La interposición de la vena del modelo: un modelo adecuado para estudiar la permeabilidad del injerto de bypass

Resumen

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Resumen

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

Introducción

enfermedades de las arterias coronarias y sus complicaciones se encuentran entre las principales causas de muerte en todo el mundo. estrategias terapéuticas actuales se centran en restablecer el flujo de sangre, ya sea mediante la dilatación del vaso estrechado o mediante la creación de un bypass. Cirugía de revascularización coronaria (CABG) usando autoinjertos venosos fue descrita por primera vez en 1968 y ha sido perfeccionado a lo largo de los años. Aparte de la revascularización de la arteria descendente anterior coronaria, conductos de vena safena son los más utilizados ^1. Sin embargo, la permeabilidad del injerto sigue siendo el talón de Aquiles de los injertos de vena safena (SVG). Un año después de la cirugía, la permeabilidad del injerto es del 85%, cayendo a 61% después de diez años ^2,3. Revelando los mecanismos fisiopatológicos y las causas de la pérdida de la permeabilidad SVG, por tanto, es una tarea importante.

Este video muestra una vena modelo de interposición de rata para investigar la pérdida del injerto de vena. Los objetivos generales de este método son para explorar la patobiológico subyacentey los procesos -physiological durante la progresión de la enfermedad y para desarrollar un modelo adecuado para las pruebas de opción terapéutica de drogas o. Mediante el trasplante de la vena epigástrica superficial en el sistema arterial, este modelo imita el entorno clínico de cirugía de revascularización coronaria. El trauma quirúrgico, la isquemia y el estrés de la pared son desencadenantes importantes de los cambios vasculares patológicas y son imitados en el modelo descrito.

Diferentes modelos y especies están disponibles para investigar la pérdida de la permeabilidad del injerto de vena. Modelos animales grandes, tales como cerdos, ovejas ^{4 5 6,} perros, monos y ^7, se asemejan vehículo humano y las estructuras anatómicas, permitiendo así controlar estrategias terapéuticas complejas, tales como la colocación de stents bypass o nuevas técnicas quirúrgicas, que se probarán ^8. Sin embargo, se requieren especial de vivienda, equipamiento y personal. Además, los altos costos y la necesidad de un anestesista adicional durante la cirugía impiden su aplicación más amplia. smtodos los animales, incluyendo ratas, son fáciles de manejar, no requieren especial de vivienda, y tienen costos manejables. En comparación con los modelos de ratón ^9,10, modelos de rata tienen la ventaja de una mejor capacidad de funcionamiento y por lo tanto menos variabilidad en el resultado. Las ratas son fisiológicamente y genéticamente más similares a los humanos que los ratones ^11,12. Además, la mayoría de los ratones de tipo salvaje sólo se desarrollan myointima limitada ^13, que crea modelos de ratones propensos a errores de tipo II. La histología de las principales venas del ratón, como la vena cava inferior, sólo se compone de unas pocas capas de células y hace difícil la evaluación temprana ^13. Una desventaja adicional es la pequeña cantidad de tejido disponible para su posterior análisis después de la recuperación del injerto.

El modelo descrito en este video es reproducible, barato, y fácil de realizar, y se puede establecer de forma rápida y fiable. Es especialmente adecuado para la evaluación de agentes terapéuticos experimentales caros, tales como vectores viralespara la terapia génica, de una manera económica.

Protocolo

Los animales recibieron atención humanitaria de conformidad con la Guía para los Principios de Animales de Laboratorio, preparado por el Instituto de Recursos Animales de Laboratorio y publicadas por los Institutos Nacionales de Salud. Todos los animales protocolos fueron aprobados por la autoridad local responsable ( "Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (Oficina para la Salud y Protección del Consumidor) Hamburgo").

1. Cuidado de Animales

1. Obtener ratas ratas Lewis (LEW / Crl) y ratas transgénicas ROSA / luciferasa-LEW un peso de 300-350 g en el Instituto de Animales de Laboratorio.
2. Mantenga las ratas bajo condiciones convencionales en armarios ventilados y alimentarlos con pienso estándar para ratas y tratado en autoclave agua ad libitum.
3. Realizar un trasplante de injerto utilizando las ratas transgénicas ROSA / luciferasa-ASE como los donantes y las ratas singénicas ASE / Crl como los destinatarios.

2. Preparación de la rata donante

1. Use un inductcámara de iones para anestesiar una rata con isoflurano (2,5-3%).
2. Coloque la rata en su parte posterior y mantener la anestesia con una facial que cubra la boca y la nariz. Compruebe si hay suficiente profundidad de la anestesia pellizcando las patas traseras y la verificación de la ausencia de reflejos. Aplicar un poco de ungüento veterinario para los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
3. Abra las patas traseras y fijar su posición utilizando cinta.
4. Afeitar el vello inguinal con un cortador de pelo y desinfectar toda la zona utilizando povidona yodada seguido de etanol al 80%. Repita el paso de desinfección dos veces.
   NOTA: El área quirúrgica, gasas, y los instrumentos quirúrgicos deben ser esterilizados. Mantener un campo estéril durante todo el procedimiento y el desgaste de un solo uso, guantes quirúrgicos estériles, máscaras y gorras.
5. Bajo el microscopio, realizar una incisión vertical a lo largo de los inguinalis linea. Use dos pinzas para separar suavemente los tejidos subcutáneos y exponer la vena epigástrica superficial de su origin en la vena femoral. Con cuidado, aislar la vena epigástrica superficial de los tejidos circundantes.
6. Detener el flujo sanguíneo en la vena epigástrica superficial utilizando dos pinzas micro.
7. Cosecha de un segmento de aproximadamente 0,5 a 1 cm de la vena levantando con cuidado la vena aislado con unas pinzas y el corte a través del recipiente con micro tijeras. Deja las abrazaderas micro en el muñón recipiente para evitar la pérdida de sangre. Coloque la pieza eliminado de la vena sobre una gasa estéril. Con cuidado, coloque una aguja 30 G en el interior de un extremo de la vena recogida y enjuagar el recipiente con heparina (50 unidades / ml).
   NOTA: Sea la vena con cuidado y evitar daños durante la elevación, de corte y rubor. Asegúrese de que para lavar el injerto con la cantidad apropiada de heparina.
8. Mantenga el segmento de vaso de lidocaína al 1% en hielo hasta el trasplante en la rata receptora para prevenir un espasmo de los vasos.
9. La eutanasia a la rata donante mediante el aumento de la anestesia a los 5% de isoflurano. Después de 2-3 minutos, open el abdomen a lo largo de la línea alba, cortar a través del diafragma, y ​​quitar el corazón para detener la circulación.

3. Preparación de la rata receptora

1. Anestesiar y fijar la rata receptora de la misma manera como la rata donante.
2. Afeitar el lado medial de las piernas con un cortador de pelo y desinfectar tres veces con povidona yodada y 80% de etanol.
3. Monitorear la profundidad de la anestesia y asegurarse de que es suficiente mediante la verificación de la ausencia de reflejos cuando se pellizca las patas traseras.
4. Realizar una incisión mediana femoral de la rodilla hasta el pliegue inguinal. Bajo el microscopio, utilizar 2 fórceps para separar la arteria femoral de su entorno.
5. Utilice abrazaderas micro para detener el flujo de sangre. Coloque la abrazadera proximal primero, seguido por la pinza distal.
6. Cortar un segmento corto de la arteria femoral sujetada con micro tijeras y lo descarta. Acortar el muñón arterial restante con micro tijeras, creando una brecha que es1-2 mm mayor que el injerto de vena. Enjuague el muñón arterial con heparina usando una aguja de 30 G.
   NOTA: Si la adventicia sobresale ligeramente más allá del muñón buque, el uso de fórceps para tirar de él ligeramente en el extremo del recipiente y retirar una pieza.
7. Coloque la vena recogida desde el paso 2.8 entre los muñones arteriales y ajustar la longitud para que se ajuste adecuadamente en el hueco. Tenga en cuenta la dirección de la vena.
8. Realizar la anastomosis proximal en primer lugar usando una sutura de prolene 10-0. Llevar a cabo las puntadas individuales en el orden que se muestra (Figura 1D). Comience con una sutura en cada lado lateral antes de añadir tres suturas más en la parte ventral. Después, colocar tres puntos de sutura en el lado dorsal del recipiente para completar la anastomosis.
9. Conectar los vasos distales con el injerto usando la misma técnica que para la anastomosis proximal descrito en el paso 3.8. Una vez más, comenzar con una sutura en cada lado lateral y, a continuación colocar tres puntos de sutura en el sid ventrale y el lado dorsal.
10. Cargar dos jeringas de 1 ml con componente de cola de fibrina 1 y 2. Levante con cuidado el injerto con una pinza y colocar aproximadamente 100 l de fibrina componente de pegamento 1 bajo el injerto, seguido por el componente 2.
    NOTA: Asegúrese de que los componentes 1 y 2 se aplican en una proporción de 1: 1.
11. Colocar el injerto en su posición y soltar un 100 l adicionales de los componentes 1 y 2 en la parte superior del injerto. Asegúrese de que el pegamento cubre tanto el injerto y la anastomosis con el fin de prevenir la insuficiencia anastomótica y el exceso de distensión del injerto de vena.
12. abrir con cuidado la pinza distal, seguido de la proximal.
13. Confirmar una cirugía exitosa marcando el pulso visible en la vena y la arteria trasplantado distal del injerto.
14. Retire el exceso de pegamento, lo que impide el cierre de la piel. El uso de fórceps para levantar la cola curada y retire el exceso con micro tijeras. Cierre las capas de la piel con suturas de prolene 5-0.
15. Inyectar 4-5 mg / kg de carprofeno por vía subcutánea antes de permitir que la rata se despierte. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Mantener al animal en una jaula individual hasta que esté totalmente recuperado.
16. Añadir Metamizol al agua de bebida (50 mg Metamizol por 100 ml) como medicamentos para el dolor durante los siguientes 3 días y controlar el animal a diario.

4. La ecografía dúplex

NOTA: El uso de la ecografía duxplex visualizar el flujo sanguíneo de forma no invasiva en ratas ^14.

1. Anestesiar una rata en una cámara de inducción (isoflurano 2%). Coloque la rata sobre su espalda y mantener la anestesia con una máscara que cubre la nariz.
2. Utilizar máquinas de cortar el pelo y crema de depilación para eliminar el pelo alrededor de la zona del muslo.
3. Aplique el gel de ultrasonido en el muslo. Asegúrese de que no hay burbujas de aire. Adquirir imágenes de ecografía dúplex utilizando un transductor 400 MS (frecuencia central: 30 MHz) con una velocidad de 230-400 cuadros / seg.

5. Histopatología

NOTA: Cosecha y mancha el recipiente de tinción con tricrómico de Masson para el análisis morfométrico ^15.

1. Fijar el vaso recogido en 4% de paraformaldehído durante la noche y se deshidratan en concentraciones crecientes de etanol. Incrustar la muestra en parafina y cortar en rodajas de 5 micras de grosor usando un microtomo.
   NOTA: El paraformaldehído es tóxico y debe manejarse con especial cuidado.
2. Desparafinar las diapositivas antes de la tinción con tricrómico solución de tinción. Deshidratar los portaobjetos teñidos, claro ellos con xileno, y montarlos en medio de montaje. Después de secar las diapositivas, ver las muestras con un microscopio.

6. La bioluminiscencia de imágenes (BLI)

NOTA: El injerto postoperatorio fue rastreado a través del tiempo in vivo mediante la medición de la señal bioluminiscente ¹6.

1. Disolver 1 g de sal de potasio de D-luciferina en 22 ml de PBS y se inyectan por vía intraperitoneal en la rata (375 mg / kg de peso corporal). Espere 15 min para la luciferina circule en el animal.
2. Coloque la rata en un sistema de cuantificación bioluminiscente en tiempo real y acceder a la señal de bioluminiscencia.

Resultados

El modelo de la interposición de vena rata es adecuado para estudiar el desarrollo de la hiperplasia myointima y el fracaso del injerto venoso. Los animales se recuperan bien de la cirugía y muestran una excelente condición física después de la operación. La Figura 1 muestra los pasos quirúrgicos clave. Después de la incisión de la piel a lo largo de los inguinalis linea, la vena superficial epigástrico y la arteria femoral se identifican (Figura 1A). La recolección del injer...

Discusión

Este video muestra una vena modelo de interposición de rata para investigar la pérdida del injerto de vena y para permitir la exploración de los procesos patológicos subyacentes y el ensayo de nuevos fármacos u opciones terapéuticas.

La anestesia es un aspecto crucial de los procedimientos quirúrgicos. Se recomienda un sistema de anestesia por inhalación continua, ya que este es un método seguro y fácil, especialmente durante las operaciones prolongadas. Esto puede ser de gran impo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat LEW/Crl	Charles River	Stock number 004
Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk	Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan	NBPR rat number 0299	http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	AbbVie	PZN 10182054 Art.Nr.: B506	Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
hair removal creme	Rufin cosmetic	27618
Povidone-Iodine	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
10-0 Ethilon suture	Ethicon	2814G
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer	400684.00.00	Carprofen
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Heparin	Rotexmedica	PZN: 3862340	25.000 I.E./ ml
Xylocain 1%	AstraZeneca	PZN: 1137907	Lidocain
EVICEL	J&J Med.Ethicon Biosur	PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE	fibrin glue
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system	VisualSonics		duplex sonography
Ecogel 100 ultrasound gel	Eco-med	30GB
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Biosynth	L-8220
PBS pH 7.4	Gibco	10010023
Xenogen Ivis 200	Perkin Elmer		bioluminescence imaging
Weigerts iron hematoxylin Kit	Merck	1.15973.0002	Trichrome staining
Resorcine-Fuchsine Weigert	Waldeck	2.00E-30	Trichrome staining
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129-25G	Trichrome staining
Ponceau S solution	Serva Electrophoresis	33427	Trichrome staining
Azophloxin	Waldeck	1B-103	Trichrome staining
Molybdatophosphoric acid hydrate	Merck	1.00532.0100	Trichrome staining
Orange G	Waldeck	1B-221	Trichrome staining
Light Green SF	Waldeck	1B-211	Trichrome staining
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	537020
37% HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Xylene	Th. Geyer	3410
Paraffin	Leica biosystems	REF 39602004
Ethanol absolute	Th. Geyer	2246
Ethanol 96%	Th. Geyer	2295
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Slide Rack	Ted Pella	21057
Staining dish	Ted Pella	21075
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment