Virus Zika Sistema infecciosa cultivo celular y la<em&gt; In Vitro</em&gt; Profiláctica Efecto de los interferones

Resumen

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Resumen

Zika Virus (ZIKV) es un patógeno emergente que está vinculado a anomalías en el desarrollo del feto, como microcefalia, defectos oculares y problemas de crecimiento. ZIKV es un virus ARN de la familia Flaviviridae. ZIKV se transmite principalmente a través de los mosquitos, pero también puede ser transmitida por la madre a la transmisión vertical del feto, así como el contacto sexual. Hasta la fecha, no existen opciones de tratamiento o vacunas fiables disponibles para proteger a las personas infectadas por el virus. El desarrollo de un sistema reproducible y eficaz de virus Zika infecciosa cultivo celular es fundamental para el estudio de los mecanismos moleculares de la replicación ZIKV así como el desarrollo de medicamentos y vacunas. En este sentido, se informa aquí un protocolo que describe un sistema de mamífero basado en células in vitro Zika virus de cultivo para el análisis de la producción y el crecimiento viral. Se presentan detalles sobre la formación de placas por el virus Zika en una monocapa de células y la placa de ensayo para medir el título viral. la cinética de replicación del genoma viraly los intermedios replicatory de doble cadena de ARN del genoma se determinan. Esta plataforma de cultivo se utiliza para la pantalla contra una biblioteca de un pequeño conjunto de citoquinas que resultan en la identificación de interferón α (IFN-α), IFN-β y IFN-γ como inhibidores potentes de crecimiento viral Zika. En resumen, un sistema in vitro infecciosa viral Zika la cultura y diversos ensayos virológicos se ponen de manifiesto en este estudio, que tiene el potencial de beneficiar en gran medida la comunidad de investigación para dilucidar aún más los mecanismos de patogénesis viral y la evolución de la virulencia del virus. Antiviral de IFN-alfa más se puede evaluar como profiláctico posterior a la exposición, y la opción profiláctica, el tratamiento de las infecciones por virus Zika en poblaciones de alto riesgo, incluidas las mujeres embarazadas infectadas.

Introducción

Zika Virus (ZIKV) es un importante patógeno humano asociado con microcefalia y los pobres resultados del embarazo ^1,4. ZIKV pertenece al conjunto de los flavivirus médicamente relevantes que pueden causar defectos neurológicos tales como el dengue, del Nilo Occidental, y virus de la encefalitis de San Luis. El principal modo de transmisión viral es por el mosquito vector Aedes aegypti, y, además, la transmisión sexual también se ha informado de ^5,6. ZIKV se ha convertido en un problema de salud mundial importante debido a la expansión de la distribución geográfica del mosquito vector y su fuerte correlación con defectos de nacimiento. ZIKV primero fue aislado en 1947 a partir de un mono rhesus centinela en el bosque Zika, Uganda y el primer caso humano se informó en 1952 ^7,8. Los individuos que se infectan con ZIKV presentarse con síntomas leves como fiebre, erupción cutánea, dolor de cabeza, conjuntivitis, dolor muscular y / conjunta. Las mujeres embarazadas infectadas pueden transmitir ZIKV al feto en desarrollo ^1. ZIKV infección también se ha relacionado con el síndrome de Guillain-Barre, un trastorno del nervio periférico desmielinización autoinmune ^9.

El genoma viral Zika consiste en un sentido positivo, molécula de ARN de cadena simple que es de aproximadamente 10,8 kilobases de longitud. La estructura del genoma está organizado como 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, con las regiones no codificantes (NCR) que flanquean una región codificadora de proteínas ^6. Una sola poliproteína (3419 aa) se traduce en que es co- y post-translacional escindido en 10 péptidos más pequeños. Tanto el 5'NCR y las estructuras de tallo-bucle de ARN 3'NCR juegan un papel crítico en el inicio de la traducción del genoma viral y la replicación. Los componentes estructurales del genoma se componen de las proteínas de la cápside, de membrana, y el sobre. Las proteínas no estructurales son críticos para la replicación del genoma.

En la actualidad, las cepas virales Zika se agrupan en tres genotipos principales: África Occidental, África Oriental y Asia ^6,10-13. Se ha propuesto que el linaje de África Oriental extendido a África Occidental y Asia, donde más tarde se convirtió otros ^12. El genotipo asiático es responsable de los brotes actuales en las Américas. virus Zika se puede cultivar tanto en mosquitos y células de mamíferos. Fibroblastos primarios dérmicas, células dendríticas inmaduras, células progenitoras neuronales corticales y células Vero son susceptibles a la infección viral Zika ^10,14,15. Ambos tipo I y tipo II interferones han demostrado restringir el crecimiento ZIKV en fibroblastos de la piel ^15. Los objetivos de este estudio son proporcionar un protocolo detallado paso a paso para la producción y ensayando del genotipo asiático ZIKA PRVABC59 cepa viral en un sistema de cultivo de células de mamíferos y para demostrar la utilidad de este sistema de cultivo infecciosa como una plataforma de desarrollo de fármacos. Este recurso tiene el potencial de beneficiar en gran medida la comunidad de investigación neurológica viral y Zika para esclarecer aún más its mecanismos de patogénesis viral y la evolución de la virulencia del virus.

Protocolo

Nota: Un plan esquemático del flujo de trabajo se presenta en la Figura 1.

1. Las células

1. Utilizar células Vero para la producción de virus Zika y análisis de ciclo de replicación viral.
2. Preparar medio completo de crecimiento que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 unidades / ml), y HEPES 10 mM.
3. Células Vero de cultivo con el medio de crecimiento completo especificado a 37 ° C con 5% de CO _2.

2. Zika Virus Producción

1. Recoger las células Vero a una densidad celular del 80% utilizando tripsina al 0,25% en T-75 frasco y contar las células.
   1. Aspirar los medios de comunicación del matraz de cultivo T-75 y enjuagar las células con 2 ml de tampón fosfato salino (PBS).
   2. Añadir 2 ml de tripsina al 0,25% y se incuba el matraz a 37 ° C durante 5 min.
   3. Añadir 8 ml de suero que contienen medio de crecimiento para inactivar la tripsina. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para el SUScélulas Pend y transfieren las células a un tubo de 15 ml.
   4. Retire 10 l de células y se mezcla con la misma cantidad de 0,4% de azul de tripano. Cargar la mezcla preparada a la diapositiva cámara de recuento celular y obtener recuentos de células viables utilizando un contador de células automatizado.
2. Sembrar un total de 7 millones de células en un volumen de 30 ml en un matraz T-160.
3. El día siguiente, preparar una multiplicidad adecuada de infección (MOI de 0,01 a 0,1) de Zika inóculo del virus en un medio de cultivo libre de suero de 10 ml por matraz.
4. Retire el medio gastado del matraz T-160 y luego añadir el inóculo viral recién preparado (10 ml).
5. Incubar los matraces inoculados en 37 ° C con 5% de _CO2 durante 4-6 horas. Difundir el inóculo inclinando suavemente los frascos de lado en cada hora.
6. A la finalización de la incubación, reemplazar el inóculo con el medio caliente suplementado con suero de crecimiento (30 ml) para cada matraz. Luego continuar con el cultivo viral para el próximo 96 h.
7. Verificar la progresión de eninfección mediante la observación de la aparición de placas virales en la monocapa de células utilizando un microscopio de contraste de fase y tomar imágenes (Figura 2), según sea necesario a 40X y 200X aumentos.

Figura 2:. Las placas formadas por el virus Zika en una monocapa de células Vero imágenes de campo claro de diversas ampliaciones muestran zonas de virus Zika a las 48 hpi. Cabe destacar la presencia de focos de células redondeadas en la monocapa. (Barra de escala = 50 micras) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

8. Cosecha sobrenadantes de cultivo celular en el punto de tiempo de 96 hr y se centrifuga el sobrenadante a 300 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar los restos celulares.
9. Retirar con cuidado el sobrenadante sin restos peletizado inquietante y transferencia de to tubos de 15 ml. Ultracentrifugación a 24.000 xg se puede realizar para concentrar las partículas virales (opcional).
10. Almacenar los sobrenadantes de los cultivos virales en múltiples alícuotas a -80 ° C.

3. Medir Zika título del virus mediante ensayo en placa

1. Las células Vero ingenuas de semillas a 1 x 10 ⁵ células por pocillo en 2 ml de volumen utilizando una placa de 12 pocillos.
2. Al día siguiente, se preparan 10 diluciones seriadas de sobrenadantes de cultivos virales obtenidos de los T-160 matraz utilizando un medio libre de suero. Retire el material usado de cada pocillo y añadir 400 l de inóculo preparado en células Vero por triplicado.
3. Se incuban los matraces inoculados en 37 ° C con 5% de _CO2 durante 4-6 horas. Difundir el inóculo inclinando suavemente la placa de lado en cada uno hr.
4. Al final de la incubación, reemplazar el inóculo con medio de suero suplementado (2 ml por pocillo).
5. A las 48 horas después de la inoculación, contar el focos virales usando una fase contrast microscopio. Calcular el título viral como unidades formadoras de placas (PFU) por ml. Vea la Figura 3 para el ensayo de placa.
6. Fijar y teñir las células en 4% de formaldehído y solución de cristal violeta 0,1% preparados en 20% de etanol durante clara visualización de las placas.

Ensayo 4. Zika Viral Genome replicación

1. Las células Vero ingenuas de semillas a 1 x 10 ⁵ células por pocillo en volúmenes de 2 ml utilizando una placa de 12 pocillos. El día siguiente, se preparan inóculos viral (MOI de 0,01 y 0,1; 400 l / pocillo) de bajo y alto título usando medio libre de suero por triplicado. Para infección simulada, utilizar suero libre de los medios de comunicación (400 l / pocillo) solamente.
2. Repita los pasos 3.2 a 3.4.
3. En los 48 y 96 puntos de tiempo hr, recoger las muestras de ARN e inmunocitoquímica (CPI).
   1. Para la recolección de muestras de ARN, extraiga el soporte y luego añadir 400 l de solución de lisis directamente a cada pocillo y recoger los lisados.
   2. Para la CCI, retire los medios de comunicación y tgallina fijar las células mediante la adición de 1 ml de metanol a cada pocillo y se incuba la placa a 4 ° C durante 30 min.
   3. Desde el lisado de células, aislar el ARN total usando un kit de aislamiento de ARN según las instrucciones del fabricante. Cuantificar el ARN usando un espectrofotómetro.
4. Realizar una transcripción inversa de dos pasos de PCR cuantitativa (RT-qPCR) para determinar el contenido genoma ZIKV a partir de ARN cosechado.
   1. Para invertir transcribir el ARN, establecer primero una mezcla de reacción de 13 l integrado por 5 g de ARN aislado, 1 l de dNTPs (10 mM) y 1 l de hexámero aleatorio (250 ng) en un tubo de 0,2 ml. Incubar el tubo a 65 ° C durante 5 min y luego se coloca en hielo durante un minuto. Posteriormente, añadir 1 l de la transcriptasa inversa, 4 l de tampón de síntesis de la cadena 5x, 1 l de 0,1 M de ditiotreitol y 1 l de inhibidor de RNasa a la mezcla de reacción. Incubar el tubo durante 5 minutos adicionales a 25 ° C, seguido de 60 min a 50 ° C y inactivcomió la reacción por calentamiento a 70 ° C durante 15 min.
   2. Realizar qPCR utilizando 1 l del cDNA resultante con 12,5 l de colorante verde 2x Super Mix contienen ADN polimerasa y 1 l de 10 mM cebadores individuales específicos para el virus Zika [virus cebadores pan-genotipo Zika (Para: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), virus Zika genotipo asiático cebadores de deformación PRVABC59 (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], o virus de la hepatitis C (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), o limpieza gen GAPDH celular (Por: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') en un volumen de reacción de 25 l.
   3. Realizar PCR utilizando la condición de ejecución 95 ° C durante 15 seg y 60 ° C durante 30 seg (40 ciclos) en un sistema de PCR en tiempo real.
   4. Use el nivel de expresión de GAPDH basado en el valor de ciclo umbral (Ct) para normalizar la Zika medición genoma viral. Calcular el valor de delta Ct (Ct) de Zika genoma en comparación con la de GAPDH y obtener el valor ^{2? Ct.} A continuación, calcular el factor de cambio tomando la relación de contenidos normalizados genoma Zika entre las células infectadas y no infectadas en los puntos de tiempo indicados. Ver Figura 4 para los resultados de la replicación del genoma ZIKV.
5. Realizar ICC utilizando las células de metanol fijo.
   1. Lavar las células fijadas tres veces con 1x PBS y bloquear con tampón de bloqueo ICC (suero de cabra al 3%, 3% de BSA, 0,1% de Triton x-100 en PBS).
   2. Utilice monoclonal de ratón J2 anticuerpo anti-dsRNA (1 mg / ml) a una dilución de 1: 100 en tampón de bloqueo y se incuba durante la noche a 4 ° C.
   3. Se lavan las células con PBS 1x y añadir anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón-594 (1 mg / ml) a una dilución 1: 1000 en tampón de bloqueo y se incuba durante una hora a temperatura ambiente.
   4. Lavar las células con PBS 1x y las manchas de núcleos utilizando colorante Hoechst yobservar las células utilizando un microscopio de fluorescencia con un aumento de 100X (Figura 4).

5. biblioteca de detección de citoquinas contra la infección por el virus Zika

1. Sembrar las células Vero ingenuas en células de 1 x 10 ⁵ por pocillo usando una placa de 12 pocillos. Una vez que las células están unidas (6 horas después de la siembra), agregue cada uno de citoquinas a las concentraciones indicadas en los duplicados biológicos (2 ml de volumen / pocillo). Incluir vehículo (PBS) de control solo.
2. A las 12 horas post-tratamiento, lleve a cabo la infección viral Zika (MOI de 0,1 en 400 l por pocillo). Incluir pocillos de control negativo sin infección (simulacro).
3. A las 4 horas después de la infección, sustituir el inóculo viral con los medios de comunicación tratado de citoquinas (2 ml). Se incuban las células a 37 ° C durante 44 h adicionales.
4. En 48 horas después de la infección, contar las placas virales utilizando un microscopio de contraste de fases y adquirir imágenes representativas de las células infectadas a 40X de aumento (Figura 5).

Resultados

Una cepa viral Zika (PRVABC59; número de acceso GenBank KU501215) del genotipo asiático se utilizó en este estudio ^12. Se utilizaron células Vero a 80% de confluencia para la investigación de novo infección viral Zika. Para la producción viral y caracterización virológica posterior, se empleó un paso precoz del virus (P3) Zika. Se observaron las placas virales en el segundo día de la infección. Zika progenie viral liberados de la célula infectada puede tr...

Discusión

Aquí, se presenta un protocolo simplificado para el cultivo de virus Zika in vitro. Los pasos críticos incluyendo, identificando los puntos finales óptimas para la expansión del cultivo del virus, la medición de título, y se proporcionaron cuantificar la replicación del genoma. virus Zika es un patógeno humano, por lo que, durante la manipulación de agentes infecciosos, los procedimientos de bioseguridad deben ser seguidas estrictamente. Una línea de células de riñón de mono, Vero, se utilizó para...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma Life Science	D5796
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red	Corning	25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4%	Life Technologies	T10282
Countess – Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Countess-cell counting  chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10283
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System	Thermo Fischer	4471088
RNase-Free DNase	Promega	M6101
Vero Cell Line	ATCC	CCL-81
Zika viral strain PRVABC59	Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6	Peprotech	200-06
IL-1 alpha	Peprotech	200-01A
TNF-alpha	Peprotech	300-01A
Interferon alpha A	R & D Systems	11100-1
Interferon beta	Peprotech	300-02BC
Interferon gamma	Peprotech	300-02
Centrifuge 5415R	Eppendorf	5415R
Centrifuge 5810R	Eppendorf	5810R
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