Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Resumen

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Resumen

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.

The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Introducción

Las células dendríticas (DC) son las más importantes células presentadoras de antígeno especializadas de nuestro sistema inmune. Inmaduros países en desarrollo (IDC) residen en la piel o en los tejidos de las mucosas y son, por tanto, una de las primeras células inmunes para interactuar con los patógenos invasores. DCs representan el puente entre el innato y el sistema inmune adaptativo ^1, ya que pueden activar células T y B respuestas después de la detección de patógenos. Además, contribuyen a la respuesta inmune pro-inflamatorias, debido a la secreción de grandes cantidades de citoquinas, tales como IL-1β, IL-6, y IL-12. DCs también activar las células NK y atraer otras células inmunes en el sitio de la infección por quimiotaxis.

DCs se puede dividir en células inmaduras dendríticas (IDC) y células dendríticas maduras (PMD) ² en función de su morfología y función. Tras el reconocimiento de antígenos extraños por uno de los muchos receptores de reconocimiento de patrones (por ejemplo, los receptores tipo toll, de tipo Clectinas, o receptores del complemento) abundantemente expresado en la superficie celular, SIRD sufren cambios importantes y empiezan a madurar. Durante este proceso de maduración, los receptores de captura de antígeno están regulados hacia abajo, mientras que las moléculas esenciales para la presentación de antígenos son regulados hasta ^3. DC maduras hasta de regular los principales complejos de histocompatibilidad I y II (MHC I y II), las moléculas co-estimuladoras como CD80 y CD86, que son esenciales para la presentación del antígeno y la activación de los linfocitos T. Además, se induce la expresión de receptores de quimioquinas CCR7 en la superficie celular, que permite la migración de los DC de los tejidos periféricos a los ganglios linfáticos. La migración se facilita por el "balanceo" de las DC a lo largo de un ligando de quimiocina 19 (CCL19 / MIP-3b) y el gradiente de ligando de quimiocina 21 (CCL21 / SLC) a los ganglios linfáticos ^4-6.

Después de la migración, mDCs presentan el antígeno procesado a Naïve células CD4 ⁺ y CD8 ^+, por lo tanto ininego- una respuesta inmunitaria adaptativa contra el patógeno invasor ^7. Esta interacción con las células T en los ganglios linfáticos también se asocia con la propagación del virus ^8. Otros estudios in vitro revelaron que DCs captura y transferencia del VIH a las células T y que este resultado de la transmisión en una infección vigorosa ^9-12 eficiente. Estos experimentos ponen de manifiesto que en vivo explota a los países en desarrollo VIH como un servicio de transporte desde la periferia hacia los ganglios linfáticos. Durante la presentación del antígeno, las DC secretan interleuquinas clave que dan forma a la diferenciación de las células efectoras T helper, y por lo tanto, el resultado de toda la respuesta inmune contra el microbio se determina en este mismo interacción. Además de tipo 1 (Th1) y de tipo 2 (Th2) T efectoras, otros subconjuntos de células T CD4 ⁺ helper (por ejemplo, tipo 17 (Th17) y tipo 22 (células Th22) T) se han descrito, y su inducción y la función se han investigado a fondo. DCs están implicados además enla generación de células T reguladoras (Tregs) ^13,14. Estas células son inmunosupresores y pueden detener o regular a la baja la inducción o la proliferación de las células T efectoras y son por tanto cruciales para el desarrollo de la inmunidad y la tolerancia.

DC convencionales Humanos (CDC) comprenden varios subconjuntos de células con un origen mieloide (es decir, células de Langerhans (CL) y dérmica y las CD intersticiales) o un origen linfoide (es decir, países en desarrollo plasmocitoide (PDC)). Para los experimentos in vitro o estrategias de vacunación DC, DCs derivadas de monocitos se utilizan habitualmente como modelo para DCs dérmicos. Estas células muestran similitudes en la fisiología, la morfología y la función a las células dendríticas mieloides convencionales. Se generan por la adición de interleucina 4 (IL-4) y de granulocitos y macrófagos, factor estimulante de colonias (GM-CSF) a monocitos aislados de donantes sanos ^12,15-18. Las células dendríticas también pueden ser directamente aisladas de biopsias dérmicas o de las mucosas, o puede incluso be desarrolló a partir de células progenitoras hematopoyéticas aisladas de muestras de sangre de cordón umbilical obtenidas fuera del útero CD34 ^+. Aquí, demostramos cómo se aíslan y se estimularon a partir de sangre humana anti-coagulada después de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de enriquecimiento por centrifugación en gradiente de densidad de monocitos. Después de la incubación durante 5 días, los monocitos humanos bajo condiciones específicas se diferencian en SIRD y están listos para los procedimientos experimentales en un entorno no clínico.

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Protocolo

Ética declaración: Escrito se obtuvo el consentimiento de todos los donantes de sangre que participaron por el Instituto Central de Transfusión de Sangre y Departamento inmunológica, Innsbruck, Austria. El uso de las muestras sobrantes anónimos para fines científicos fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina de Innsbruck.

1. enriquecimiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs)

1. La concentración de las PBMC por centrifugación.
   1. Abra la bolsa de sangre y la sangre dividida en tubos de centrífuga de 50 ml estériles de acuerdo con la cantidad de sangre recibida.
   2. Si es necesario, ajustar el volumen a 50 ml por cada tubo con solución salina tamponada con fosfato estéril de Dulbecco (D-PBS).
   3. Colocar los tubos en una centrífuga y centrifugar ellos a 400 xg durante 15 min a temperatura ambiente (RT) sin freno.
   4. Trasvasar la capa superior que contiene el plasma y las plaquetas con una pipeta serológica de 10 ml estéril, dejando el boundary capa inalteradas.
      NOTA: Si el plasma autólogo en lugar de FCS se utiliza para complementar el medio de cultivo, el plasma debe ser recogida y inactivado por calor, en este paso.
   5. Recoger las células mononucleares (capas) de contorno a partir de dos tubos de centrífuga de 50 ml y transferirlos en un tubo estéril de 50 ml utilizando una pipeta serológica de 10 ml estéril.
   6. Ajuste el volumen a 50 ml para cada tubo estéril utilizando D-PBS.
   7. Colocar los tubos en una centrífuga y centrifugar ellos a 400 xg durante 15 min a TA sin freno.
   8. Trasvasar la capa superior que contiene el plasma y las plaquetas con una pipeta serológica de 10 ml estéril, dejando la capa límite no perturbado.
   9. Recoger las células mononucleares (capas) de contorno de los tubos de 50 ml de centrífuga y transferirlos en dos tubos de 50 ml de recolección estériles usando una pipeta serológica de 10 ml estéril.
   10. Ajuste el volumen a 50 ml por cada tubo con D-PBS estéril.
2. Separaciónde PBMCs por centrifugación en gradiente de densidad (Figura 1).
   1. Preparar cuatro 50 ml tubos y pipetas de 15 ml de medio de gradiente de densidad en cada tubo.
   2. Tomar 25 ml de agrupado células / sangre desde el tubo de recogida (paso 1.1.10) y superponer cuidadosamente el medio de gradiente de densidad.
   3. Colocar los tubos en una centrífuga y centrifugar a 700 xg ellos durante 30 min a RT y sin freno.
3. Recolección y purificación de CMSP.
   1. Trasvasar la capa superior que contiene el plasma y las plaquetas con una pipeta serológica de 10 ml estéril, dejando la capa de PBMC sin molestias.
   2. Recoger la interfase PBMC de todos los tubos y poner en común las células en dos tubos de 50 ml estériles usando una pipeta serológica de 25 ml estéril.
   3. Ajuste el volumen a 50 ml por cada tubo con D-PBS estéril. Colocar los tubos en una centrífuga y centrifugar ellos a 400 xg durante 15 min a 4 ° C con el freno.
   4. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender lacélulas en D-PBS estéril. Reunir las células de ambos tubos y ajustar el volumen a 50 ml con estéril D-PBS.
   5. Colocar los tubos en la centrífuga y centrifugar ellos a 400 xg durante 10 min a 4 ° C con freno.
   6. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en PBS estéril D-. Ajuste el volumen a 50 ml con PBS estéril y D-pipeta de 50 l a un tubo de 1,5 ml que contenía 450 l de D-PBS.
   7. Vortex el tubo de 1,5 ml vigorosamente y recuento de las células en una cámara de Neubauer o cualquier otro instrumento de recuento celular.
   8. Colocar los tubos de 50 ml en la centrífuga y centrifugar ellos a 400 xg durante 10 min a 4 ° C con freno.

2. Aislamiento de monocitos por partículas magnéticas CD14 anti-humanos

1. Etiquetado de las PBMC con partículas magnéticas.
   1. Ajustar la concentración de PBMC a 8 x 10 ⁷ células / ml usando tampón de aislamiento.
   2. Vortex las partículas magnéticas anti-CD14 humano thoroughlY y añadir 50 l de partículas por cada 1 x 10 ⁷ PBMCs.
   3. Mezclar la suspensión de células de partículas a fondo y se incuba a TA durante 30 min.
2. La separación de las fracciones positivas y negativas.
   1. Ajuste el volumen hasta 12 ml usando tampón de aislamiento.
   2. Preparar seis tubos de fondo redondo estériles y pipeta de 2 ml de la suspensión celular de partículas en cada tubo.
   3. Inmediatamente colocar los tubos en el imán. Incubar durante 10 min a TA.
   4. Mantener los tubos en el imán y cuidadosamente extrayendo el sobrenadante. El sobrenadante contiene la fracción negativa.
   5. Retire el tubo del imán y añadir 2 ml de tampón de aislamiento.
   6. Suavemente volver a suspender las células pipeteando arriba y abajo.
   7. Colocar los tubos de nuevo en el imán. Incubar durante 5 min a TA.
   8. Mantener los tubos en el imán y cuidadosamente extrayendo el sobrenadante. El sobrenadante contiene la fracción negativa.
   9. Retire los tubos del imán y añadir 2 ml de tampón de aislamiento a cada tubo. Suavemente volver a suspender las células pipeteando arriba y abajo.
   10. La transferencia de la fracción positiva a un tubo estéril de 50 ml y ajustar el volumen a 50 ml usando estéril D-PBS.

3. La estimulación de monocitos aislados con IL-4 y GM-CSF

1. Se coloca el tubo en la centrífuga y girar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C con freno.
2. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 50 ml de D-PBS.
3. Pipeta 50 l en un tubo de 1,5 ml que contenía 450 l de D-PBS. Vortex el tubo de 1,5 ml vigorosamente y recuento de las células en una cámara de Neubauer u otro instrumento de recuento celular.
4. Se coloca el tubo 50 ml en la centrífuga y girar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C con freno.
   NOTA: Si la fracción negativa, que contiene linfocitos de sangre periférica (PBL), también es necesario, lleve a cabo el lavado y el recuento de pasos similares a tmanguera de la fracción positiva (pasos 3.1-3.5).
5. Ajustar la concentración celular a 1 x 10 ⁶ / ml con medio de cultivo pre-calentado (RPMI 1640 suplementado con solución de L-glutamina FBS inactivado por calor y 1% 10%) y la pipeta 3 ml / pocillo en placas de 6 pocillos.
   NOTA: Si se usa plasma autólogo inactivado por calor, sustituir el FCS al 10% con plasma autólogo 1-5%, de acuerdo con el montaje experimental.
6. Estimular los monocitos con recombinante humano IL-4 (250 U / ml) y GM-CSF humano recombinante (1000 U / ml) pipeteando las citoquinas directamente en el medio de cultivo. Se incuba a 37 ° C y 5% de _CO2.
7. Re-estimular las células con IL-4 (250 U / ml) y GM-CSF (1000 U / ml) después de 48 hr pipeteando las citoquinas directamente en el medio de cultivo.
   NOTA: Si hay algún signo de la acidificación mostrados por el indicador de pH en el medio, reemplace la mitad del medio con medio de cultivo pre-calentado.
8. Cosecha de las células dendríticas inmaduras en el día 5 deaguas abajo experimentos pipeteando las células cultivadas fuera de la placa de 6 pocillos y en un tubo de centrífuga de 50 ml después de pipetear el medio de cultivo arriba y abajo un par de veces.
9. Contar las células y manchar una muestra de monocitos aislados con anticuerpos anti-humanos contra CD11b, CD11c, y DC-SIGN / CD209, junto con un colorante de viabilidad celular. Para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos durante la tinción de la superficie, el uso de receptor Fc bloquea reactivos o tampones albúmina de suero bovino (BSA) es muy recomendable.
10. Analizar la muestra usando el tinte de viabilidad celular, de acuerdo con el protocolo del fabricante, mediante la realización de la citometría de flujo para evaluar la pureza y la viabilidad de las SIRD generados.

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Resultados

Después de la centrifugación de la sangre anticoagulada usando un colchón de sacarosa, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se enriquecen en una interfase en la parte superior del medio de gradiente de densidad (Figura 1). Después de que los PBMCs se extraen, el análisis FACS se realiza para caracterizar las diferentes poblaciones de células dentro de los PBMCs utilizando marcadores de linaje (por ejemplo, CD3 para los linfocitos T, CD1...

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Discusión

Este protocolo describe la generación de células dendríticas derivadas de monocitos (MDDCs) a través del aislamiento de los monocitos humanos de sangre anticoagulada utilizando un ensayo basado en nanopartícula magnética. En este protocolo, las etapas de centrifugación se llevan a cabo aguas arriba del procedimiento de aislamiento de células, lo que conduce a un enriquecimiento de la fracción de PBMC. Aunque las células se pierden durante la centrifugación, para superponer el contenido de una bolsa de sangre ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19	BD Biosciences	555415
APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e	BD Biosciences	551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles	BD Biosciences	557769
BD Imagnet	BD Biosciences	552311
BSA (Albumin Fraction V)	Carl Roth	EG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Costar	3506
Density gradient media: Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Bio-Sciences	17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 10 ml Serological Pipet	Corning	357551
Falcon 25 ml Serological Pipet	Corning	357525
Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube	Corning	352070
Falcon Round-Bottom Tubes	Corning	352054
FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a	BD Biosciences	555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent)	Tonbo biosciences	13-0870
GM-CSF	MACS Miltenyi Biotec	130-093-862
Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America)	Gibco	10500-064
Hettich Rotanta 460R	Hettich	---
IL-4 CC	PromoKine	C-61401
Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x)	BD Biosciences	552362
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513
Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin	VWR	211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2	BD Biosciences	555398
PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46	BD Biosciences	551265
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R0883
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020