Un protocolo para el uso de Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y forzar Biosensores para medir fuerzas mecánicas en todo el complejo nuclear de LINC

Resumen

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Resumen

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

Introducción

Sensible a la Fuerza, los sensores FRET codificados genéticamente han surgido recientemente como una herramienta importante para la medición de fuerzas de tracción a base de en células vivas, proporcionando información sobre cómo las fuerzas mecánicas son aplicada a través de proteínas de ^{1, 2, 3, 4.} Con estas herramientas, los investigadores pueden tomar imágenes de forma no invasiva fuerzas intracelulares en células vivas utilizando microscopios fluorescentes convencionales. Estos sensores consisten en una FRET-par (proteínas donantes y fluorescentes aceptor, más frecuentemente un donante azul y el aceptor de color amarillo) separados por un péptido elástico ^3. En contraste con C- o etiquetado N-terminal, este sensor se inserta en un sitio interno de una proteína para medir la fuerza mecánica transmitida a través de la proteína, comportándose como un medidor de deformación molecular. Aumento de la tensión mecánica a través de los resultados del sensor en un aumento de la distancia entre la FRET-paire, resultando en la disminución de FRET ^3. Como resultado, la FRET es inversamente proporcional a la fuerza de tracción.

Estos sensores a base de fluorescentes han sido desarrollados para las proteínas de adhesión focal (vinculina ³ y talina ^4), proteínas del citoesqueleto (α-actinina ^5), y proteínas de unión célula-célula (E-cadherina ^{6, 7,} VE-cadherina ^8, y PECAM ^8). El engarce elástico usado con más frecuencia y bien caracterizado en estos biosensores se conoce como TSmod y consiste en una secuencia repetitiva de 40 aminoácidos, (GPGGA) _8, que se deriva de la flagelliform proteína de seda de araña. TSmod se ha demostrado que comportarse como un nano-resorte elástico lineal, con la capacidad de respuesta de FRET a 1 a 5 pN de fuerza de tracción ^3. Diferentes longitudes de flagelliform se pueden utilizar para alterar la dinámica range de sensibilidad TSmod FRET-fuerza ^9. Además de flagelliform, espectrina repite ⁵ y vilina péptido pieza de cabeza (conocido como HP35) ⁴ se han utilizado como los péptidos elásticos entre FRET pares en biosensores fuerza similar ^4. Por último, un informe reciente mostró que TSmod también se puede utilizar para detectar las fuerzas de compresión ^10.

Recientemente hemos desarrollado un sensor de fuerza para el enlazador de la núcleo-citoesqueleto (LINC) complejo de proteínas Nesprin2G utilizando TSmod inserta en una proteína truncada Nesprin2G desarrollado previamente conocida como mini-Nesprin2G (Figura 2C), que se comporta de manera similar a endógena nesprin-2G ^11. El complejo LINC contiene múltiples proteínas que conducen desde el exterior hacia el interior del núcleo, que une el citoesqueleto citoplásmico de la lámina nuclear. Nesprin-2G es vinculante una proteína estructural tanto a lacitoesqueleto de actina en el citoplasma y a las proteínas de sol en el espacio perinuclear. Utilizando nuestro biosensor, hemos sido capaces de demostrar que nesprin-2G está sujeta a la tensión actomyosin depende en fibroblastos NIH3T3 ^2. Esta fue la primera vez que la fuerza se midió directamente a través de una proteína en el complejo LINC nuclear, y es probable que se convierta en una herramienta importante para entender el papel de la fuerza en el núcleo en mecanobiología.

El protocolo a continuación proporciona una metodología detallada de cómo utilizar el sensor de fuerza nesprin-2G, incluyendo la expresión del sensor de tensión nesprin (nesprin-TS) en células de mamífero, así como la adquisición y análisis de imágenes de FRET de células que expresan Nesprin- TS. El uso de un microscopio confocal invertido equipado con un detector espectral, una descripción de cómo medir la emisión sensibilizada FRET usando desmezcla espectral y está provisto de imágenes FRET radiométrica. Las imágenes radiométricas de salida pueden ser usados ​​para hacer qua relativacomparaciones de fuerza ntitative. Mientras que este protocolo se centra en la expresión de nesprin-TS en los fibroblastos, es fácilmente adaptable a otras células de mamífero, incluyendo las dos líneas celulares y células primarias. Además, este protocolo que se refiere a la adquisición de imágenes y el análisis FRET puede adaptarse fácilmente a otros biosensores de fuerza basados ​​en FRET que han sido desarrollados para otras proteínas.

Protocolo

1. Obtener ADN Sensor nesprin-2G y otro ADN plásmido

1. Obtener nesprin-2G TS (sensor de tensión) de control, nesprin-2G HL (sin cabeza), mTFP1, venus, y TSmod de una fuente comercial. Propagar todos los plásmidos de ADN y purificarlos usando cepas estándar de E. coli, tales como DH5-α, como se ha descrito previamente ^{12, 13.}

2. Las células transfectar con nesprin-2G y otro ADN plásmido

1. Se cultivan las células de fibroblastos NIH 3T3 a 70-90% de confluencia en una placa de cultivo celular de 6 pocillos en un incubador de cultivo celular estándar con la temperatura (37 ° C) y la regulación de CO ₂ (5%). Para el medio de crecimiento celular, utilice medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de ternera fetal al 10%.
2. En una campana de cultivo celular, se elimina el medio y enjuague cada pocillo con aproximadamente 1 ml de un medio de células de suero reducido. Añadir 800! L de medio de células de suero reducido a cada pocilloy colocar la cámara de 6 pocillos en la incubadora.
3. Pipetear 700 l de medio de células de suero reducido en un tubo de 1,5 ml con 35 l de solución de vehículo lipídico para formar el "lipomix". Mezclar con la pipeta. Etiquetar el tubo con una "L"
4. Reunir seis tubos de 1,5 mL y los etiquetar 1 a 6. Pipetear 100 l de medio de células de suero reducido en cada tubo.
   1. Uso de la concentración de plásmido de ADN de la etapa 1, una pipeta 2 g de nesprin 2G-TS en los tubos 1 y 2. Pipetear 2 g de nesprin-HL en tubos 3 y 4. pipeta de 1 g de MTFP en el tubo 5. Pipetear 1 g de mVenus en el tubo 6. no vuelva a usar las puntas de pipeta en el pipeteado de diferentes tipos de ADN.
5. Pipetear 100 l de la lipomix desde el tubo de "L" en cada tubo marcado (1-6) y mezclar mediante pipeteo repetido. Usar una pipeta limpia para cada tubo. Incubar durante 10-20 min.
6. Añadir 200! L de cada tubo marcado a un bien en la cámara de 6 pocillos con 70-90% de confluenciaCélulas. Etiqueta de la parte superior de cada pocillo con el ADN correspondiente añadió. Coloque la cámara de 6 pocillos en un incubador durante 4-6 h.
7. Aspirar el medio y añadir 12 ml de medio de células de suero reducido para enjuagar. Aspirar el medio de células de suero reducido, añadir 2 ml de tripsina a cada pocillo, y colocar la placa de 6 pocillos en la incubadora (5-15 min).
8. Mientras que las células se desprenden en la incubadora, capa 6 de vidrio con fondo de la visualización de los platos con una capa de fibronectina a una concentración de 20 mg / ml disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Permitir los platos para recubrir la superficie en la campana de cultivo de células (aproximadamente 20 min).
9. Neutralizar la tripsina mediante la adición de 2 ml de DMEM una vez que se separan las células.
10. La transferencia de los contenidos de cada pocillo a un tubo de centrífuga de 15 ml etiquetados y girar hacia abajo en 90 xg durante 5 min en una centrífuga de rotor de balanceo. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender cada sedimento celular en 1.000 l de DMEM por mezcla pipeta.
11. Aspirar la mezcla de fibronectina a partir de laplatos de vidrio y pipeta de 1.000 l de cada suspensión celular en los platos de vidrio.
12. Después de que las células se depositan en el fondo de las placas de vidrio (~ 15 min), añadir otro 1 ml de DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep a cada pocillo y colocar en el incubador de células. Dejar que las células se unan y expresan sensor durante al menos 18-24 h.
    NOTA: Las células se transfectaron utilizando reactivos de transfección de lípidos catiónicos comerciales (véase la Tabla de Materiales). Alternativamente, las líneas celulares estables se pueden seleccionar mediante el uso de un plásmido con un gen que confiere resistencia a una toxina (los plásmidos pcDNA para nesprin-TS y -HL están disponibles en un sitio web repositorio de ADN (véase la Tabla de Materiales) proporcionar células que expresan la resistencia a geneticina ). Además, los métodos de infección viral (lentivirus, retrovirus, o adenovirus) se pueden utilizar para expresar el sensor en las células que son difíciles de transfectar.
13. Además de nesprin-TS, transfectar células adicionales con el nesprin HL cero porde control CE, tal como se describe en los pasos 2.1-2.12; TSmod también se puede utilizar como un control de fuerza cero y debe exhibir FRET similar a nesprin-HL.
14. células transfectar con mTFP1 y venus para generar huellas espectrales (ver paso 4).
    NOTA: mTFP1 y venus típicamente expresan en niveles más altos que nesprin-TS, y como tal, pueden necesitar ser transfectadas para lograr niveles similares de expresión cantidades menores de ADN.

3. Verificar la eficacia de transfección

1. Aproximadamente 18-24 h después de completar la transfección, usar un microscopio de fluorescencia invertida para examinar la eficacia de la transfección mediante la comparación del número de células fluorescentes para el número total de células en vista (por lo general 5-30%).
   1. Utilice un microscopio de fluorescencia equipado con una frecuencia de excitación cerca de 462 nm (mTFP1) o 525 nm (venus) y un filtro de emisión centrada cerca de 492 nm (mTFP1) o 525 nm (venus).
      NOTA: Como alternativa, GFP conjuntos de filtros capturará una combinación de mTFP1 y cinconus emisiones y permitirán la confirmación de la eficacia de transfección.
2. células vivas imágenes dentro de 48 horas después de la transfección.
   1. Alternativamente, fijar las células en paraformaldehído al 4% (en PBS con calcio y magnesio) durante 5 min, tienda en PBS, y la vista después de 48 h ^8.
      NOTA: Más allá de 48 h, la calidad de la señal y la fuerza decae. La fijación de las células conserva su estado, incluyendo la FRET ser expresado ^8; sin embargo, las células sólo deben ser reflejados en PBS, como medio de montaje puede afectar FRET ^14. Las células fijadas sólo pueden ser comparadas con otras células fijas, ya que puede haber un cambio en la expresión.
      Precaución: El paraformaldehído es tóxico. Usar los equipos de protección personal (EPP) apropiado.

4. Captura de Huellas dactilares espectral de mTFP1 y Venus fluoróforos de desmezcla espectral

1. En una campana de cultivo de células, sustituir el medio celular con mediu de formación de imágenesm (HEPES-tamponada) suplementado con suero bovino fetal al 10%.
2. Colocar las cápsulas de visión en un (37 ° C) platina del microscopio confocal de temperatura controlada.
3. Coloque el plato de visualización de cristal con células transfectadas con mTFP1 sobre el objetivo de aceite a 60X de ampliación con una apertura numérica de 1,4.
   NOTA: El aceite se utiliza en un microscopio de barrido láser en el objetivo 60X para parecerse estrechamente el índice de refracción del sustrato de vidrio. El aceite se coloca en la parte superior de la lente objetivo y entra en contacto directo con el cubreobjetos de vidrio.
4. Localizar mTFP1 células que expresan con una fuente de excitación 458 nm y un filtro de paso de banda de emisión centrada a 500 nm.
5. Con una célula fluorescente en el campo de visión, seleccionar el modo de detección espectral ( "Modo Lambda" en el software utilizado aquí) y capturar la imagen espectral (Figura 3-1); incluir todas las frecuencias más allá de 458 nm utilizando incrementos de 10 nm (Figura 3-3). Seleccionar un brillante FLUORESCregión ENT (ROI) en la celda (radio de 20 píxeles).
   NOTA: La forma espectral de la mTFP1-expresión de ROI debe permanecer relativamente constante a través de la célula. Si la forma varía considerablemente, vuelva a ajustar el láser y obtener la configuración para mejorar la relación señal-ruido.
6. Añadir significa el retorno de la inversión fluorescente, intensidad normalizada a la base de datos espectral haciendo clic en "guardar espectros a la base de datos."
7. Optimizar la potencia del láser y ganancia de tal manera que se consigue una buena relación señal-ruido. Ajustes variarán para diferentes equipos. El uso de células no fluorescentes, no transfectadas como referencia de fondo, aumentar la ganancia y la potencia hasta que las células son brillantes, pero no más allá del rango dinámico del detector (punto de saturación). células de fondo no deben tener fluorescencia detectable después de promediar.
8. Repetir el proceso para las células transfectadas con venus con las siguientes excepciones:
   1. Asegúrese de que la frecuencia de excitación es a 515 nm y que el filtro de paso de banda es centered cerca de 530 nm cuando la localización de las células venus-expresan.
   2. En "Modo espectral," utilizar una frecuencia de excitación de 515 nm en lugar de 458 nm.

5. Capturar imágenes sin mezclar

1. Cambiar el modo de captura a "Spectral desmezcla."
2. Añadir las huellas espectrales de venus y mTFP1 en los canales de desmezcla (Figura 3, Arrow-2).
3. Ajuste el láser de excitación de nuevo a una fuente de argón 458 nm.
4. Coloque el plato de visión nesprin-TS encima del objetivo aceite de 60X.
5. Después de centrarse en una célula fluorescente con la expresión suficientemente brillante, ajustar la potencia de ganancia y láser para optimizar la relación señal-ruido.
   NOTA: Dado que la eficiencia de FRET de nesprin-TS es cerca de 20%, la imagen venus sin mezclar debe ser sustancialmente dimmer la imagen mTFP1 sin mezclar que. Una vez que el ajuste de la potencia y la ganancia aceptable se han determinado de forma iterativa, estos parámetros deben permanecer constantes para todas las imágenes captured.
6. Captura de un mínimo de 15-20 imágenes de células nesprin-TS con brillo relativamente similar y evitar la saturación excesiva pixel (todos los píxeles saturados se eliminan durante el procesamiento de imágenes).
7. Repetir el proceso de captura de imagen con células nesprin-HL utilizando parámetros de imagen idénticos.

6. Procesamiento y Análisis de Imágenes Relación imagen

1. Usando el software de fuente abierta ImageJ (Fiji) (http://fiji.sc/), abiertos imágenes de formato nativo utilizando BioFormats Reader.
2. Pre-proceso de las imágenes y calcular el ratio de imágenes utilizando protocolos previamente establecidos ^15.

Resultados

Siguiendo el protocolo anterior, el plásmido de ADN fue adquirido desde el repositorio de ADN y se transformó en células de E. coli. E. coli que expresan el DNA sensor fueron seleccionados de placas LB / ampicilina y se amplificaron en un caldo LB líquido. Después de la amplificación de los vectores, los plásmidos de ADN se purificaron en tampón Tris-EDTA utilizando un estándar, disponible comercialmente kit de aislamiento de ADN. El uso de un espectrofotómetr...

Discusión

Un método y la demostración de imágenes de células vivas de la tensión mecánica a través de nesprin-2G, una proteína en el complejo nuclear de LINC, se esbozó anteriormente. Antes de este trabajo, varias técnicas, tales como la aspiración de micropipeta, magnético en perlas de citometría, y microscópica láser de ablación, se han utilizado para aplicar tensión en el núcleo de la célula y para medir sus propiedades de material a granel ^{16, 17,}

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nesprin-TS DNA	Addgene	68127	Retrieve from https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNA	Addgene	68128	Retrieve from https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNA	Addgene	54613	Retrieve from https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNA	Addgene	27793	Retrieve from https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNA	Addgene	26021	Retrieve from https://www.addgene.org/26021/
Competent Cells	Bioline	BIO-85026
Liquid LB Media	ThermoFisher	10855001	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Bacterial Culture Plates	Sigma-Aldrich	L5667	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US
Ampicillin	Sigma	A9518
Spectrophotometer	Biorad	273 BR 07335	SmartSpec Plus
quartz cuvette	Biorad	1702504	Cuvette for SmartSpec Plus
DNA isolation kit	Macherey-Nagel	740412.5	NucleoBond Xtra Midi Plus
6-well cell culture dish	Falcon-Corning	353046	Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media	Gibco	11995-065	DMEM(1x)
Bovine Serum	Life Technologies	16170-078
reduced serum cell media	Gibco	31985-070	Reduced Serum Medium, "optimem"
Lipid Carrier Solution	invitrogen	11668-019	Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"
1.5 mL sterile plastic tube	Denville	c2170
Trypsin	Gibco	25200-056	0.25% Trypsin-EDTA (1x)
glass-bottom microscope viewing dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N	35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass
Fibronectin	ThermoFisher	33016015	fibronectin human protein, plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 mL sterile centrifuge tube	Greiner bio-one	188261
swinging rotor centrifuge	Thermo electron	Centra CL2	Swinging rotor thermo electron 236
cell culture biosafety hood	Forma Scientific	1284
climate controlled cell culture incubator	ThermoFisher	3596
inverted LED widefield fluorescent microscope	Life technologies	EVOS FL
Clear HEPES buffered imaging media	Molecular Probes	A14291DJ
Fetal bovine Serum	Life technologies	10437-028
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources	Zeiss	LSM 710-w/spectral META detector
Outgrowth Media	Newengland Biolabs	B9020s
NIH 3T3 Fibroblasts	ATCC	CRL-1658