La visualización de frecuencia Stromule con microscopía de fluorescencia

Resumen

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Resumen

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Introducción

Chloroplasts are dynamic organelles in plant cells responsible for photosynthesis and a host of other metabolic processes. Signaling pathways from the chloroplast also exert significant influence on plant physiology and development, coordinating plant responses to environmental stress, pathogens, and even leaf shape^1-6. Recently, biologists have gained interest in a poorly understood aspect of chloroplast structure: stromules, very thin stroma-filled tubules that extend from the surface of the chloroplast⁷.

The biological functions of stromules remain unknown, although stromule frequency is known to vary in response to environmental stimuli^7-9, and stromules may be capable of transmitting signaling molecules between organelles⁶. All types of plastids (not only the green, photosynthetic chloroplasts, but also clear leucoplasts, starch-filled amyloplasts, and pigmented chromoplasts, to name a few types of plastids) make stromules, and stromules are found in all land plant species that have been examined to date. Stromules can extend and retract dynamically, appearing or disappearing within seconds, or they can remain relatively stationary for long times. One of the major hurdles facing stromule biologists is that stromules are often studied using dramatically different methods, tissues, and species, making comparisons across the stromule biology literature difficult. Going forward, standard practices and thorough descriptions of the experimental systems used to study stromules will be critical to discovering the function of these ubiquitous features of chloroplast morphology.

Here we describe methods for visualizing stromule formation in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana leaves. In the mesophyll, chloroplasts are densely packed into large, three-dimensional cells, which makes it difficult to accurately and rapidly visualize stromules by confocal microscopy. By contrast, epidermal cells are relatively flat, contain fewer chloroplasts, and are at the surface of the leaf, allowing for easy and rapid visualization of stromules. N. benthamiana is an ideal model system for these experiments because, unlike many plant species, all cells in the epidermis of N. benthamiana make chloroplasts¹⁰. In the epidermis of most plants, including Arabidopsis thaliana, only the stomatal guard cells have chloroplasts, while other epidermal cells have "leucoplasts", plastids that are clear, relatively amorphous, and nonphotosynthetic^9,11,12. Thus, whereas a single field of view of an A. thaliana epidermis might show only a handful of chloroplasts in a pair of guard cells, a field of view of an N. benthamiana epidermis will include dozens or even hundreds of chloroplasts. All of the methods described here, however, can be modified to investigate other questions in stromule biology; for example, we have used the same approach to study leucoplast stromules of A. thaliana⁹.

Protocolo

NOTA: Para este protocolo, se han centrado en el ensayo de la frecuencia stromule en la epidermis de N. deja benthamiana. Varias líneas transgénicas estables que se han generado que se puede utilizar para este propósito, incluyendo 35S _PRO: FNRtp: EGFP ¹³ y NRIP1: Cerulean ^6. Ambas líneas muestran la expresión robusta de fluoróforos en el estroma del cloroplasto de hojas cultivadas en una amplia gama de condiciones. Alternativamente, fluoróforos cloroplasto orientada se pueden expresar de forma transitoria en N. benthamiana utilizando Agrobacterium Transformaciones ^13. Esto es menos ideal que las líneas transgénicas, ya que las infiltraciones de Agrobacterium inducen unas respuestas de defensa basal en N. benthamiana y las interacciones con Agrobacterium pueden alterar la frecuencia stromule en la hoja ^14, lo que podría complicar la interpretación de los resultados. Por último, para visualizar la formación de stromule in vitro,cloroplastos pueden ser extraídos de cualquier especie vegetal, ya sea utilizando fluoróforos genéticamente codificados o un colorante fluorescente, tal como se describe en la sección 5 a continuación. ^9,15

NOTA:. Métodos detallados de cultivo de plantas se han descrito previamente ¹⁶ Brevemente, crecer N. benthamiana plantas en macetas de 4 "con cualquier mezcla de tierra profesional que ofrece un buen drenaje. Cubra plántulas con una cúpula de plástico transparente para los primeros 10-14 días para proporcionar un ambiente húmedo para la germinación. añadir cualquier mezcla de fertilizante estándar siguiendo las instrucciones del fabricante para 14- plantas días de edad. cultivar plantas bajo luz blanca, utilizando ~ 100 mmol fotones ^{m-2 s-1} de intensidad de luz. Las plantas de agua con regularidad.

1. Preparación de muestras de hojas para la visualización

NOTA: la dinámica Stromule se ven afectados por hiriendo a ^8, por lo que la preparación del tejido debe llevarse a cabo inmediatamente antes de visualizar stromules por microscopía de fluorescencia confocal. Idealmente, una muestra debe ser visualizado con 15 min después de la eliminación de la planta.

1. Cortar una pequeña sección de la hoja usando una hoja de afeitar muy agudo. Utilice siempre la misma región de la hoja de coherencia, y estar seguro de visualizar la misma superficie (adaxial o abaxial) en todos los experimentos.
2. Inmediatamente después de cortar la sección de hoja, sumergir la sección de hoja en un 5 ml jeringa sin aguja llena de agua, eliminar el aire de la jeringa, y aplicar un vacío al cubrir el orificio de la jeringa con un dedo y tirando del émbolo.
   1. Liberar el émbolo suavemente para evitar daños en la sección de la hoja. Repita esto dos o tres veces, o hasta que la mayor parte del aire se ha eliminado y la hoja parece ser de color verde oscuro.
      NOTA: Este paso elimina el aire de la hoja que puede interferir con la visualización precisa de stromules.
3. Añadir una gota de agua a un portaobjetos y colocar la hoja en la sección de esta caída. A continuación, añadir otro drop de agua a la parte superior de la hoja, y colocar un cubreobjetos sobre la hoja. Si hay burbujas de aire, golpee suavemente la hoja de la cubierta hasta que se eliminan. El portaobjetos ahora está listo para la microscopía, y debe ser visualizado inmediatamente.

2. Visualizar Stromules con confocal de microscopía de fluorescencia

1. Con luz transmitida, se centran en un campo de visión cerca del centro de la sección de la hoja (lejos de las células dañadas por la cuchilla de afeitar). Utilice un objetivo 20X de modo que muchos cloroplastos pueden ser visualizadas simultáneamente. Guardar una imagen con luz transmitida de modo que los tipos de células se pueden distinguir después, si es necesario.
2. Cambiar la fuente de iluminación a un láser con filtros de excitación y emisión apropiados para ser usado fluoróforo. Por ejemplo, excitar GFP con un láser de 488 nm y recoger las emisiones entre 500 nm y 525 nm.
   1. El uso de software del microscopio, seleccionar el canal GFP y haga clic para ajustar la apertura del agujero de alfiler de 1 Airy unidad. Seleccionar escaneo láser, para iniciar la visualización de la muestra, y luego haga clic en el canal de GFP para ajustar la intensidad del láser y la ganancia del detector para minimizar la potencia del láser al mismo tiempo visualizar claramente stromules. Una vez que se han determinado estos valores, los mantenga lo más constante posible a lo largo de todos los experimentos.
3. Preparar un experimento -stack z que recogerá una serie de imágenes a través de la epidermis de la hoja en el campo de visión.
   1. Para el -stack z, incluir todos los cloroplastos epidérmicas en el campo de visión para evitar el sesgo (por ejemplo, si los cloroplastos cerca de la superficie de las hojas tienen más stromules en condiciones ensayadas).
   2. Tomar imágenes en el intervalo máximo posible, que incluirá todos los stromules sino reducir al mínimo el tiempo necesario para que una -stack z. Por ejemplo, si 1 unidad de Airy es equivalente a una sección confocal de enfoque que es 2 m de profundidad, teniendo una imagen cada 2 micras es probable ideal.
      NOTA: La hoja epidermis es una superficie irregular, por lo que la profundidad total de la z -stack variará dependiendo de la muestra; la mayoría de -stacks z requerirán 10-20 imágenes, pero pueden incluir más.
   3. Ajustar la velocidad de exploración y la resolución de la imagen si es necesario para asegurarse de que el -stack z es recogida rápidamente (normalmente dentro de 5-10 minutos, si es posible). Guarde el -stack z para su posterior análisis.

Procesamiento 3. Imagen

1. Determinar la frecuencia stromule usando cualquier software de análisis de imágenes. Para este protocolo, se recomienda utilizar ImageJ, que está disponible públicamente de los Institutos Nacionales de Salud (http://imagej.nih.gov/ij/), o la actualización popular de ImageJ, Fiji (http://fiji.sc / Fiji).
2. Combinar la -stack z en una sola imagen con la proyección de intensidad máxima en el software.
3. Identificar y contar manualmente todos los cloroplastos en la imagen.
4. Para cada cloroplasto, determinar visualmente si una o más stromulesson vistas que se extiende desde el cloroplasto en la imagen de la z fusionada -stack. Para ejemplos, véase la figura 1.
   NOTA: Dado que no se conocen las funciones biológicas de stromules, ninguna, estroma llenas, extensión tubular delgada del cloroplasto puede ser considerado un "stromule", independientemente de la longitud. Como regla general, una extensión de estroma llenas desde el cloroplasto es un stromule si es menos de aproximadamente 1 m de diámetro a lo largo de la mayor parte de su longitud ^7. Asegúrese de que una persona se analizan todas las imágenes para controlar las diferencias subjetivas en la determinación de si o no un cloroplasto tiene una stromule. Un segundo investigador debe verificar de forma independiente las frecuencias stromule para reducir aún más los sesgos subjetivos.

4. Diseño Experimental y Toma de Muestras

NOTA: Stromule frecuencia es muy variable entre las hojas, pero varios informes sugieren que hay poca variación en la frecuencia stromule dentro de un indivi^9,17 hoja dual.

1. Calcular la frecuencia hoja stromule de un solo campo de visión de una hoja. Desechar la hoja, y considerar esta una muestra independiente. No considere campos separados de vista de una hoja como muestras independientes.
   NOTA: No hay un fuerte consenso sobre la forma de mejores miden los cambios en la actividad stromule, y hasta que la función de stromules se define más claramente, los investigadores deben seguir siendo creativa en la cuantificación de la dinámica stromule. Para la comparación a través de la literatura, sin embargo, las normas comunes de presentación de informes se deben utilizar, además de los enfoques más creativos. Como mínimo, siempre informar de la frecuencia de cloroplastos que tienen uno o más stromules.
2. Determinar la frecuencia de cloroplastos que tienen stromules en un campo de visión. Utilice ImageJ para identificar todos los cloroplastos en un campo de visión. Entonces, para cada cloroplasto, determinar si el cloroplasto se ha formado al menos un stromule. Informe de frecuencia stromule como el Percentage de los cloroplastos con una stromule.
   NOTA: Algunos investigadores transforman el porcentaje, por ejemplo, con la transformación arcoseno, antes de informar de frecuencias stromule; mientras que esta es una opción para el análisis estadístico, el arco seno de la frecuencia stromule no es un valor intuitivo, y no necesita ser informado en el texto principal o cifras de un estudio.
   1. Como un enfoque alternativo, contar el número total de stromules, y se divide por el número total de los cloroplastos.
      NOTA: En circunstancias normales, esto va a producir resultados similares de acercarse a 4,2; puede sobreestimar la frecuencia stromule, sin embargo, si un solo cloroplasto ha formado muchos stromules. En el ejemplo mostrado en virtud de los resultados representativos, por ejemplo, varios cloroplastos tienen dos o más stromules, elevando el número de stromules por cloroplasto a 40/87 (en comparación con una frecuencia stromule de 33/87).
   2. Como alternativa, determinar la longitud stromule lugar de la frecuencia stromule. La longitud se puede mediren ImageJ trazando el stromule con la herramienta de línea a mano alzada.
      NOTA: Como el papel biológico de stromules sigue siendo desconocida, no está claro que la longitud stromule afecta a su función. Reportar diferencias significativas en la duración stromule si se observan, sino también informar de las frecuencias stromule (como se describe en el apartado 4.2).
      NOTA: frecuencia Stromule puede ser muy variable entre diferentes hojas en las mismas condiciones de crecimiento. Por lo tanto, aunque la determinación de la frecuencia stromule puede llevar mucho tiempo, los experimentos deben ser cuidadosamente diseñadas para incluir muestras de gran tamaño. El uso de conjuntos de datos de nuestro laboratorio, se determinó que un tamaño de muestra de al menos 16 plantas para cada tratamiento es por lo general suficientemente potente para determinar si hay una diferencia estadísticamente significativa de al menos un cambio de 1,5 veces en la frecuencia stromule entre dos condiciones (con la norma α = 0,05 y β = 0,80).
3. El análisis estadístico de los resultados.
   1. Para comparar el youn stromule frecuencias de dos tratamientos, use la prueba t de Welch (también conocida como la prueba de la prueba t o t heterocedástico suponiendo una varianza desigual).
      NOTA: Esta prueba no es tan poderoso como prueba de la t de Student convencional, pero la prueba t de Welch es ventajoso porque no asume que la variación en la distribución de frecuencias stromule es similar entre los tratamientos.
      NOTA: Dado que la frecuencia stromule es una "proporción", su distribución muestral se prevé que sea binomial en lugar de lo normal, que podrían análisis estadístico teóricamente sesgo si los tamaños de las muestras son muy bajos o si la frecuencia stromule es muy bajo (cerca del 0%) o muy alta (cerca de 100%). Algunos informes han utilizado transformaciones arcoseno antes del análisis estadístico, que está destinado a transformar una distribución binomial a una distribución normal, y así satisfacer los requisitos de la norma de prueba de la t de Student o ANOVA. En la práctica, sin embargo, unarcsine transformaciones tienen poco o ningún efecto sobre el análisis estadístico, y por lo tanto no se recomiendan. En su lugar, repetir los experimentos para aumentar el tamaño de la muestra, lo que aumentará la potencia estadística y reducir los errores en la interpretación de los datos.
   2. Cualquiera sea el enfoque estadístico se utiliza, asegúrese de informar cuidadosamente la estrategia de muestreo, tamaño de la muestra, prueba estadística, y el valor de p para cada experimento.
      NOTA: Al igual que con otros campos de la biología, un valor de p inferior a 0,05 se puede considerar "estadísticamente significativa", aunque los investigadores deben informar sin duda el valor p obtenido precisa. Si p es ligeramente por encima de 0,05, el aumento de tamaño de la muestra con dos o tres experimentos puede ayudar a clarificar si o no la diferencia observada es reproducible y estadísticamente significativa.

5. La extracción de cloroplastos intactos para visualizar Stromule Dinámica

NOTA: Existen varios métodosse han utilizado para aislar los cloroplastos de las hojas, incluyendo un protocolo ligeramente diferente en un estudio reciente sobre la formación de stromule in vitro ^15. El protocolo se detalla a continuación utiliza un método relativamente simple que no dió muestras cloroplasto bioquímicamente puros, pero en lugar aislar una gran cantidad de cloroplastos, sanos intactos ^9,18.

1. Preparar tampón de extracción frío: NaOH Hepes 50 mM, sorbitol 330 mM, EDTA 2 mM, 1,0 mM MgCl _2, y MnCl 1,0 mM _2. Ajustar el pH a 6,9 con NaOH y HCl, y refrigerar antes de su uso.
   NOTA: Aunque no es necesario, utilizando tampones fríos y conservación en hielo cuando sea posible dará lugar a una mayor proporción de cloroplastos intactos.
2. Preparar tampón de aislamiento: NaOH Hepes 50 mM, sorbitol 330 mM, EDTA 2 mM, 1,0 mM MnCl _2, mM MgCl ₂ mM, KCl 10, y 1,0 NaCl 1,0 mM. Ajustar el pH a 7,6 con NaOH y HCl y refrigerar antes de su uso.
3. Si las hojas no sonexpresar un fluoróforo estromal codificado genéticamente, preparar diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) solución: CFDA 50 mM solución madre en dimetil sulfóxido (DMSO) (2,3 mg CFDA por 1,0 ml DMSO).
   NOTA: La concentración exacta no es crítica. Mantenga CFDA de valores en la oscuridad en todo momento. Almacenar pequeñas alícuotas de CFDA 50 mM a -20 ° C.
4. Para el aislamiento de cloroplastos, retire ~ 5-10 g de hojas de varias plantas y enjuagar brevemente en agua fría. transferir inmediatamente a 50 ml de tampón de extracción en frío. Moler las hojas utilizando una licuadora con varios pulsos cortos. Filtrar a través de dos o tres capas de gasa para eliminar los desechos de la hoja, dividir los cloroplastos extraídos en dos tubos de 50 ml de centrífuga y centrifugar durante 1 min a 750 x g.
5. Eliminar el sobrenadante y resuspender los cloroplastos verdes en tampón de aislamiento 10 ml. Centrifugar de nuevo durante 1 min a 750 xg, desechar el sobrenadante, y los cloroplastos resuspender en tampón de aislamiento para llevar el volumen final a 5 ml.
6. Transferencia 201; l de los cloroplastos a una diapositiva, cubrir con un cubreobjetos, y comenzar la microscopía.
   NOTA: Los cloroplastos de las plantas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes plastid orientada ahora están listos para la visualización por microscopía de fluorescencia confocal.
7. Manchar los cloroplastos de las plantas que no están expresando proteínas fluorescentes plastid orientada para visualizar stromules.
   1. Añadir 5 l de 50 mM CFDA a los 5 ml cloroplastos a suspender en tampón de aislamiento. Llevar la concentración final a 50 mM.
   2. Permitir a los cloroplastos incubar durante 5 minutos, y luego transferir una pequeña alícuota (~ 50 l) a una diapositiva, cubren con un cubreobjetos, y comienzan microscopía.
   3. Use un filtro para FITC o GFP. Utilice un objetivo de 20X para visualizar muchos cloroplastos de forma simultánea, o un objetivo superior para visualizar un solo cloroplasto aislado.
      NOTA: CFDA será fluorescente en el interior del estroma de los cloroplastos intactos.
   4. Si hay una fuerte fluorescencia de fondo, lavar el Chloroplasts de nuevo en 10 ml de tampón de aislamiento después de la 5 min de incubación con CFDA, centrifugar durante 1 min a 750 xg, desechar el sobrenadante, y resuspender en 5 ml de tampón de aislamiento.

Resultados

Este protocolo se utiliza para visualizar la frecuencia stromule en el día y por la noche en los cotiledones de joven N. plántulas benthamiana. Rebanadas de una pila z se fusionaron en una sola imagen (Figura 1A). Para los propósitos visuales, que la imagen fue entonces desaturado y se invierte de manera que el estroma aparece en negro (Figura 1B). Los cloroplastos se marcaron o bien como no tener stromules (asterisco verde)...

Discusión

Al investigar stromules, tres factores importantes deben ser considerados a lo largo de: (i) la manipulación del tejido de la planta deben mantenerse a un mínimo absoluto, (ii) el sistema experimental debe mantenerse constante, y (iii) las estrategias de muestreo debe ser planeada cuidadosamente para asegurar robusta, se analizan los datos reproducibles.

Stromules son muy dinámicas: se pueden extender y retraer rápidamente ante los ojos de un observador bajo el microscopio. Por otra part...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Laser Scanning Confocal Microscope	Carl Zeiss Inc	Model: LSM710
Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	EMD	MX1458-6
Waring blender	Waring	Model: 31BL92
Fiji	fiji.sc		Open-source software for analyzing biological images