La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

Resumen

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Resumen

Las biopelículas consisten en grupos de bacterias encapsuladas en una matriz de auto-secretada. Juegan un papel importante en la contaminación industrial, así como en el desarrollo y persistencia de muchas infecciones relacionadas con la salud. Una de las biopelículas más bien descritos y estudiados en la enfermedad humana se produce en la infección pulmonar crónica de los pacientes con fibrosis quística. Al estudiar biofilms en el contexto del huésped, muchos factores pueden afectar a la formación y el desarrollo de biopelículas. Con el fin de identificar cómo los factores del huésped pueden afectar a la formación y el desarrollo de biopelículas, se utilizó un método cubre objetos de cámara estática para crecer biopelículas en presencia de factores derivados del huésped en forma de sobrenadantes de esputo. Las bacterias se sembraron en cámaras y se expusieron a filtrados de esputo. Después de 48 h de crecimiento, las biopelículas se tiñeron con un kit de viabilidad comercial biopelícula antes de la microscopía confocal y análisis. Tras la adquisición de imágenes, las propiedades del biofilm pueden evaluarse utilizando diferentes plataformas de software.Este método nos permite visualizar las propiedades clave de la formación de biopelículas en presencia de diferentes sustancias, como los antibióticos.

Introducción

biopelículas bacterianas son grupos de microorganismos que están unidos entre sí y encerrados en una matriz de auto-secretada. ^1,2 Clásicamente, que representan bacterias unidas físicamente a una superficie abiótico o biótico formado bajo condiciones de flujo. Las biopelículas también se han demostrado para crecer en condiciones estáticas (ausencia de flujo) y distal de las superficies, tales como en la interfase aire-líquido de piscinas térmicas o unas películas formadas en tubos de ensayo. Estas biopelículas hace tiempo se reconoce en el medio ambiente y son un detrimento importante para los procesos industriales, ya que se pueden formar en los depósitos de agua o en las tuberías, lo que resulta en la contaminación biológica, la corrosión y los bloqueos. ^3,4

Las biopelículas son también críticos en establecimientos de salud, ya que se ha demostrado estar implicado en infecciones relacionadas con el catéter, infecciones pulmonares en pacientes con fibrosis quística, así como en numerosas otras infecciones. ^5,6 Uno de los rasgos distintivos de las infecciones biofilm es el dearrugado susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos y deficientes despeje de la sistema inmune innato. ^7-9 El más estudiados, escenarios clínicamente relevantes que supongan una infección basada en la biopelícula se produce en pacientes con fibrosis quística (FQ), que están infectados crónicamente con las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa puede someterse a una serie de cambios durante el establecimiento de la infección crónica que la hacen muy difícil de tratar. ^10,11 Las biopelículas pueden activar diferencialmente la inmunidad innata y conducir la inflamación. ^12-14 Como estas infecciones provocan un aumento de la morbilidad y la mortalidad en los pacientes con FQ, es crucial para entender los factores que pueden afectar el desarrollo del biofilm en este contexto.

Un estudio reciente sugiere que host-factores son críticos en la formación de agregados de biopelícula P. aeruginosa. ¹⁵ Estas biopelículas contribuyen a la reducción de la susceptibilidad a los antibióticos y los mecanismos de defensa del huésped. el presena vez de factores derivados del huésped, tales como la elastasa de neutrófilos, así como productos secretados a partir de microorganismos presentes en el pulmón con FQ, tienen el potencial para modular en gran medida la formación y el desarrollo de biopelículas. ¹⁶ Además, las biopelículas interactuar con el anfitrión para modular la expresión de numerosos caminos e iniciar la inflamación. Si bien los métodos de alto rendimiento, tales como el ensayo de cristal violeta estándar, puede proporcionar alguna información con respecto al proceso de biopelícula, la visualización de la biopelícula en respuesta a estos factores proporcionan más información en profundidad.

En este manuscrito se describe un método para el uso de factores de el esputo de pacientes con FQ para estudiar el desarrollo de biopelículas in vitro. Este método permite una rápida visualización de biofilms expuestos a esputo que contiene factores del huésped utilizando un kit de biofilm viabilidad comercial. Esta técnica se puede utilizar para identificar visualmente los cambios que ocurren durante el crecimiento de biopelículas en presencia de exógenonos productos, y representa un método mejorado para analizar los cambios en el desarrollo de biopelículas en diversas condiciones.

Protocolo

Tenga en cuenta que se requiere Junta Ética de Investigación (REB) para recoger y almacenar muestras de esputo de sujetos humanos. Estos estudios fueron aprobados por el Hospital para Niños Enfermos REB # 1000019444.

1. Preparación de muestras de esputo CF

1. Recoger muestra de esputo de los pacientes durante las visitas rutinarias a la clínica de la fibrosis quística y mantener en hielo.
2. El transporte de la muestra de esputo en el hielo en la primera hora de la recogida, para el laboratorio de investigación, al objeto de tratamiento.

2. Procesamiento de esputo

1. Registrar el volumen de la muestra de esputo obtenido. Añadir solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 2 veces el volumen de la muestra (es decir, 2 partes de PBS, 1 parte de muestra).
2. Mezclar bien la muestra con una pipeta de transferencia. Vortex la muestra a la máxima temperatura durante 1 minuto para mezclar completamente.
3. Alícuota de 1 ml de la mezcla anterior en el número 1,5 ml tubos de microcentrífuga apropiados y giran hacia abajo a 5000 xg durante20 min a 4 ° C.
4. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y desechar el sedimento.
5. Esterilizar por filtración del sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micras y recoger en un tubo de microcentrífuga limpio.
   NOTA: La esterilidad del filtrado se ensayó en placas sobre agar LB e inoculando medios líquidos.
6. Almacenar el sobrenadante del esputo a -80 ° C para su uso futuro.
   NOTA: El esputo de múltiples pacientes también pueden ponerse en común después de la filtración.
7. Antes de su uso, diluir el esputo filtrado 1/10 v / v (100 l de esputo, 900 l de medios de comunicación) en los medios de comunicación deseada.
   NOTA: En este caso, se utilizó caldo lysogeny estándar (LB) los medios de comunicación.

3. Método cubreobjetos calibrada para la formación de biopelículas

1. Crecer aislado bacteriano de la noche a la mañana interés en los medios deseada a 37 ° C con agitación (200 rpm).
   Nota: Se usó una serie de diferentes bacterias, incluyendo aislados clínicos de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia cepacia y Achromobacter xylosoxidans. Elección de los medios depende de las cepas y las condiciones de interés, sin embargo, los medios de comunicación LB pueden ser utilizados para los experimentos iniciales.
2. De cultivo durante la noche, colocar 40 l de cultivo en 4 ml de medio fresco y crecer durante 3-4 horas a 37 ° C con agitación (200 rpm) para obtener un cultivo con una densidad óptica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ de aproximadamente 0,5 -0.6.
3. Se diluye la cultura desde el paso 3.2 a 1/5 en los medios de comunicación deseado con un 10% de filtrado de esputo o sin filtrado de esputo (como control). Otros concentración del filtrado de esputo puede ser probado (es decir, 50% o 100%).
4. Utilice 200 l de la dilución para sembrar pozos de cámaras de diapositivas.
5. Permiten que las bacterias se adhieran durante 4 horas a 37 ° C sin agitación.
6. Después de 4 horas, retire el soporte y lavar suavemente la biopelícula con medio fresco 1x. Reemplazar con 200 l de medio nuevo.
   NOTA: Para estudiar los efectos de esputo en el biofilm, las Fresmedios h deben contener el sobrenadante del esputo.
7. Permitir que las biopelículas que crecen para la cantidad deseada de tiempo a 37 ° C sin agitación, en sustitución de los medios de comunicación cada 12 horas, sin lavar hasta el momento para la microscopía.
   NOTA: Para estudiar el efecto de los sobrenadantes del esputo en la susceptibilidad antibiótica de biopelículas, los antibióticos se añaden a los medios de comunicación después de 24 h de crecimiento de la biopelícula y se mantienen en los medios hasta que las manchas y la imagen de las biopelículas.

4. Las biopelículas de tinción y microscopía confocal

1. Tras el tiempo de crecimiento deseada (24-48 h funciona mejor), quitar el medio de pozos de cámara y lavar suavemente cada cámara dos veces con 300 l de PBS estéril.
2. Preparar la mezcla de tinción para biopelícula mediante la mezcla de 1 l de cada colorante (proporcionado en el kit de viabilidad) para cada ml de solución necesaria. Hacer colorante en solución de agua o medios de comunicación.
   NOTA: El agua se recomienda por el fabricante.
3. Añadir 200 l de mezcla de colorante a cada pocillo de covergla chamberedss e incubar a temperatura ambiente, en la oscuridad durante 45 min.
4. Retire la mezcla de tinción de las cámaras y lavar cada pocillo con 300 l de PBS estéril. Retirar PBS y reemplazar con agua fresca o medios de comunicación.
5. Proceder con la visualización de las biopelículas mediante microscopía confocal.

5. La visualización de biopelículas con microscopía confocal

1. Leer biopelículas manchadas en las cámaras inmediatamente después de la tinción (a menos de 1 hora). Minimizar el retardo en la visualización de las diapositivas por tinción 1 a 2 cámaras de 8 pocillos a la vez.
2. Realizar las imágenes usando microscopio confocal láser para juegos de excitación y filtros para la adquisición.
   NOTA: Aquí, el sistema confocal de disco giratorio con láseres borealis espectrales (verde: 491nm, Rojo: 561 nm) se utilizó para la excitación. Emisión conjuntos de filtros de 515/40 y 624/40 fueron utilizados para visualizar las manchas de la kit biofilm viabilidad.
3. Tome imágenes utilizando un objetivo 25X en agua microscopio confocal con la cámara.
4. Uso Z-pilas para modelar la biopelícula. Tomar imágenes cada 0,5-1 micras a partir del primer plano de enfoque hasta el último cuadro de enfoque de la biopelícula (por lo general abarca 30-80 micras para las biopelículas 48 hr)
5. Tome 3-5 imágenes de cada pocillo.
   NOTA: Por lo tanto durante otras 8 cubreobjetos así la recámara, se generarán imágenes 24-40.
6. Guardar las imágenes para su análisis.
   NOTA: Las imágenes deben ser guardados como archivos TIFF-OME para ser analizados mediante COMSTAT ^18,19. Instrucciones para el análisis de imágenes biofilm se pueden encontrar en http://www.comstat.dk/. Una vez que las imágenes se importan, parámetros tales como espesor medio, la biomasa y la cobertura de la superficie para cada canal (rojo y verde) se pueden analizar.

Resultados

El diseño general del experimento está representado en la Figura 1. El uso de este protocolo proporciona un método conveniente para visualizar los cambios en las biopelículas que crecen durante diferentes períodos de tiempo (por ejemplo, 24, 48 o 72 hr). Es importante destacar que las señales exógenas, tales como esputo filtrados, se puede añadir a visualizar los cambios en el desarrollo de biopelículas. Como se ve en la Figura 2, la pr...

Discusión

Los métodos descritos en este documento permiten la visualización de las biopelículas bacterianas cultivadas en la presencia de productos exógenos. No es sorprendente que la producción de los exoproductos es de importancia cuando se utiliza este tipo de sistema. Por ejemplo, ditiotreitol (DTT), se utiliza a menudo en muestras de esputo humanos para ayudar a licuar las muestras. Sin embargo, el efecto de la TDT solo puede disminuir el desarrollo de biopelículas y la viabilidad (datos no mostrados). Por lo tanto, lo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf