SILAC basada en proteómica Caracterización de exosomas del VIH-1 en células infectadas

Resumen

A continuación, describimos un método de proteómica cuantitativa mediante la técnica de etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular (SILAC) para analizar los efectos de la infección por VIH-1 en proteomas exosomal anfitrión. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a las células bajo diferentes condiciones de estrés o infección.

Resumen

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Introducción

Muchas enfermedades humanas, incluyendo las infecciones virales, a menudo se asocian con procesos celulares distintivas que tienen lugar en y alrededor de las células afectadas. Proteínas, actuando a menudo como los efectores celulares en última instancia, a mediar en estos procesos. El análisis de las proteínas a menudo puede proporcionar información muy valiosa sobre el medio ambiente local de las células afectadas y nos ayudan a comprender el mecanismo subyacente de la patogénesis de la enfermedad. Entre las diversas técnicas de análisis de proteínas, proteómica es válido especialmente una gran promesa. Como una herramienta de gran alcance, a gran escala, la proteómica pueden proporcionar una comprensión sistémica de procesos celulares, particularmente en el área de la función y la interacción de las proteínas. El análisis de las proteínas específicas se hace más simple mediante el desarrollo de técnicas de etiquetado, que permiten a los investigadores para controlar la expresión de los componentes celulares, particularmente proteínas, en el sitio de investigación. Aunque muchos análisis proteómicos se han realizado en el celularescala proteoma, caracterizaciones proteómicos en compartimentos subcelulares han demostrado ser particularmente informativa ^1. Esto se ejemplifica también en los estudios de la infección por VIH-1.

Los exosomas, 30-100 nm vesículas de membrana secretadas por una amplia gama de tipos de células ^{2, 3,} son componentes críticos de la comunicación intercelular y el transporte molecular. Fueron descubiertos previamente a jugar un papel importante en el proceso de gemación del VIH-1 ^{4, 5.} Mediante la combinación de análisis proteómico con disección funcional, se encontró que los exosomas liberados de las células infectadas por VIH-1 se componen de una firma de proteínas y moléculas reguladoras puerto únicos y cuantitativamente diferentes que afectan a las propiedades celulares en células receptivas, incluyendo la apoptosis y la proliferación celular ⁶ vecina. Los métodos se describen en este protocolo,a saber SILAC (etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular) ⁷ basado caracterización proteómico de exosomas de células infectadas por VIH-1. Enfoques similares se pueden aplicar para entender mejor otros compartimentos subcelulares durante la patogénesis mediante el ajuste de la tensión experimental para el compartimento o fracción de interés específico y hacer los cambios necesarios a los procedimientos descritos.

Dado el reciente desarrollo de métodos cuantitativos proteómicos, hay muchos para elegir a la hora de seleccionar el método más eficiente para un experimento particular. Entre ellas se encuentran la iTRAQ basada en productos químicos (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta) ⁸ y el MRM libre de etiquetas (monitorización de reacción múltiple) ⁹ técnicas. Ambos métodos son herramientas potentes y son buenas opciones para la configuración específica. Para un laboratorio típico de trabajo principalmente con líneas celulares, sin embargo, estos dos métodos tienen relatively mayores costos y son más tiempo en comparación con el método basado SILAC. SILAC es una técnica de etiquetado en base metabólica que incorpora formas isotópicas no radiactivas de aminoácidos de los medios de cultivo en las proteínas celulares. Típicamente, los experimentos SILAC comienzan con dos poblaciones de células, por ejemplo, infectadas y no infectadas. Cada uno está marcado diferencialmente en su entorno isotópica específica hasta que se logre el etiquetado completo. Los exosomas marcados de estas células se someten entonces a la extracción de proteínas. Una vez extraídas, las proteínas exosomal marcadas se analizaron mediante cromatografía líquida espectrometría de masas en tándem ^10. Finalmente, los resultados de espectrometría de masas y las proteínas marcadas de manera significativa son sometidos a estadística y análisis de la bioinformática, así como la comprobación bioquímica riguroso. Nuestros informes de investigación anteriores sugieren que los procedimientos de SILAC / exosoma son más apropiados para las líneas de células que las células primarias, ya que las líneas celulares son por lo general en unaestado de proliferación activa para el etiquetado isotópico eficiente,

Protocolo

1. Cultivo celular y la infección por VIH-1

NOTA: Antes de comenzar los experimentos, se recomienda comprobar la viabilidad de las células mediante la tinción de azul de tripano ¹¹ y su proliferación a través de un ensayo de MTT ^12. También es fundamental utilizar medio SILAC recién preparado. Varias líneas celulares se pueden utilizar, siempre y cuando se encuentren en una fase activa de proliferación, y son susceptibles a la infección por VIH-1, o la condición de prueba de elección. En este protocolo, utilizar la línea celular H9 como el ejemplo.

1. Semilla 2 x 10 ⁶ células H9 en cada frasco de cultivo celular. Crecer un grupo en 10 ml etiquetados RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal dializado (FBS), 100 mg / L ¹³ C ₆ L-lisina y 100 mg / L ¹³ C ₆ ¹⁵ N ₄ L-arginina. Crecer el otro grupo no marcado en 10 ml de medio RPMI 1640, con 10% de FBS dializado, 100 mg / L de L-lisina y 100 mg / L de L-arginina.
2. Cultivar las células durante seis duplicaciones momento en el que las proteínas de las células en el medio marcado se prácticamente completamente etiquetados (> 99%) con los aminoácidos pesados. Añadir medio fresco o cambiar los medios de comunicación regularmente (cada 1-3 días, dependiendo del tipo de célula. Para células H9, cambio de medio cada 3 días). Al final del etiquetado, aumentar el volumen de cultivo (por ejemplo, ~ 30 ml) para acomodar el crecimiento de más células.
   NOTA: Determinar celular exacto tiempo de duplicación en el inicio del experimento a través de la tinción con azul de tripano y el recuento de células.
3. Infectar a las células marcadas con el VIH-1 _NL4-3 utilizando el estándar del VIH-1 protocolo de infección ¹³ durante 48 horas. Se incuban las células con cantidades apropiadas de virus con una multiplicidad de infección (MOI) alrededor de 0,3. Compruebe infección por VIH-1 mediante la cuantificación p24 de los sobrenadantes de cultivo utilizando un antígeno p24 kit ELISA VIH-1. Realizar un ensayo de inmunofluorescencia ¹⁴ para confirmar la infección exitosa de células. Keep cultivo de las células no marcadas en medio sin marcar y sin infección por VIH-1.
4. Recoger los sobrenadantes de ambos grupos al final de la infección (paso 2.1).

2. Aislamiento exosoma

NOTA: A través de una serie de pasos de ultracentrifugación, fracciones exosomal de sobrenadantes de cultivo se enriquecen ^15. Realizar todos los pasos siguientes a 4 ° C, con un rotor de ultracentrífuga que pueden alcanzar una velocidad de al menos 100.000 x g.

1. Recoger los sobrenadantes de los cultivos en tubos cónicos de 50 ml, evitando las células. Centrifugar durante 10 min a 300 xg para eliminar las células restantes.
2. Recoger los sobrenadantes en nuevos tubos de 50 ml cónicos y centrifugar durante 10 min a 2.000 xg para eliminar las células muertas. Transferencia resultante sobrenadantes a tubos de tipo comercial con capacidad para un rotor que son capaces de soportar ultracentrifugación.
3. Asegúrese de equilibrar los tubos de ultracentrífuga. Centrifugar los tubos durante 30 min a 10.000 xg para eliminarrestos celulares.
4. Recoger los sobrenadantes en tubos de ultracentrífuga y centrifugar durante 70 minutos a 100.000 x g. Descartar el sobrenadante.
5. Resuspender los pellets de exosoma ricos en 5 ml de PBS fresco. La transferencia de las soluciones a tubos de ultracentrífuga frescas y centrifugar de nuevo durante 70 minutos a 100.000 x g.
6. sobrenadantes de descarte. Para almacenar los exosomas a largo plazo, volver a suspender los pellets en 50 l de PBS y se almacena a -80 ° C. Como alternativa, proceder directamente a la extracción de proteínas como se muestra a continuación.

3. La proteína de extracción y preparación

1. Disolver gránulos exosomal aislados en 100-200 l RIPA lisis y extracción de memoria intermedia con un cóctel inhibidor de la proteasa añadido. El tampón se compone de 25 mM Tris-hidrocloruro, cloruro de sodio 150 mM, desoxicolato de sodio al 1% NP-40, 1% y 0,1% de SDS (dodecil sulfato de sodio), a pH 7,6. Los cócteles inhibidores de proteasa deben contener una variedad de inhibidores de la proteasa, tales como aprotinina, bestatina, leupeptin, pepstatina A y EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), que puede inhibir una amplia gama de proteasas.
2. Centrifugar las soluciones disueltas durante 10 minutos a 13.000 xg (4 ° C), y transferir los sobrenadantes despejadas a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
3. Cuantificar la concentración de proteínas de cada muestra de exosomas usando ácido bicinconınico (BCA) o ensayo de Bradford ^16.
4. Mezclar una cantidad igual de proteínas (2 g) a partir de muestras marcadas y no marcadas y ejecutar la mezcla a partes iguales en un gel de SDS-PAGE al 4-20% a 120 mA / 200 V durante 30 min.
5. Gel de mancha con azul de Coomassie seguido de decoloración ^17.
6. El uso de una cuchilla de afeitar, cortar el carril de la muestra a partir del gel. A continuación, cortar el carril de gel en 10-15 piezas iguales. Poner cada pieza en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para un total de 10-15 tubos.
7. Sumergir los cubos en 25 mM NH ₄ HCO ₃ en 50% de acetonitrilo, vórtice, y desechar los sobrenadantes. Repetir dos veces. Secocubos en un concentrador de vacío ^{18, 19.}
8. Rehidratar cubos con ditiotreitol 10 mM (DTT) y agitar y centrifugar brevemente. Incubar a 56 ° C durante 1 hr. sobrenadante de descarte.
9. Sumergir cubos de gel en 55 mM yodoacetamida, vórtice, y el giro. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 45 min. sobrenadante de descarte.
10. Sumergir los cubos en 25 mM NH ₄ HCO _3, vórtice, giro, y desechar el sobrenadante.
11. Sumergir los cubos en 25 mM NH ₄ HCO ₃ en 50% de acetonitrilo, vórtice, y el giro. Repita 3.9 y 3.10.
12. Secar los cubos en un concentrador de vacío. Añadir tripsina modificada 25 l la secuencia grado en 25 mM NH ₄ HCO _3, se incuba a 4 ° C durante 30 minutos, y desechar el exceso de solución. Sumergir los cubos en 25 mM NH ₄ HCO ₃ sin tripsina, y se incuba durante la noche a 37 ° C.
13. En resumen girar los cubos de abajo y transferir el péptido resultante supletoriact a un nuevo tubo. Añadir 30 l de ácido fórmico 5% en 50% de acetonitrilo a los cubos, de vórtice durante 30 min, y centrifugado. Combinar el sobrenadante con el extracto. Se secan los extractos peptídicos con un concentrador de vacío a menos de 5 l.
14. Enviar muestras para facilidad de la base de espectrometría de masas para el análisis LC-MS / MS. El análisis de datos de MS, que puede ser generada por el software de código abierto, por lo general incluye un número de acceso para cada proteína identificada, marcadas proporciones / sin etiqueta y el número único de péptidos identificados.

4. Western Blotting Verificación

NOTA: Western Blot se recomienda para verificar los resultados de espectrometría de masas.

1. Seguir los protocolos estándar de transferencia de Western y asegurar que cantidades iguales de proteína de cada grupo están cargados. Utilizar anticuerpos contra las proteínas de interés (por ejemplo anexina A5, la cadena B de lactato deshidrogenasa) identificados por la EM. detección de transferencia de Western, junto con analysi densitometrías, se reafirman que la EM identificación y cuantificación de proteínas son correctos.

5. Análisis de los datos proteómicos

NOTA: La evaluación de la calidad de los datos, el tratamiento previo de datos, cálculo y determinación de proteínas candidatos importantes se realizan por separado para cada MS replican. Una vez que se hayan completado los análisis anteriores, los datos analizados a partir de réplicas se comparan y combinan ^{6, 20, 21.}

1. Evaluar la calidad de los datos de EM.
   1. En primer lugar, log2 transformar la SILAC-MS etiquetado / sin etiqueta proporciones de proteínas cuantificadas en un programa de hoja de cálculo.
   2. En la representación de la Ciencia y el software estadístico, el grupo de los ratios en relación de 40-100 contenedores y trazar el número de coeficientes por bandeja para generar un histograma. Una distribución normal de histograma indica la buena calidad de los datos MS ^6. Hacer este paso para todos los Estados miembros se replica.
2. Para aumentar la confianza y la exactitud de las proporciones de péptidos MS, considerar la eliminación de las proteínas que tienen menos de dos péptidos cuantificados.
3. Para determinar los candidatos de proteína significativamente arriba y hacia abajo regulada, utilice los siguientes pasos para calcular la significación de los umbrales ^22.
   1. En gráfica científica y software estadístico, generar una regresión no lineal o curva de ajuste a los datos de distribución de frecuencia. Este paso produce valores que se pueden utilizar para calcular los valores de corte. Calcular los valores de corte como mediana ± 1,96 σ para los límites de confianza del 95% o 2,56 σ para los límites de confianza del 99%.
      NOTA: Los detalles específicos del cálculo de los puntos de corte se pueden encontrar en Emmott et al. ^22.
   2. Seleccionar a los candidatos de proteínas cuyas proporciones son o superior a 1,96 (o 2,56) desviaciones estándar por encima de la mediana (significativamente sobreexpresado) o inferior a 1,96 (o 2,56) desviaciones estándar por debajo de la mediana (significativamente bajo-expresado).
4. Comparación de las réplicas de los candidatos significativos identificados anteriormente para lograr la consistencia. Asegúrese de que se cumplan los siguientes criterios para pasar esta etapa de selección final: los candidatos deben ser identificadas consistentemente en todas las repeticiones; y réplicas de un candidato deben ser consistentes en su dirección de regulación (preferiblemente, al menos 2 de cada 3 repeticiones de un candidato debe ser o bien hasta reguladas o hacia abajo-regulado).
5. Finalizar los datos de los candidatos que cumplan con los criterios antes mencionados mediante la fusión de los datos de sus réplicas.

6. Verificación de Bioinformática y Caracterización

NOTA: La información existente genómica y la bioinformática ofrece una gran cantidad de información para casi todas las proteínas. La minería de datos y análisis de la bioinformática en esa información puede ayudar en la obtención de una gran cantidad de información sobre la propiedad y las funciones de los candidatos importantes. este process es generalmente necesario diseñar experimentos de laboratorio húmedo aguas abajo adecuadas.

1. Usando sus números de acceso de GenBank y los ID de UniProt, buscar en los candidatos contra las bases de datos actuales (exosome Exocarta ^23, Evpedia ²⁴⁾ para verificar que las proteínas candidatas se han encontrado previamente en exosomas. Este paso agrega una capa de confianza en que los candidatos son de hecho en exosomas.
   1. http://www.exocarta.org/ de acceso, haga clic en "Consulta" y de entrada ya sea el gen o proteína de nombre / número de la adhesión. Una página de resumen aparecerá y se mostrará la evidencia en exosomas, siempre si hay alguna.
2. Buscar en los candidatos contra el VIH-1 y la base de datos de interacción proteína humana ^25. Otra posibilidad es buscar las bases de datos específicas que pueden proporcionar información sobre la interacción de las proteínas candidatas y la condición de prueba.
   1. Acceder a la base de datos en www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInteracciones. En la entrada «nombre de dominio de la proteína ', introduzca los nombres de los candidatos o los números de acceso y haga clic en búsqueda. Los resultados de la búsqueda pueden dar una idea de las interacciones entre las proteínas candidatos del VIH-1 y, y sugerir cuál de los candidatos podría ser realmente el VIH-1 asociado.
3. Importación GenBank números de acceso u UniProt identificadores de los candidatos en el software de análisis de IR (como FunRich, herramienta de análisis funcional de enriquecimiento ²⁶⁾ y ejecutar el software.
   1. Descargar el software en http://www.funrich.org/. Después de la instalación, abra el software, bajo enriquecimiento de análisis, haga clic en "Agregar conjunto de datos", y cargar la lista de proteínas / genes. A continuación, seleccione el tipo de gráfico para visualizar el análisis de GO.
      NOTA: GO resultados del análisis serán visualizados en forma de gráficos circulares. Este paso nos ayuda a ganar la penetración global asociado con los candidatos en las áreas de procesos biológicos (BP), componente celular (CC), y la función molecular (MF).
4. DAVID acceso a http://david.ncifcrf.gov/ ^27, haga clic en la "Herramienta de anotación funcional" en su sitio web. Introduzca la lista de candidatos, seleccionar el "identificador" del gen, tales como el "UniProt ID", seleccione "lista de genes" y la búsqueda. Los términos enriquecido GO, los valores de p, y otros parámetros se pueden encontrar haciendo clic en la página "Resumen de los Resultados de anotación" en la categoría "Gene_Ontology".
5. Para investigar las posibles interacciones de los candidatos con otras proteínas, utilizar la base de datos de libre acceso STRING ²⁸ para dilucidar posibles interacciones proteína-proteína y las posibles vías bioquímicas.
   NOTA: GO Análisis y anotación funcional (Sección 6.3 a 6.4) también se puede realizar utilizando el software más reciente cadena.
   1. Acceder a la base de datos en http://string-db.org/. Especifique la ID de proteína o secuencia en los s designadosCaja de bús y seleccionar la especie correcta para su análisis. Haga clic en "Buscar". Los resultados darán información sobre ambas asociaciones directas (físicas) e indirectos (funcionales). Los diez primeros partidos conocidos para el candidato exosomal se mostrarán y deben ser considerados para la selección significativa candidato.
      NOTA: Una gran cantidad de información asociada a los candidatos puede ser analizada mediante los pasos anteriores. Los candidatos más significativos pueden ser elegidos para su posterior análisis molecular y bioquímico posterior.

Resultados

La figura 1A es un diagrama de flujo esbozar el procedimiento de etiquetado SILAC ^21. Con el fin de purificar los exosomas, las muestras deben ser centrifugadas a través de la centrífuga. La Figura 1B muestra las etapas de purificación por ultracentrifugación exosome de serie ^21. Una vez purificados, los exosomas son objeto de un análisis proteómico experimental como se indica en el procedimiento.

Discusión

En los procedimientos descritos en este documento, hemos demostrado la aplicación de la técnica SILAC para investigar el efecto de la infección por VIH-1 en el proteoma exosomal anfitrión. Inicialmente, las células infectadas no infectados y el VIH-1 son diferencialmente marcado con isótopo. Los exosomas diferencialmente marcadas se purificaron entonces antes de realizar la extracción de proteínas. A continuación, se emplea cromatografía de líquido tándem espectrometría de masas para analizar el proteoma ex...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
H9 cell line	ATCC	HTB-176
Trypan Blue	Thermo Fisher	15250061
MTT assay kit	Thermo Fisher	V13154
Dialyzed fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher	26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640	Thermo Fisher	89982	DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC	Thermo Fisher	88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC	Thermo Fisher	88431
HIV-1 NL4-3	NIH AIDS Reagent Program	2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit	PerkinElmer	NEK050001KT
Refrigerated super-speed centrifuge	Eppendorf	22628045
Refrigerated ultracentrifuge	Beckman Coulter	363118	Should be able to reach 100,000 x g
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher	14-432-22
Ultracentrifuge Tubes	Beckman Coulter	326823
SW 32 Ti Rotor	Beckman Coulter	369694
RIPA buffer	Thermo Fisher	89900
Protease Inhibitor Cocktails	Thermo Fisher	78430
ThermoMixer	Eppendorf	5384000020
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23250
Spectrophotometer	Biorad	1702525
SDS PAGE Gel apparatus	Thermo Fisher	EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels	Novex	XV04200PK20
Gel staining reagent	Sigma Aldrich	G1041
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
SpeedVac Concentrator	Thermo Fisher	SPD131DDA
Antibody to human annexin A5	Abcam	ab14196
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain	Abcam	ab53292
Graphing and Statistical Software	Systat	SigmaPlot	Or GraphPad Prism
Quantitative proteomics software suite	Max Planck Institue of Biochemistry	Maxquant
Software and databases	Various vendors		Refer to main text for details