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Resumen

Este protocolo describe la generación de tumores de vejiga ortotópico murino en ratones C57BL / 6J hembra y el seguimiento del crecimiento del tumor.

Resumen

Este protocolo describe la generación de tumores de vejiga en ratones C57BL / 6J hembra utilizando la línea celular de cáncer de vejiga murino MB49, que ha sido modificado para secretar de próstata humano de antígeno específico (PSA), y el procedimiento para la confirmación de la implantación del tumor. En resumen, los ratones se anestesiaron usando drogas inyectables y están hechos para poner en la posición dorsal. La orina está desocupado desde la vejiga y 50 l de poli-L-lisina (PLL) se instila lentamente a una velocidad de 10 l / s 20 utilizando un catéter 24 G IV. Se deja en la vejiga durante 20 min por tapando el catéter. Se retira el catéter y el PLL está desocupado por una suave presión sobre la vejiga. Esto es seguido por la instilación de la línea celular de cáncer de vejiga murino (1 x 10 5 células / 50 l) a una velocidad de 10 l / 20 s. El catéter se tapó para evitar la evacuación prematura. Después de 1 h, los ratones se revivieron con un fármaco de reversión, y la vejiga esté desocupado. La tasa de instilación lenta es importante,ya que reduce el reflujo vesico-ureteral, lo que puede hacer que los tumores se producen en el tracto urinario superior y en los riñones. La línea celular debe estar bien volvió a suspenderse para reducir la aglutinación de las células, ya que esto puede conducir a tamaños irregulares después de la implantación del tumor.

Esta técnica induce tumores con alta eficiencia. El crecimiento tumoral se controló mediante la secreción de PSA urinaria. monitoreo marcador PSA es más fiable que el ultrasonido o imágenes de fluorescencia para la detección de la presencia de tumores en la vejiga. Los tumores en los ratones generalmente alcanzan un tamaño máximo que repercute negativamente en la salud por cerca de 3 - 4 semanas si no se tratan. Mediante el control de crecimiento del tumor, es posible diferenciar los ratones que fueron curados de las que no fueron implantados con éxito con los tumores. Con el análisis de punto final únicamente, el último puede ser erróneamente supone que se han curado mediante terapia.

Introducción

El objetivo de este método es generar tumores de vejiga murino ortotópico y para controlar los tumores implantados con la mayor precisión posible, de manera que los ratones sin la implantación del tumor no se cree que se han curado a análisis de punto final. En general, el método que se muestra reducirá la necesidad de un gran número de ratones para el análisis experimental y garantizar una mayor precisión en la determinación de los resultados terapéuticos.

El desarrollo de un modelo ortotópico de cáncer es importante, ya que la implantación de las células tumorales por vía subcutánea no recapitula el medio ambiente de la enfermedad clínica o permiten el desarrollo de estrategias terapéuticas. La arquitectura de la vejiga permite la instilación de las terapias de cáncer de vejiga directamente en la vejiga con efectos sistémicos mínimos. Por lo tanto, los modelos animales que recapitular este entorno, tales como un modelo ortotópico, son importantes para evaluar nuevas terapias. Las conclusiones extraídas de cualquier montaje experimental se dependent sobre las limitaciones del modelo.

Varias técnicas han sido desarrolladas para la producción de los tumores de vejiga ortotópico en ratones. Estos dependen de dañar la capa de glicosaminoglicano de la vejiga, lo que permite las células tumorales para ser implantado. Las técnicas utilizadas incluyen la electrocauterización, que resulta en un único punto de daño en la pared de la vejiga, lo que lleva al desarrollo de tumores en un sitio en la vejiga 1,2. Sin embargo, la tasa de éxito de la implantación del tumor usando electrocauterización es dependiente del operador que varía de 10 - 90%, y que incluye el peligro de que la pared de la vejiga se punza, lo que lleva a los tumores en desarrollo en la cavidad peritoneal. Cauterización química se lleva a cabo utilizando nitrato de plata, lo que daña la pared de la vejiga 3. Del mismo modo, el ácido se ha utilizado para dañar la pared de la vejiga 4. La tripsina también se ha utilizado para dañar la vejiga, así 5. Estos métodos pueden resultar en el desarrollo de más de un tumor en la vejiga.Además, existe el peligro de un daño severo a la vejiga si los productos químicos se dejan en contacto con la pared de la vejiga durante demasiado tiempo. El método desarrollado por Ninalga et al. utiliza el poli-L-lisina cargada positivamente (PLL) 6 moléculas para recubrir la pared de la vejiga; esto permite que las células tumorales con carga negativa a pegarse a la capa de glicosaminoglicano de la vejiga. Este método da como resultado en general en más de un tumor en desarrollo en la vejiga, pero la implantación del tumor es a 80 - 100% de 4,7. Técnicamente, también es el procedimiento más fácil de realizar. Para asegurarse de que los tumores que se desarrollan son bastante uniforme en tamaño, es importante que las células tumorales no se agrupan en grupos grandes antes de la implantación.

Con el fin de evaluar la eficacia terapéutica, lo mejor es llevar a cabo este estudio en ratones con tumores bastante de tamaño similar. Por lo tanto, un buen sistema de detección que puede cuantificar el tamaño del tumor pronto después de la implantación es importante. Varias estrategias han de abejasn utiliza para evaluar tumores. Estos incluyen imágenes por resonancia magnética (IRM) 8-10, 11 de fluorescencia, bioluminiscencia 12,13, ultrasonido 14, y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) 15,16. Mientras que la RM y la ecografía no requieren modificaciones de las células tumorales, hay una necesidad de equipos y agentes de contraste para resonancia magnética sensibles. Los ensayos por fluorescencia, luminiscencia, y basados ​​en ELISA requieren modificación de las células tumorales para expresar proteínas marcadoras que se pueden detectar por estos métodos. Por luminiscencia, se requiere un sustrato para la detección de la actividad de la luciferasa; Por lo tanto, hay un paso adicional y aumento del coste. Tanto la luminiscencia y fluorescencia requieren equipo especializado. Para producir fluorescencia, proteína fluorescente verde (GFP) de ciclación, que es catalizada por el oxígeno molecular, se requiere. Por lo tanto, la expresión de GFP puede ser variable dentro de una masa tumoral en función de acceso al oxígeno, haciendo de este un marcador más fiable 17. La modificación de la línea celular de cáncer de vejiga murino MB49 para secretar próstata humana Antígeno Específico (PSA) 15,16 como un marcador sustituto es otra estrategia. Estos marcadores también proporcionan un medio alternativo para confirmar la presencia del tumor en la terminación del experimento, por lo que una alternativa a la inmunohistoquímica. Este estudio reporta el método PLL de la implantación del tumor ortotópico y presenta una comparación de los sistemas de detección de tumores, a saber, ELISA, fluorescencia, y las imágenes por ultrasonido.

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Protocolo

Todos los animales de trabajo conforme con las directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) sobre el uso de animales y gastos de envío (número de Protocolo 084/12) de la Universidad Nacional de Singapur.

1. Cultivo Las células MB49-PSA in vitro y medición en la secreción de PSA

  1. Mantener murino de cáncer de vejiga de células MB49-PSA 15 en completa de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mmol / l de L-glutamina, y 0,05 mg / ml de penicilina-estreptomicina en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2. Añadir 200 g / ml de higromicina B para mantener la presión de selección de las células secretoras de PSA.
  2. Para determinar la secreción de PSA, placa de 1 x 10 6 células en una placa de cultivo de 6 pocillos y se incuba a 37 ° C en presencia de 5% de CO2 durante 48 h.
  3. Dos días más tarde, recoger el sobrenadante para la medición de PSA.
    1. Con una pipeta Pasteur, transferir el supernatant a un tubo de centrífuga de 15 mL.
    2. Centrifugar durante 5 minutos a 250 xg para eliminar las células flotantes y escombros. Si el ensayo de PSA se lleva a cabo en un día diferente, almacenar el sobrenadante a - 30 ° C en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Si no es así, continúe con el siguiente paso inmediatamente.
    3. Determinar la concentración de PSA utilizando un PSA libre humano kit ELISA 7.
  4. Enumerar las células sembradas.
    1. Utilizando una pipeta Pasteur, se lavan las células suavemente con 1 ml de DMEM. Aspirar y eliminar por completo los medios de comunicación.
    2. Añadir 1 ml de medio fresco y raspar suavemente con un raspador de células para desalojar las células del pozo.
    3. Transferir las células a un tubo de microcentrífuga y volver a suspender a fondo para asegurar una suspensión de una sola célula.
    4. Mezclar volúmenes iguales de la suspensión de células y una solución de azul de tripano al 0,4%. Contar las células vivas (que no ocupan el colorante) utilizando un hemocitómetro.
  5. Calcular la expresión de PSA como ngde PSA / ml de medio / 10 6 células. La expresión de PSA de células MB49-PSA para la implantación en ratones es 80 - / 10 6 células 120 ng / ml.

2. La determinación de la sensibilidad de los niveles de PSA por ELISA y análisis de PCR en tiempo real

  1. Placa células MB49-PSA en medio completo DMEM en una placa de cultivo de 6 pocillos con diferentes cantidades de células MB49 parentales de tal manera que hay un máximo de 1 x 10 6 células por pocillo (es decir, 10 0, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5, o 10 6 células MB49-PSA se cultivan con 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, o 10 0 MB49 células, respectivamente).
  2. Un día después, recoger el sobrenadante para la medición de PSA como se describe en el paso 1.3. Determinar la concentración de PSA utilizando un PSA libre humano kit ELISA 7.
  3. Extraer el ARN de las células.
    1. Lyse lacélulas directamente en la placa mediante la adición de 1 ml de reactivo de extracción de ARN.
    2. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente y transferir el lisado de células a un tubo de microcentrífuga. Añadir 0,2 ml de cloroformo y agitar las muestras vigorosamente durante 15 s. Incubarlos durante 3 min a temperatura ambiente.
    3. Centrifugar las muestras a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. transferir con cuidado la fase acuosa superior (0,5 ml) a un tubo nuevo sin perturbar la interfase.
    4. Añadir 0,5 ml de alcohol isopropílico. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Centrifugar las muestras a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por completo, sin perturbar el precipitado de ARN en la parte inferior del tubo.
    5. Lavar el sedimento una vez con 1 ml de 75% de etanol. Centrifugar a 7500 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar todo el etanol y dejar que el precipitado se seque al aire durante 10 minutos.
    6. Se disuelve el ARN en 30 l de agua libre de nucleasa. Incubar durante 5 min a 60 ° C para aumentar la tanlubility.
    7. Cuantificar el ARN midiendo la absorbancia usando espectroscopia ultravioleta (UV) a 260 nm (A260). Para evaluar la pureza de ARN, medir la absorbancia a 280 nm (A280) y calcular la relación A260 / A280 que debe estar por encima de 1,6.
  4. Reverse-transcribir ADNc a partir de 2 g de ARN.
    1. Preparar la mezcla de reacción en hielo y la transfiere a tubos de 0,2 ml.
    2. Centrifugar brevemente los tubos de girar el contenido y para eliminar las burbujas de aire.
    3. Cargar los tubos en el termociclador y llevar a cabo la transcripción inversa en las siguientes condiciones: 60 min a 37 ° C seguido de 5 min a 95 ° C. Una vez completado el proceso, mantener las muestras de cDNA a 4 ° C.
    4. Almacenar las muestras a - 30 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
  5. Realizar un análisis de PCR en tiempo real para PSA y beta actina citoplasmática. beta actina se utilizó para normalizar las muestras. Realizar el ensayo en 100 ng de ARN transcrito inverso en un pla 96 pocilloste. Analizar todas las muestras por triplicado. Realizar 40 ciclos con los parámetros siguientes: 2 min a 50 ° C, 10 min a 95 ° C, 15 s a 95 ° C para la desnaturalización, y 1 min a 60 ° C. Establecer el límite más bajo de detección a un ciclo umbral (CT) de 35; Por lo tanto, cualquier muestra con un valor CT más allá de 35 es considerado no detectable.

3. El mantenimiento de la tumorigenicidad de la línea celular MB49-PSA

NOTA: La prolongada crecimiento in vitro conduce a una pérdida de tumorigenicidad. Para mantener la tumorigenicidad, la línea celular MB49-PSA es pasado a través del ratón, al menos una vez cada 2 años.

  1. Células.
    1. Cosecha de células en crecimiento exponencial raspando suavemente con un raspador celular estéril. Mezclar volúmenes iguales de la suspensión de células y una solución de azul de tripano al 0,4%. Contar las células vivas utilizando un hemocitómetro. No implante si más de 20% de las células han muerto.
    2. Calcular la cantidad de células vivas requerida (1 x 107 células / ml) y transferirlos a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 250 xg durante 5 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento celular en DMEM medio en blanco. Repita el lavado tres veces para eliminar todo rastro de FBS antes de la implantación.
    3. Mantener la suspensión de células en hielo hasta que los ratones están listos para su implantación.
  2. Implante las células tumorales por vía subcutánea en ratones en el flanco dorsal.
    1. Anestesiar un de 4 a 6 semanas de edad de ratón C57BL6 / J usando una mezcla de la ketamina anestésicos y medetomidina (75 mg / kg y 1 mg / kg, respectivamente), inyectado por vía intraperitoneal en 0,1 ml por 10 g de peso corporal.
    2. Afeitarse el flanco derecho de exponer la piel.
    3. El uso de un par de pinzas, levantar la piel para separarlo de los músculos subyacentes e inyectar 0,1 ml de la suspensión de células (1 x 10 6 células) por vía subcutánea con una aguja de 24 G. Al retirar la aguja, apretar el sitio de inyección durante 5 a 10 s para que las células tumorales hacenno fugarse del lugar de la inyección.
    4. Revive el ratón con una inyección subcutánea de atipamezol (1 mg / kg) a 0.1 ml por 10 g de peso corporal.
  3. Monitorear el crecimiento del tumor cada dos días midiendo el diámetro del tumor usando calibres. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula v = (ab 2) / 2, donde "a" es la dimensión más larga y "b" es la anchura perpendicular, tanto en mm.
  4. Cuando el volumen del tumor es de al menos 50 mm 3 (aproximadamente 7 días), la eutanasia el ratón con CO 2. Extirpar la masa tumoral con un par de fórceps y tijeras estériles en condiciones asépticas y lugar en DMEM.
  5. En una placa de cultivo de 6 pocillos, pelos en el tumor en trozos pequeños con bisturís estériles. Use un émbolo ml 1 jeringa como una "maja" desagregar aún más el tumor.
  6. Añadir 3 ml de DMEM completo y mantener las células en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2.
  7. Una vez que las células se adhieren al plate (entre uno y dos días), retire los medios de comunicación, escombros, y las células no adherentes aspirando suavemente con una pipeta Pasteur estéril. Lavar dos veces con DMEM. Tenga cuidado para no molestar a las células.
  8. Añadir 1 ml de DMEM y recoger las células por raspado con un rascador de células. Para seleccionar y expandir colonias individuales, el recuento de las células utilizando un hemocitómetro y la placa de 1 célula por pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos. Células de cultivo en DMEM con 200 mg / ml de higromicina B a 37 ° C y 5% de CO2.
  9. Cambiar el soporte y antibiótico cada 4 - 5 días. Monitorear las células hasta que están en alrededor de 80-90% de confluencia. Re-placa de las células en una placa de cultivo de 24 pocillos mediante pipeteado para desalojar las células del pozo.
  10. Una vez que las células en la placa de cultivo de 24 pocillos son confluentes, desalojarlos raspando con un raspador de células y la placa en una placa de cultivo de 6 pocillos.
  11. Se tamizan los diferentes clones para la secreción de PSA, como se describe en el paso 1. Cryo-preservar el clon con el más alto secreto PSAiones y usarlo para futuros experimentos con ratones.

4. Implantación del tumor

NOTA: Cada ratón se implantaron 1 x 10 5 células MB49-PSA en 50 l de medio DMEM en blanco en la vejiga. Debido al espacio muerto en el catéter, siempre preparar volumen extra (por lo menos 100 l adicionales por ratón). Un enfoque alternativo sería el uso de una jeringa llena de aire como se describe por Kasman et al. 5 en lugar de una jeringa llena.

  1. Células.
    1. Un día antes de la implantación, cuando las células son de aproximadamente 80% de confluencia, el paso de las células tumorales MB49-PSA en completa medios DMEM (suplementado con 10% FBS, 2 mmol / l de L-glutamina, 0,05 mg / ml de penicilina-estreptomicina, y 200 g / ml de higromicina B) a 37 ° C y 5% de CO 2 en una relación de división de 1: 2.
    2. En el día del procedimiento, recoger las células por raspado suavemente con un raspador de células estéril. Mezclar volúmenes iguales de la suspensión de células yun 0,4% de tripano solución de azul. Contar las células vivas utilizando un hemocitómetro. No implante si más de 20% de las células han muerto.
    3. Calcular la cantidad de células vivas requerida (2 x 10 6 células / ml) y transferirlos a un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a 250 xg durante 5 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento celular en DMEM medio en blanco. Repita el lavado tres veces para eliminar todo rastro de FBS antes de la implantación.
    4. Mantener la suspensión de células en hielo hasta que los ratones están listos para su implantación.
  2. Permitir que el de 4 a 6 semanas de edad, hembra C57BL / 6J para aclimatarse durante una semana antes del procedimiento. Todos los animales de trabajo debe realizarse en una cabina de seguridad biológica para mantener las condiciones estériles.
    1. Pesar cada ratón y se inyecta anestesia (75 mg / kg de ketamina y 1 mg / kg de medetomidina) por vía intraperitoneal en 0,1 ml por 10 g de peso corporal. Pesos corporales deben estar entre 17 y 22 g. Confirmar la anestesia mediante la observación de ninguna respoNSE después de una pizca dedo del pie.
    2. Para la identificación, marcar el oído utilizando un punzón oreja.
    3. Se inyecta solución o compuesto de sodio lactato de Hartmann por vía intraperitoneal en 0,1 ml por 10 g de peso corporal cada 1 - 2 h para la hidratación.
    4. Aplique una pomada oftálmica estéril para ambos ojos utilizando una bombilla de algodón estéril, ya que el reflejo del parpadeo se pierde bajo anestesia y los ojos se seque. Vuelva a aplicar cuando sea necesario.
    5. Coloque los ratones en posición supina sobre toallas de papel en la parte superior de un bloque de calor (que se activa por contacto con el aire) para mantener la temperatura corporal y la cinta de las patas traseras hacia abajo.
  3. Con un dedo, aplique una leve presión sobre la región abdominal inferior y recoger la orina desde la vejiga en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Esta muestra sirve como valor basal de PSA urinaria.
  4. Retirar estéril poli-L-lisina (PLL) en una jeringa de 1 ml y adjuntar un catéter de calibre 24 IV, con el estilete de la aguja retirado. Aplique lubricante a la punta del catéter y insert el catéter a través de la uretra hasta la vejiga utilizando pinzas para guiar el cateterismo. Pare cuando se sienta resistencia. NOTA: Los investigadores deben discutir con su personal veterinario acerca de la necesidad de que el uso de un gel lubricante con anestésico para instilaciones intravesicales y el uso de analgésicos después del procedimiento.
  5. Infundir 50 l de PLL lentamente, a una velocidad de 10 l cada 20 s, para evitar el reflujo vesico-ureteral 18. Dejar el catéter en la vejiga durante 20 min con un tapón para evitar la salida de flujo.
  6. Después de 20 minutos, retirar el catéter y desocupar la vejiga de cualquier contenido presionando suavemente en la región inferior del abdomen. El uso de un vacío jeringa de 1 ml, arrastrar cualquier sedimento que quedan fuera del catéter.
  7. Mezclar las células MB49-PSA a fondo con la pipeta y retirarlas en una jeringa de 1 ml. Una el catéter y aplicar lubricante. Inculcar 50 l de células de 1 x 10 5 a un ritmo lento de 10 l cada 20 s. Vuelva a colocar el tapón enel catéter. Dar a los ratones de control 50 l de solución salina.
  8. Después de 1 hora, retirar los catéteres y desocupar la vejiga de cualquier contenido. Retire la cinta en las patas traseras y colocar los ratones en sus lados ventrales. Revive los ratones mediante inyección subcutánea de la droga reversión (1 mg / kg atipamezol) a 0.1 ml por 10 g de peso corporal.
  9. Monitorear los ratones hasta que se observa la motilidad. Devolver los ratones a sus jaulas.
  10. Al término de un protocolo de detección de tumores (secciones 5, 7 u 8), la eutanasia a los ratones utilizando CO 2. la detección de tumores post-mortem se describe en la sección 6.

5. Monitoreo crecimiento tumoral con ELISA

NOTA: La presencia y el crecimiento del tumor en ratones se controla midiendo la secreción de PSA en la orina. Los investigadores deben consultar con su personal veterinario sobre el control de la salud animal y el bienestar de la implantación post-tumor y puntos finales.

  1. Hay dos métodos para recoger la orina de los ratones.
    1. Recoger durante la noche la orina mediante la colocación de un solo ratón en una jaula metabólica individual diseñada para separar la orina a partir de material fecal. Si la puesta a punto no tiene refrigeración, añadir un inhibidor de la proteasa (100 l) en el tubo de recogida de orina para evitar la degradación del PSA durante la noche. Sin embargo, el número de jaulas metabólicas disponibles limita la utilidad de este método de recogida de orina.
    2. Donde es logísticamente imposible utilizar jaulas metabólicas (como en las habitaciones ABSL2), punto de recoger la orina usando un dedo para ejercer una presión suave sobre la región abdominal inferior, mientras que los ratones son anestesiados como se describe en el paso 4.2.1. Esto se hace generalmente antes se instila la terapia. Desde nuestra experiencia, al menos 150 l de orina se pueden recoger 1 h después de la anestesia.
  2. Colocar inmediatamente la orina recogida en hielo. La hematuria puede ser visible desde la segunda semana después de la implantación del tumor. Las muestras altamente hemolizadas pueden afectar el análisis ELISA. Por lo tanto, la orinadebe ser colocado en hielo y se procesan de forma rápida después de la recogida.
  3. Centrifugar los tubos de orina a 6.700 xg durante 5 min a 4 ° C para eliminar células o restos.
  4. Para normalizar la diferencia en la producción de orina entre los ratones, alícuota de la orina en tubos nuevos y almacenar a -30 ° C hasta la realización de los análisis para PSA usando un kit de ELISA 7 y creatinina usando un kit de ensayo 7. A pesar de que los ratones no producen PSA, hay bajos niveles de unión no específica detectados usando el ELISA. Toma de muestras se consideraron positivas, el umbral debe ajustarse a valores mayores que en los ratones normales + 3 desviaciones (SD) 15.

6. Detección de la presencia del tumor con PCR en tiempo real

  1. Al terminar, diseccionar la cavidad abdominal del ratón y ubicar la vejiga. Extirpar la vejiga y colocarlo en un criovial. Congelar inmediatamente en nitrógeno líquido.
  2. Se extrae el ARN mediante homogeneización de los tejidos en un extr ARNreactivo de acción.
  3. Realizar la transcripción y análisis en tiempo real PCR inversa para PSA, como se describe anteriormente en la sección 2.

7. Seguimiento crecimiento tumoral con la imagen de fluorescencia

  1. Etiqueta 1 x 10 7 células MB49-PSA con un colorante fluorescente del infrarrojo cercano 19.
  2. Re-placa y la cosecha de las células marcadas en los días 4, 7, 11, 14, 18, y 21 para comprobar si las células conservan la viabilidad y la fluorescencia por citometría de flujo 20.
  3. Implantar las células MB49-PSA marcados en vejigas de ratones, como se describió anteriormente en la sección 4.
  4. Controlar el crecimiento tumoral usando un sistema de imágenes de fluorescencia cada dos días.
  5. En el día de formación de imágenes, pesar y anestesiar a los ratones utilizando una mezcla de la ketamina anestésicos y medetomidina (75 mg / kg y 1 mg / kg, respectivamente), inyectado por vía intraperitoneal en 0,1 ml por 10 g de peso corporal.
  6. Afeitar el área abdominal para exponer la piel.
  7. Coloque los ratones en la cámara de formación de imágenes y adquirirlas imágenes de las cámaras de aire utilizando el software suministrado con el sistema de imagen.
  8. Revive los ratones mediante inyección subcutánea de un fármaco de reversión (1 mg / kg atipamezol) a 0.1 ml por 10 g de peso corporal.

8. Monitoreo crecimiento del tumor con alta frecuencia de imágenes por ultrasonido

  1. tumores de implantes en ratones, tal como se describe anteriormente en la sección 4.
  2. Cada dos días, monitorear el crecimiento del tumor mediante imágenes de ultrasonido.
  3. En el día de formación de imágenes, pesar y anestesiar a los ratones utilizando una mezcla de la ketamina anestésicos y medetomidina (75 mg / kg y 1 mg / kg, respectivamente), inyectado por vía intraperitoneal en 0,1 ml por 10 g de peso corporal.
  4. Afeitar el área abdominal para exponer la piel.
  5. Inculcar 100 l de solución salina estéril al 0,9% en la vejiga mediante un catéter de calibre 24 IV. La solución salina se distender la vejiga y mejorar la visibilidad durante la ecografía.
  6. Coloque el ratón en la plataforma de ultrasonido y aplicar gel conductor de la lower abdomen.
  7. Bajar la sonda de mano para la piel y adquirir imágenes en modo B de la vejiga en la plataforma de imágenes 21.
  8. Revive los ratones por drogas reversión de inyección por vía subcutánea (1 mg / kg atipamezol) a 0.1 ml por 10 g de peso corporal.

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Resultados

se encontró la secreción de PSA a partir de células MB49 a variar con el medio de crecimiento. MB49-PSA se cultiva en medios DMEM porque esto da lugar a aumento de la secreción de PSA (Figura 1A). Con el fin de determinar la sensibilidad de la PSA ELISA y PCR en tiempo real, diferentes números de células MB49-PSA secretoras se mezclaron con células parentales MB49. PSA ELISA detecta un mínimo de 1 x 10 5 células secretoras de PSA / 1 x 10 6...

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Discusión

Los pasos más críticos en el protocolo son 1) el mantenimiento con éxito la tumorigenicidad de la línea celular; 2) asegurar la secreción de PSA medible antes de la implantación de células tumorales en ratones; 3) la generación de una suspensión de una sola célula para la implantación con el fin de reducir la variación en el tamaño del tumor; y 4) infundir células a una velocidad lenta para prevenir el reflujo vesico-ureteral, lo que resulta en la implantación de células tumorales en el riñón.

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Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
MB49-PSA cellsN/AN/Aref (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 mediaHyCloneSH30027.01 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mediaBiowestL0102
Fetal Bovine Serum (FBS) South AmericanBiowestS1810
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, PremiumBiowestS181B
Fetal Bovine Serum (FBS)HyCloneSH30088.03 
L-glutamineBiowestX0550
Penicillin-StreptomycinBiowestL0022
Hygromycin BInvitrogen10687-010
free PSA (Human) ELISA kitAbnovaKA0209
TRIzol Reagent for RNA extraction Ambion15596026
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase InhibitorApplied Biosystems4374967
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse ActbApplied Biosystems4331182Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3Applied Biosystems4331182Hs00426859_g1
C57BL/6J female miceIn Vivos4 - 6 wk old
Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine)Local pharmacy
Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole)Local pharmacy
Ear punchElectron Microscopy Sciences72893-01
Hartmann's solution or Compound sodium lactateB Braun
Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointmentAlcon
Heat pack - HotHands handwarmersHeatmax Inc
Introcan Certo IV catheterB Braun425130024 G x 3/4″
Aquagel Lubricating jellyLocal pharmacy
Poly-L-lysine solution, 0.01%,SigmaP4707
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche4693159001
Quantichrom Creatinine Assay KitBioAssay SystemsDICT-50 
Fluorescent dye - VivoTrack 680Perkin ElmerNEV12000 
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition SolutionAmbion4427575
NameCompanyCatalog numberComments
Equipment and Software
7500 Realtime PCR SystemApplied Biosystems
7500 Software v2.3Applied Biosystems
Metabolic CageTecniplast Vertical type rack for 12 cages
BD FACSCanto I system BD Biosciences
BD FACSDiva software v7BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo imaging system Caliper Life Sciences 
Living Image Software v3.1Caliper Life Sciences 
Vevo 2100 imaging system VisualSonics 

Referencias

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