inoculaciones repetidas biológica separada y un control estéril (14 ml cada uno). Estos cultivos se dividen en partes alícuotas en seis repeticiones técnica (2 ml) en una placa de 24 pocillos y luego se sellan con película de parafina. Después de la incubación durante 7 días a 30 ° C, unas películas se cosechan y se caracterizan por la determinación del peso en húmedo, grosor, peso seco, y la cristalinidad mediante FT-IR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura

2. El uso de la mezcla maestra de 14 ml, añadir 2 ml en EACh de seis pocillos de una placa de 24 pocillos estériles. Completar las tres repeticiones biológica y el control estéril (Figura 2). Repita este procedimiento para cada tratamiento.
3. placas de sellado con película de parafina y se incuba estáticamente durante 7 días a 30 ° C.

4. Medir la cosecha y Pellicle Wet peso, grosor, peso seco (rendimiento de celulosa) y la cristalinidad (Figura 2):
   1. Presione un lado de la película para elevar el borde película contrario y eliminar unas películas individuales con fórceps. Al tiempo que mantiene el agarre, colocarlos sobre una toalla de papel limpia durante 3 segundos para eliminar el exceso de medio antes de pesar para determinar sus pesos en húmedo.
   2. Alinear unas películas adyacentes a un gobernante y una fotografía de la cara usando una cámara digital de alta resolución.
   3. El uso de software ImageJ ^17, medir el espesor de película en el hombro izquierdo, hombro derecho y el centro de cada película. Un promedio de todos los técnicos repeticiones para cada RepliCat biológicami.
   4. Individualmente transferir las unas películas en los pocillos de una placa de 6 pocillos. El tratamiento de unas películas con 12 ml de NaOH 0,1 N a 80 ° C durante 20 minutos para lisar las células.
   5. Retire el NaOH y neutralizar unas películas mediante el lavado con agua ultra pura durante 24 horas con agitación. Cambie el agua cada 6 horas.
      Nota: unas películas deben ser de color blanco tras la finalización de la etapa de lavado.
   6. Coloque unas películas en las esteras de silicio y seco a 50 ° C durante 48 horas hasta peso constante. Una vez seco, retirar de esteras y medir los pesos peliculares en una balanza analítica para determinar el rendimiento de celulosa bacteriana.
   7. Analizar cristalinidad película usando transformada de Fourier espectroscopia de infrarrojos (FT-IR) usando 32 barridos y una resolución de 4 cm ^-1 en el rango de 4.000 a 650 cm ^-1. Calcular el índice de cristalinidad, CI (IR), usando un ₁₄₃₇ / A _895; la relación de absorbancia de la "banda cristalina" y "banda amorfa", como se ha descrito previamente ^18.
5. Para el control de los niveles de cloro y fosfato, lleve a cabo un experimento idéntico utilizando 0,01, 0,1, y 1,0 mM de la solución de NaCl-NaH ₂ PO ₄ utilizando los, 50, las existencias 5 y 500 mm, respectivamente.
6. Analizar Pellicle datos:
   1. Calcular la hidratación película mediante la determinación de la diferencia entre la película de peso húmedo y el peso seco.
   2. La media de los valores de todas las repeticiones técnica para obtener un valor único para cada réplica biológica para el análisis estadístico. Comparación de tratamientos usando un ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Las diferencias son significativas si p <0,05.
   3. Normalizar los datos como el porcentaje de los controles no tratados y trazar los medios de réplicas biológicas.

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Resultados

Una configuración de placa esquemática para la verificación de la liberación de etileno de CEPA en medio SH (pH 7) mediante el ensayo de triple respuesta se muestra en la Figura 1A - C. Un diagrama de flujo que ilustra el protocolo de película se muestra en la Figura 2. Dark-adulto A. thaliana plántulas exhiben el fenotipo de triple respuesta (hipocotilo corto y más grueso con un gancho apical exagerada) en presencia de A...

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Discusión

Los métodos descritos aquí describen la producción in situ de etileno a partir de CEPA para el estudio de la respuesta de etileno bacteriana usando el organismo modelo, K. xylinus. Este método es muy útil como etileno puede ser producido por complementar cualquier medio acuoso que tiene un pH mayor que 3,5 ^10,11 con CEPA negando la necesidad de gas de etileno puro o equipo de laboratorio especializado. Este método no se limita a estudiar los efectos del etileno CEPA derivados de bacter...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC)	Sigma	A3903	Biosynthetic precursor of ethylene in plants
4-sector Petri dish	Phoenix Biomedical	CA73370-022	For testing triple response
Agar	BioShop	AGR001.1	To solidify medium
Canon Rebel T1i DLSR camera	Canon	3818B004	For pictures of pellicles
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921	Sigma	C2730	Aqueous solution
Citric acid	BioShop	CIT002.500	For SH medium
Commercial bleach	Life Brand	57800861874	Bleach for seed sterilization
Concentrated HCl	BioShop	HCL666.500	Hydrochloric acid for pH adjustment
Digital USB microscope	Plugable	N/A	For pictures of colonies
Ethephon (≥96%; 2-chloroethylphosphonic acid)	Sigma	C0143	Ethylene-releasing compound
Glucose	BioBasic	GB0219	For SH medium
Komagataeibacter xylinus ATCC 53582	ATCC	53582	Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium
Microcentrifuge tube	LifeGene	LMCT1.7B	1.7 ml microcentrifuge tube
Murashige and Skoog (MS) basal medium	Sigma	M5519	Arabidopsis thaliana growth medium
Na2HPO4·7H2O	BioShop	SPD579.500	Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium
NaCl	BioBasic	SOD001.1	Sodium chloride for saline and control solution
NaH2PO4·H2O	BioShop	SPM306.500	Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution
NaOH	BioShop	SHY700.500	Sodium hydroxide for pH adjustment
Paraffin film	Parafilm	PM996	For sealing plates and flasks
Peptone (bacteriological)	BioShop	PEP403.1	For SH medium
Petroff-Hausser counting chamber	Hausser scientific	3900	Bacterial cell counting chamber
Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm	VWR	28145-501	For sterilizing cellulase
Sucrose	BioShop	SUC600.1	Sucrose for MS medium
Yeast extract	BioBasic	G0961	For SH medium