La diferenciación condrogénica de inducción de las células madre derivadas de tejido adiposo por la gravedad centrífuga

Resumen

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Resumen

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Introducción

Los defectos en el cartílago articular no se curan de forma natural. En consecuencia, trasplante de células madre ha sido propuesta como un enfoque prometedor para la reparación de cartílago deteriorado. Sin embargo, este método requiere tanto la adquisición de un número suficiente de células madre y la inducción de estas células a someterse a la diferenciación condrogénica. La médula ósea (BM) se ha usado ampliamente como una fuente de células madre, pero el aislamiento de células de BM tiene dos desventajas principales: invasión y de rendimiento insuficiente. Debido a su facilidad de adquisición, el tejido adiposo es una fuente preferida de células madre. Estudios previos demostraron la factibilidad de aislamiento de células madre a partir de tejido adiposo y la inducción de la diferenciación condrogénica en estas células por medio de citocinas, tales como TGF-β1 ^{1, 2.} Estos métodos son eficaces, pero caro.

Como una alternativa de bajo costo para las citoquinas, la tensión mecánica se puede utilizar parainducir la diferenciación condrogénica. Carga mecánica juega un papel crítico en el mantenimiento de la salud del cartílago articular ^3, y que puede inducir fenotipos condrogénicas en diversas células. Por ejemplo, la presión hidrostática induce fenotipos condrogénicas en las células progenitoras sinovial derivado a través de la vía de la MAP quinasa / JNK ^4, y la compresión mecánica induce condrogénesis en células madre mesenquimales humanas (MSCs) upregulating genes chondrocytic ^5. Además, la tensión de cizallamiento contribuye a la expresión de la matriz extracelular relacionados condrogénesis-(ECM), en MSC humanas ^6. Gravedad centrífuga (CG), una tensión mecánica fácilmente aplicada y controlada generada por centrifugación, se puede inducir la expresión génica diferencial en las células ^7. Por ejemplo, en células de carcinoma de pulmón epiteliales, la expresión de la interleucina 1b (IL) es upregulated por centrifugación ^8. Tor lo tanto, como una tensión mecánica experimentalmente inducible, CG se puede utilizar para inducir la expresión de genes en las células madre chondrocytic. Sin embargo, no queda claro si CG puede inducir la diferenciación condrogénica de las células madre.

En este estudio, se encontró que CG indujo la regulación al alza de SOX9, un regulador maestro de la condrogénesis, en ASC humanos, dando como resultado la sobreexpresión de los genes chondrocytic. Además, se compararon los efectos de CG en la condrogénesis con las de TGF-β1, el factor de crecimiento más comúnmente utilizado para inducir la condrogénesis in vitro en las células madre.

Protocolo

Este protocolo de estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad Católica de Corea (KC16EAME0162) y lleva a cabo según las directrices del NIH. Todos los tejidos se obtuvieron con consentimiento informado por escrito.

1. La gravedad centrífuga Carga y Pellet Cultura

1. Cultivo de células y la cosecha
   1. Cultura ASC (P2-P3; véase la Lista de Materiales) en Modificado Medio-bajo nivel de glucosa de Eagle de Dulbecco (DMEM-LG) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S) a 37 ° C en un incubador humidificado que contiene 5% de CO _2.
   2. Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia, se elimina el medio y se lavan las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS).
   3. Añadir 1 ml de PBS que contenía EDTA 1 mM y se incuba durante 2 min a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO _2.
   4. Toque suavemente la placa de cultivo, añadir 4 ml de medio fresco, transferir las células aun tubo de 15 ml cónico, y centrifugar las células a 250 xg durante 2 min a temperatura ambiente (RT).
2. Centrífuga de carga por gravedad
   1. Después de la centrifugación (paso 1.1.4), eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento y volver a suspender el sedimento en 10 ml de DMEM-LG con 10% de SFB. Contar las células utilizando un hemocitómetro.
   2. Para CG de carga, la transferencia de 2,5 × 10 ⁵ células a un nuevo tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 2400 xg durante 15 min.
3. la cultura de pellets
   1. Inmediatamente después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y añadir 500 l de medio de diferenciación condrogénica definido (CDM, DMEM de alta glucosa suplementado con 1% de FBS,, 100 nM de dexametasona, solución de aminoácidos 1x MEM no esenciales 1% ITS + Premix, 50 g / ml de L-prolina, y 1% de penicilina / estreptomicina). Añadir 50 g / ml de recién preparada de ácido L-ascórbico 2-fosfato en cada cambio de medio. Como control positivo, inducir differentiati condrogénicasen las células no centrifugadas mediante la adición de CDM que contiene 10 ng / ml de TGF-β1.
   2. Colocar los tubos tapados holgadamente que contienen las pastillas en una posición de pie y se incuba a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO _2.
   3. Cambiar el medio cada dos días durante 3 semanas.
4. cultura Micromass
   1. Inmediatamente después de la centrifugación (etapa 1.2.2; 2.400 × g durante 15 min), aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 l de CDM.
   2. Para formar un Micromass, colocar las células resuspendidas en el centro de un pocillo de una placa de 24 pocillos.
   3. Después de 2 h, se añade cuidadosamente 1 ml de MDL a la fuente, el pipeteado contra la pared de la placa para evitar la interrupción de la Micromass. Como control positivo, realizar un cultivo en micromasa con células no centrifugadas mediante la adición de CDM que contiene 10 ng / ml de TGF-β1.
   4. Incubar la Micromass a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO _2.
   5. Cambiar el medio evEry otro día durante 3 semanas.

2. la transcriptasa reversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para detectar la transcripción regulación al alza de diferenciación condrogénica Marcadores

1. En el día 14, utilizar una pipeta para transferir los gránulos esferoidales a un nuevo tubo de 1,5 ml y lavar en 1 x PBS.
2. Se extrae el ARN total de las pastillas utilizando el método de extracción con tiocianato-fenol-cloroformo guanidinio ^9.
3. Sintetizar ADNc a partir de 2 g de ARN total usando la transcriptasa inversa de acuerdo con el protocolo del fabricante (incubar a 42 ° C durante 1 h y después inactivar la enzima a 70 ° C durante 5 min).
4. Realizar PCR con cebadores específicos para los marcadores de diferenciación condrogénica ^10.

3. La tinción para detectar la sobreexpresión de proteínas condrogénicas diferenciación de un marcador

1. sedimentos de células de inclusión en parafina
   1. En el día 21,utilizar una pipeta para recoger las bolitas esferoide y lavarlos con PBS 1x.
   2. Fijar los pellets de esferoides por inmersión en paraformaldehído al 4% durante 24 h.
      Precaución: El paraformaldehído es altamente tóxico. Evitar el contacto con los ojos, la piel o las membranas mucosas. Minimizar la exposición y evitar la inhalación durante la preparación. Use equipo de protección personal adecuado.
   3. Desechar el fijador y enjuagar los sedimentos celulares con agua desionizada (DW).
   4. Colocar una capa de gasa sobre el cassette y transferir los pellets fijas usando una pipeta. Cubrir el sedimento doblando la gasa y cierre la tapa.
   5. Deshidratar los pellets.
      1. Sumergir los gránulos en 70% de etanol (EtOH) durante 5 min a RT.
      2. Sumergir los gránulos en 80% de EtOH durante 5 min a RT.
      3. Sumergir los gránulos en 95% de EtOH durante 5 min a RT.
      4. Sumergir los gránulos en 100% de EtOH durante 5 min a RT. Repetir dos veces.
      5. Sumergir los gránulos en 100% de xileno durante 15 min a RT. Repita TWIce.
   6. Insertar los sedimentos celulares fijos en parafina a 56 ° C en un molde; las pastillas puede ser embebido en parafina utilizando sistemas de procesamiento automatizado de tejidos especializados.
   7. Cortar secciones de 5 micras de espesor del sedimento celular en parafina usando un micrótomo rotatorio.
   8. Flotar las secciones en EtOH al 50% y luego transferirlos a un baño de agua a 50 ° utilizando una diapositiva.
   9. Coloque las secciones flotantes en portaobjetos.
2. Safranina O y tinción con azul Alcian
   1. Rehidratar las secciones de parafina.
      1. Sumergir los portaobjetos en xileno durante 15 minutos. Repetir dos veces.
      2. Sumergir los portaobjetos en EtOH al 100% durante 5 min. Repetir dos veces.
      3. Sumergir los portaobjetos en EtOH al 90% durante 5 min.
      4. Sumergir los portaobjetos en EtOH al 80% durante 5 min.
      5. Sumergir los portaobjetos en EtOH al 70% durante 5 minutos, y luego lavarlos en 1x PBS.
   2. Tinción de las secciones rehidratadas con solución de safranina O 1% y 3% de azul Alcian para30 minutos.
   3. Desechar la solución de tinción y enjuague las secciones con DW.
   4. Manchar las secciones con solución de hematoxilina / eosina (contratinción) durante 1 minuto.
   5. Desechar la solución de tinción y enjuague las secciones con DW.
   6. Colocar una gota de medio de montaje sobre un cubreobjetos después de la eliminación de cualquier agua residual. Con cuidado, coloque la corredera (célula boca abajo) sobre el portaobjetos que contiene el medio de montaje.
   7. Deje que los portaobjetos se sequen durante 2-3 horas a temperatura ambiente.
   8. Capturar imágenes utilizando un microscopio de campo brillante (microscopio vertical automatizado, 50X y 200X).
3. ensayo de inmunofluorescencia
   1. Rehidratar las secciones tal como se describe en la sección 3.2.1.
   2. Sumergir los portaobjetos en tampón de citrato de sodio (citrato de sodio 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6,0) y, a continuación, mantenerlas a una temperatura sub-hirviendo durante 10 min usando un horno de microondas.
   3. Enfriar los portaobjetos durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego lavar con agua del grifo.
   4. Incubar los portaobjetos en un 3%H ₂ O ₂ (en 1x PBS) durante 15 min, y luego los lavar con agua del grifo durante 15 min ^11.
   5. Bloquear los portaobjetos con tampón de bloqueo (10% de suero de cabra normal en PBS) durante 1 h.
   6. Aspirar la solución de bloqueo, y luego aplicar un anticuerpo primario diluido con suero de cabra normal al 5% sobre los portaobjetos.
   7. Incubar los portaobjetos durante la noche a 4 ° C.
   8. Lavar los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante 5 min cada uno.
   9. Incubar las diapositivas de anticuerpo secundario conjugado a un fluorocromo diluido con suero de cabra normal al 5% durante 1 h a TA en la oscuridad.
   10. Lavar los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante 5 min cada uno en la oscuridad.
   11. Incubar los portaobjetos con DAPI (1 mg / ml) durante 10 min, y luego los de lavado dos veces en 1X PBS durante 5 min cada uno.
   12. Colocar una gota de medio de montaje sobre un cubreobjetos después de la eliminación de cualquier agua residual. Con cuidado, coloque la corredera (celular lado negativo) en el medio de montaje.
   13. Deje que los portaobjetos se sequen durante 2-3h en la oscuridad a temperatura ambiente.
   14. Visualizar las diapositivas utilizando microscopía de fluorescencia (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X y 200X) ^12.

Resultados

gravedad centrífuga induce la sobreexpresión de los marcadores de diferenciación condrogénica de las células madre derivadas de tejido adiposo.

Para determinar el grado de fuerza de gravedad centrífuga que es adecuado para inducir la diferenciación condrogénica, ASC se estimularon con diferentes grados de CG (0, 300, 600, 1.200, y 2.400 xg) durante 15 min. Después de la estimulación, las ASC fueron re-sembradas en pl...

Discusión

El estado stemness de las células es muy importante para la sobreexpresión inducida por CG de SOX9. En nuestro estudio, la expresión SOX9 podría ser inducida por CG en ASC-paso temprano (2-3), pero no en ASC-tarde de paso. Se ha informado de que, durante el cultivo, ASC contienen CD34 + células hasta 3 pasajes ^16. ASCs tienden a perder la expresión de CD34 como se pasan las células, lo que resulta en una baja respuesta a CG.

Con la fuerza de gravedad centrífug...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
60 mm Dish	TPP	93060
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
ASC Culture Media Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM Low glucose	Life Technologies	11885-084	growth base media
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	10%
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose	Life Technologies	11995	chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D2915	100 nM
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	1%
Ascorbate-2-phosphate	Sigma Aldrich	A8960	50 μg/mL
L-proline	Sigma Aldrich	P5607	50 μg/mL
ITS	BD	354352	1%
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL
Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probe	A-11037	1:200
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs)	Catholic MASTER Cells