El cultivo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En tres dimensiones en el Laboratorio

Resumen

Se presenta un método sencillo de construir sistemas de cultivo de nematodos 3D llamados NGT-3D y NGB-3D. Éstos se pueden utilizar para estudiar la aptitud de los nematodos y los comportamientos en los hábitats que son más similares a los naturales Caenorhabditis elegans hábitats que las placas de cultivo estándar en 2D elegans C. laboratorio.

Resumen

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Introducción

The study of the nematode Caenorhabditis elegans in the laboratory has led to seminal discoveries in the field of biology over the last five decades¹. C. elegans was the first multicellular organism to have its genome sequenced in 1998², and it has been invaluable in understanding the contributions of individual genes to the development, physiology, and behavior of a whole organism. Scientists now are looking to further understand how these genes may contribute to the survival and reproductive fitness of organisms in their natural environments, asking questions about ecology and evolution at the genetic level^3-5.

C. elegans once again can provide an excellent system to answer these questions. However, little is known about C. elegans biology in natural nematode habitats, and there are no current methods to simulate controlled natural conditions of C. elegans in the laboratory. In the lab, C. elegans is cultivated on the surface of agar plates seeded with E. coli bacteria⁶. In nature, however, C. elegans and related nematodes can be found sparsely inhabiting soils throughout the globe, but they are specifically found thriving in rotting fruits and vegetative matter^7,8. These three-dimensional (3D) complex environments are quite different from the simple 2D environments to which worms are exposed to in the laboratory.

To begin to answer questions about the biology of nematodes in a more natural 3D setting, we have designed a 3D habitat for laboratory cultivation of nematodes we called Nematode Growth Tube 3D or NGT-3D for short⁹. The goal was to design a 3D growth system that allows for comparable growth, development, and fertility to the standard 2D Nematode Growth Media (NGM) plates¹⁰. This system supports the growth of bacteria and nematodes over their entire life cycles in 3D, allows worms to move and behave freely in three dimensions, and is easy and inexpensive to manufacture and employ.

In the current study, we provide a step-by-step method to manufacture NGT-3D and evaluate worm development and fertility. In addition to assessing worm fitness in 3D, we sought to image, video, and assess worm behavior and physiology in 3D cultivation. Thus, in addition to NGT-3D, we present here an alternate method called Nematode Growth Bottle 3D or NGB-3D, for the microscopic imaging of C. elegans during 3D cultivation. This will be especially important for the study of known behaviors identified in 2D, and the identification of novel behaviors unique to 3D cultivation.

Protocolo

1. Preparar soluciones para NGT-3D y 3D-NGB

1. Preparar las siguientes soluciones estériles: 1 L de solución 0,1454 M de NaCl, 1 L de 1 M CaCl _2, 1 L de 1 M MgSO _4, Lisogenia Broth (LB), 1 L de 1 M KPO ₄ tampón (108,3 g de KH ₂ PO ₄ y 35,6 g de K ₂ HPO _4, y llenar _H2O hasta 1 l). La producción de NGM el uso de estas soluciones se pueden encontrar en un protocolo anterior ^10.
2. soluciones autoclave a 121 ° C, 15 min.
3. Preparar 50 ml de una solución estéril 5 mg / ml de colesterol. En un tubo cónico de 50 ml, mezclar 0,25 g de colesterol y 50 ml de 99,99% de etanol y se mezcla bien. No esterilizar en autoclave. Esterilizar la solución colesterol usando una jeringa de 50 ml con un filtro de jeringa de 0,45 micras. También se eliminará cualquier colesterol no disuelto.
4. (Opcional) Preparar 10 ml de una 150 mM de 2'-desoxi-5-fluorouridina (FUdR) stock. En un tubo cónico de 15 ml, mezclar 0,3693 gde FUdR y 10 ml de agua destilada. Agitar bien.

2. Preparar Cultura de las bacterias para NGT-3D y 3D-NGB

1. Inocular 10 ml de caldo LB con bacterias. Las bacterias habituales utilizados para la alimentación de C. elegans es E. coli cepa OP50.
2. Cultura de la inoculación de bacterias a 37 ° C en una incubadora con agitación durante la noche.
3. En la preparación para una dilución en serie, alícuotas 9 ml de la solución de NaCl en 15 ml tubos cónicos estériles. Por ejemplo, parte alícuota de 9 ml en un total de 7 tubos para hacer una dilución 10 ^-7 de la cepa OP50 E. coli.
4. Usando una pipeta estéril 1,000 l, pipetear 1 ml de cultivo bacteriano o un cultivo bacteriano diluido en el nuevo tubo estéril con 9 ml de solución de NaCl y agitar bien la mezcla de 10 ml. Repita hasta que se alcanza la dilución bacteriana deseada.
   NOTA: La dilución bacteriana deseada depende del tipo y condición de bacterias, así como las condiciones experimentales exactas.Por ejemplo, un 10 ^-6 - dilución de la cepa de E. coli OP50 10 ^-8 era suficiente para producir a partir de 1 - 200 colonias por 6,5 ml tubo NGT-3D. Worms fiable desarrollan y se reproducen normalmente cuando el número de colonias era más de 60, que se produjo a una dilución de 10 ^{-6-10 -7.} Para NGB-3D, utilizar una dilución de 10 ^-8.

3. Hacer NGT-3D y 3D-NGB (200 ml)

1. Después de la preparación del cultivo bacteriano, la mezcla 0,6 g de NaCl, 1 g de agar granulado, y 0,5 g de peptona en un matraz de 500 ml. Insertar una barra de agitación magnética en el matraz.
2. Añadir 195 ml de agua destilada y cubrir la boca del matraz con papel de aluminio.
3. Autoclave 121 ° C durante 15 min.
4. Colocar el matraz en autoclave caliente sobre una placa de agitación, y se agita a una velocidad moderada durante al menos 2 horas. Se enfría el matraz a 40 ° C. Asegúrese de que se enfríe lo suficiente como para continuar de aquí a altas temperaturas puede dar lugar a pérdida de transparencia del agar acabado.Sin embargo, temperaturas más bajas pueden resultar en el endurecimiento prematuro de la agar.
   1. (Opcional) Para acelerar el proceso de enfriamiento, colocar el matraz en un baño de agua a 40 ° C 15 min antes de colocar sobre una placa de agitación.
5. Cuando la temperatura de los medios de agar alcanza 40 ° C, añadir 200 l 1 M CaCl _2, 200 l de solución de colesterol 5 mg / ml, 200 l 1 M MgSO ₄ y 5 ml 1 M KPO ₄ tampón como la solución sigue agitar a concentraciones finales de 1 mM CaCl colesterol _2, 5 mg / ml, 1 mM MgSO _4, 1 mM KPO _4.
   1. (Opcional) Para el ensayo de vida útil NGT-3D añaden 80 l de FUdR 150 mM a una concentración final de 120 mM ^12.
6. Añadir 6 ml de los 10 ml de cultivo bacteriano diluido a partir del paso 2.4 en el matraz directamente.
   1. (Opcional) Para NGT-3D, retire 6 ml de medio de agar antes del paso 3.6 y mantenerlo caliente por separado. Este medio se utiliza para los libre de bacteriascapa superior.
7. El uso de procedimientos estériles, prescindir de los medios de comunicación en una cámara de cultivo estéril. Asegúrese de que la cubierta de la cámara se cierra herméticamente.
   1. (Opcional) Para prevenir la formación de colonias de bacterias de la superficie superior de la agar, hacer una capa de libre de bacterias medios de agar de la etapa 3.6.1 en la parte superior antes de los medios de comunicación desde el paso 3.7 se endurece por completo. Esto creará una zona libre de bacterias en la parte superior de la NGT-3D.
   2. Para NGT-3D, verter 6,5 ml de medio a los 8 ml tubos de ensayo de plástico transparente para hacer una capa de agar bacterias, y dispensar cuidadosamente 200 l de los medios de comunicación libre de bacterias en la parte superior de los medios de comunicación semi-endurecido 3D para hacer una fina bacterias- capa libre en la parte superior.
   3. Para NGB-3D, verter 65 ml de medio a los 25 cm de botella de cultivo de células de plástico transparente ^2. Esta cantidad debe llenar el cuerpo de la 25 cm botella de cultivo ² celular.
8. Deja cámaras verticalmente a temperatura ambiente durante una semana para permitir que las colonias bacterianas que crecena un tamaño considerable de al menos 1 mm de diámetro.
   1. (Opcional) Para el ensayo de vida útil en NGT-3D, cámaras de cubierta con papel de aluminio para evitar la degradación de la luz de FUdR.

4. Medir la aptitud de la población de gusanos en NGT-3D (Cría relativa Ensayo de tamaño)

1. Escoja un gusano de L4 etapa usando un alambre de platino recogida y traslado en una placa de NGM sin bacterias. Permitir que el gusano se mueva libremente alrededor de unos pocos minutos para eliminar bacterias adheridas a su cuerpo.
2. Repita el paso 4.1 y asegúrese de que el gusano está libre de bacterias. En general, dos repeticiones de 4.1 son suficientes.
3. Con cuidado, coloque el gusano limpia en la superficie de los medios de comunicación en 3D con un pico alambre de platino. El gusano, finalmente, debe entrar en el agar agar en la matriz 3D.
4. Cierre la tapa sin apretar que permite un poco de aire para entrar en el tubo, pero evitando el secado de los medios de agar.
5. Incubar durante 96 horas a 20 ° C.
6. Después de 4 días, cerrar las tapas firmemente y coloque lacámara de cultivo NGT-3D en un baño de agua a 88 ° para fundir el agar. El calor mata los gusanos pero sus cuerpos permanecen intactos.
   NOTA: El uso de tubos de 8 ml de NGT-3D, 20 - 30 min de incubación suele ser suficiente.
7. Usando una pipeta de vidrio, transferir los medios fundidos en un 9 cm placa petri de plástico. No se recomiendan pipetas de plástico, como los gusanos pueden a menudo se adhieren a ellos.
8. El uso de un microscopio de disección estéreo de transmisión, contar el número de gusanos en la L3, L4 y etapas adultas. No contar los gusanos que son L2 escenario y más joven, ya que las generaciones F1 y F2 se pueden confundir aquí. Por lo tanto, este ensayo es un ensayo de tamaño de la camada relativa en lugar de un total de ensayo tamaño de la camada.

5. Imagen y comportamiento de estos animales en el Registro NGB-3D

1. Escoja un gusano de L4 etapa usando un alambre de platino recoger y eliminar las bacterias adheridas a la superficie mediante la transferencia a una placa de NGM sin bacterias y permitiendo que se mueva libremente durante unos minutos.
2. Repita el paso 5.1 para asegurarse de que el worm está libre de bacterias.
3. Colocar con cuidado el gusano limpio en el centro de la superficie de agar de la NGB-3D cerca del cuello de la botella con un pico alambre de platino. El gusano, finalmente, debe entrar en el agar agar en la matriz 3D.
4. Cierre la tapa sin apretar que permite un poco de aire para entrar en el tubo, al tiempo que evita el secado de los medios de agar.
5. Imagen o grabar el gusano bajo un microscopio de disección estéreo de transmisión. Ajuste el enfoque como el gusano se mueve a través de la matriz 3D.

Resultados

La construcción de NGT-3D es un protocolo simple y directo que resulta en un tubo de ensayo de agar-llena de pequeñas colonias bacterianas espaciados en todo el agar (Figura 1A). Los gusanos pueden moverse libremente a través de la matriz de agar, la búsqueda y el consumo de las colonias bacterianas. Para confirmar si C. elegans pueden reproducirse y crecer normalmente en NGT-3D, se comparó la fertilidad y el desarrollo de las larvas en 3D con placas están...

Discusión

El cultivo de laboratorio de C. elegans usando las placas de medio de crecimiento de nematodos clásicos fue crucial para los cientos de descubrimientos importantes que la investigación en C. elegans ha proporcionado. A continuación, presentamos nuevos métodos para cultivar C. elegans en un entorno que refleja con mayor precisión sus hábitats naturales tridimensionales. Aunque otros métodos se han utilizado para observar C. elegans en 3D ^13, este es el primer protocol...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth, Miller (Luria-Bertani)	Difco	224620
Sodium chloride	DAEJUNG	7548-4400	58.44 MW
Agar, Granulated	Difco	214530
Peptone	Bacto	211677
Calcium chloride, dihydrate	Bio Basic	CD0050	2*H2O; 147.02 MW
Cholesterol	Bio Basic	CD0122	386.67 MW
Ethyl alcohol	B&J	RP090-1	99.99%; 46.07 MW
Magnesium sulfate, anhydrous	Bio Basic	MN1988	120.37 MW
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous	Bio Basic	PB0445	136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridine	Tokyo Chemical Industry	D2235	246.19 MW
Potassium phosphate, dibasic, anhydrous	Bio Basic	PB0447	174.18 MW
Multi-Purpose Test Tubes	Stockwell Scientific	ST.8570	8 ml
Test Tube Closures	Stockwell Scientific	ST.8575
Cell Culture Flask	SPL Lifescience	70125	25 cm2
Research Stereo Microscope	Nikon	SMZ18
High-Definition Color Camera Head	Nikon	DS-Fi2
PC-Based Control Unit	Nikon	DS-U3
NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software	Nikon	MQS32000