El poder de la simplicidad: Erizo de mar como embriones<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelos de desarrollo para el estudio celular de la célula-a-complejo de señalización de red Interacciones

Resumen

Este artículo de vídeo detalla una sencilla metodología vivo que se puede utilizar para caracterizar de manera sistemática y eficiente los componentes de las vías de señalización complejos y las redes de regulación en muchos embriones de invertebrados en.

Resumen

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

Introducción

las redes de genes reguladores (GRNs) y las vías de transducción de señales establecen la expresión espacial y temporal de los genes durante el desarrollo embrionario que se utilizan para construir el plan de adultos cuerpo del animal. Célula a célula de las vías de transducción de señales son componentes esenciales de estas redes reguladoras, que proporcionan el medio por el cual las células se comunican. Estas interacciones celulares establecer y perfeccionar la expresión de genes reguladores y diferenciación en y entre los diversos territorios durante la embriogénesis ^{1, 2.} Las interacciones entre los moduladores secretadas extracelulares (ligandos, antagonistas), receptores y co-receptores controlan las actividades de las vías de transducción de señales. Un surtido de moléculas intracelulares transduce estas entradas que resulta en la expresión alterada de genes, la división y / o la forma de una célula. Si bien muchas de las moléculas clave que se utilizan en los niveles extracelulares e intracelulares en las principales vías sonconocido, es un conocimiento incompleto debido en gran parte a la complejidad de las vías de señalización individuales. Además, las diferentes vías de señalización a menudo interactúan uno con el otro, ya sea positiva o negativamente en el extracelular, intracelular y los niveles de la transcripción ^{3, 4, 5, 6.} Es importante destacar que los componentes centrales de las vías de transducción de señales están altamente conservadas en todas las especies de metazoos, y, notablemente, la mayoría de las principales vías de señalización menudo realizan funciones de desarrollo similares en muchas especies cuando se comparan los organismos de filos estrechamente relacionados, en particular, ^{7, 8, 9, 10, 11.}

El estudio de la señalización durante el desarrollo es una tarea de enormes proporciones en cualquier organismo, y hayson varios retos importantes para el estudio de las vías de señalización en la mayoría de los modelos deuterostome (vertebrados, los cordados invertebrados, hemicordados y equinodermos): 1) En los vertebrados hay un gran número de posibles ligando y las interacciones de receptor / co-moduladores, moléculas de transducción intracelular, así como potenciales interacciones entre diferentes vías de señalización debido a la complejidad del genoma de ^{12, 13, 14;} 2) La morfología compleja y movimientos morfogenéticos en los vertebrados a menudo hacen que sea más difícil la interpretación de las interacciones funcionales en y entre las vías de transducción de señales; 3) Análisis de la mayoría de especies modelo de invertebrados deuterostome no equinodermo están limitados por las ventanas cortas de gravidez con la excepción de algunas especies de tunicados ^{15, 16.}

losembrión de erizo de mar tiene algunas de las limitaciones mencionadas anteriormente y ofrece muchas cualidades únicas para la realización de un análisis detallado de las vías de transducción de señales in vivo. Estos incluyen los siguientes: 1) La relativa simplicidad del genoma del erizo de mar reduce significativamente el número de posibles ligando, receptor / co-receptor y la molécula de transducción intracelular las inter- ^17; 2) Los GRNs que controlan la memoria y en los patrones de las capas germinales embrionarias y los principales ejes están bien establecidos en embriones de erizo de mar, ayudar en la comprensión del contexto normativo de la célula / territorio que recibe las señales ^{18, 19;} 3) Muchas vías de transducción de señal pueden ser estudiados entre las etapas de escisión y gástrula primeros cuando los embriones se componen de una sola epitelio estratificado cuya morfología es más fácil de analizar; 4) Las moléculas implicand en las vías de los erizos de mar son fáciles de manipular señalización; 5) Muchos erizos de mar están grávidas de 10 a 11 meses al año (por ejemplo, Strongylocentrotus purpuratus y variegatus Lytechinus).

A continuación, presentamos un método para caracterizar de manera sistemática y eficientemente los componentes de las vías de señalización que especifican y territorios de patrón en embriones de erizo de mar para ilustrar las ventajas que varios sistemas modelo de invertebrados ofrecen en el estudio de los mecanismos moleculares complejas.

Protocolo

1. Rendimiento estrategia de diseño de alta morfolino

1. Identificar un gen (s) de interés (por ejemplo, enfoque de genes candidatos, el análisis de cis-regulador, RNAseq y pantallas diferenciales / o proteómica).
2. Utilice genómica, transcriptómica, y los datos de expresión génica disponibles en los sitios web se actualizan con frecuencia (por ejemplo SpBase http://www.echinobase.org ²⁰ y S. purpuratus genoma Búsqueda http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) para determinar que el perfil de expresión espacio-temporal se solapa con el mecanismo de desarrollo en cuestión. Si no hay datos de expresión está disponible, a continuación, generar cebadores qPCR y / o un antisentido en situ sonda para evaluar el patrón de expresión génica.
3. Después de determinar el patrón de expresión espacial y temporal, obtener la secuencia de ADN de los sitios web genómicos.
   1. Para la generación de oligonucleótidos de morfolino traducción de bloqueo, obtener la secuencia of la 'región traducida por la ONU (5' UTR 5) directamente aguas arriba del codón de iniciación de bases de datos de etiqueta de secuencia expresada (EST) disponibles en SpBase o S. purpuratus Genoma sitios web de búsqueda. Si esta información no está disponible para el gen de interés, a continuación, realizar 5 'RACE.
   2. Para diseñar un empalme morfolino-bloqueo, la búsqueda de la secuencia genómica que incluye los exones e intrones utilizando la herramienta de andamio BLASTN en SpBase o S. purpuratus genoma herramienta de búsqueda.
4. Utilice el diseño de página web oligonucleótido http://oligodesign.gene-tools.com con el fin de diseñar la secuencia de pares de bases deseada morfolino 25.
   1. Para un morfolino de traslación de bloqueo, utilizar la secuencia de ARNm de 5 'a 3' como la fuente de la secuencia diana de la traducción. Incluir la secuencia 5 'UTR (aproximadamente 70 nucleótidos aguas arriba del sitio de inicio de transcripción), además de 25 bases de la región codificadora (aguas abajo del sitio de inicio) con el codón de inicio marcada wiTH paréntesis (ATG).
   2. Para un empalme morfolino-bloqueo, seleccione el exón-intrón o secuencia límites exón-intrón e incluyen 50 bases (25 bases de la secuencia exón y 25 bases de la secuencia del intrón) en torno a las regiones limítrofes. Analiza el genoma con la secuencia de morfolino para verificar que la secuencia es única.

2. La microinyección de morfolino oligonucleótidos

1. Preparar 3 mM de soluciones madre de los oligonucleótidos de morfolino mediante la adición de 100 l de agua libre de nucleasa en el vial morfolino 300 nmol.
   NOTA: No utilice agua tratada con DEPC para la resuspensión debido pirocarbonato de dietilo puede dañar el morfolino.
2. Por primera vuelta de la reconstitución por el vial que contiene la solución de oligonucleótido durante 30 s a la velocidad máxima (14.000 - 16.000 xg) y agitar brevemente, el calor a 65 ° C durante 5 a 10 minutos, vórtice brevemente y mantener a la población de morfolino en la sala temperatura durante al menos 1 h. solución de morfolino s se almacenan de -20 ° C a + 4 ° C.
3. Preparar la solución de inyección que contiene oligonucleótidos de morfolino a la concentración deseada. Esta solución por lo general contiene 20% de glicerol o KCl 125 mM como vehículo y 15% de FITC-dextrano (isotiocianato de fluoresceína dextrano 10.000 MW 2,5 mg solución madre / l). FITC-dextrano y otros conjugados de dextrano fluorescentes se utilizan habitualmente para identificar embriones inyectados por microscopía de epifluorescencia. soluciones de inyección almacenar a -20 ° C.
4. Calentar la solución morfolino a 65 ° C en un bloque de calor o baño de agua durante por lo menos 2 - 5 min.
5. Brevemente girar la solución morfolino durante 30 s a la velocidad máxima (14.000 - 16.000 xg) y agitar durante 1 min y centrifugar a toda velocidad (14.000 - 16.000 xg) durante al menos 10 min.
6. Cargar las agujas de inyección con la solución morfolino. Para un protocolo detallado microinyección consulte Stepicheva y Song, 2014 ²¹ y Saludos y Ettensohn de 2004"> 22.

3. Fijación y en el Protocolo Situ a las 24 h después de la fecundación (HPF) en S. purpuratus embriones

NOTA: Este protocolo se modificó a partir de Arenas-Mena et al. , 2000 ²³ y Sethi et al. 2014 ^24.

1. Fijación
   1. Añadir unas gotas de fijador (véase más adelante) a los pocillos que contenían embriones, mezclar suavemente con la pipeta, y dejar que se asienten. Retire la solución de fijación, y luego mezclar los embriones con dos lavados de 180 mu l adicionales de fijador.
      NOTA: Es importante mezclar bien los embriones durante los lavados por pipeteo suave hacia arriba y abajo varias veces. El no hacerlo puede disminuir la relación señal a ruido.
   2. Dejar los embriones para fijar en el segundo lavado fijador durante 50 min a 1 h a temperatura ambiente (RT) en paraformaldehído al grado microscopía electrónica de 4% que consiste en MOPS 10 mM pH 7,0, 0,1% de Tween-20, y artificial seawater (ASW). Hacer esta solución fresca cada vez para obtener mejores resultados. Además, para la facilidad y practicidad embriones se fijan en placas de 96 pocillos.
      1. Para 20 ml uso fijador 5 ml 16% de paraformaldehído, 15 ml ASW, 200 l 1 M MOPS pH 7.0, y 20 l de Tween-20.
   3. Lavar 5 veces a temperatura ambiente con 180 l de MOPS tampón de lavado que consiste en 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl y 0,1% de Tween-20 durante al menos 5 min o hasta que los embriones de caer al fondo del pozo. Una vez más, es importante para mezclar completamente los embriones en el tampón de lavado pipeteando suavemente arriba y abajo varias veces. tampón de lavado MOPS se puede utilizar durante 2 días si se almacenan a 4 DO.
      1. Por 40 ml de MOPS lavan uso de búferes de 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml de NaCl 5 M, 32 ml _dH2O y 40 l de Tween-20.
      2. Fija los embriones pueden ser almacenadas a 4 ^° C durante 2 días.
         NOTA: Si el almacenamiento de los embriones ya fijos, a continuación, añadir azida de sodio al 0,2% en MOPS tampón de lavado para evitar el crecimiento bacteriano.
2. Pre-hibridación
   1. Aspirar el MOPS tampón de lavado y añadir 180 l de una proporción de 2: 1 de MOPS tampón de lavado en tampón de hibridación, la mezcla embriones en la solución mediante pipeteado suave varias veces, y se incuba durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente. El tampón de hibridación consiste en 70% de formamida, 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml de BSA y 0,1% de Tween-20.
      1. Para uso 40 ml de tampón de hibridación 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml de NaCl 5 M, 4 ml _dH2O, 0,04 g de BSA, y 40 l de Tween-20. Mezclar bien por agitación, añadir 28 ml de formamida, y agitar de nuevo.
   2. Retire la proporción 2: 1 de MOPS de lavado y tampones de hibridación y añadir 180 l de una proporción de 1: 2 de MOPS tampón de lavado en tampón de hibridación, la mezcla embriones en la solución, y se incuba durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente.
   3. Antes de la hibridación de la sonda mezclar suavemente los embriones en 100 - 150 ml de tampón de hibridación. Incubar embriones a 50 ° C durante al menos 1marido.
      NOTA: La incubación de los embriones durante la noche es aceptable. Antes de la incubación, sellar los pocillos con una lámina adhesiva con el fin de evitar la evaporación.
3. Hibridación
   1. En un tubo separado añadir 0,1 - 0,3 ng / l de sonda y 500 mg / ml de ARNt de levadura en un tampón de hibridación, a continuación, vórtice suavemente para crear solución de la sonda. tRNA de levadura se añade a la solución de la sonda para disminuir la unión no específica de la sonda anti-sentido. Precalentar esta solución a 50 ° C, y el tampón de aspirado de la hibridación.
   2. Mezclar embriones pre-hibridado en 100 l de la solución de la sonda, el sello con una lámina adhesiva, y se hibrida a 50 ° C durante 2 a 7 días, dependiendo de la sonda (la sonda foxq2 se puede incubar durante 2 días).
      NOTA: Los tiempos de incubación puede variar en función de la sonda. Algunos genes expresados ​​en niveles bajos requieren hasta una incubación de 7 días. placas de 96 pocillos se pueden colocar en una caja de humedad como un seguro contra la evaporación si los ADHESive hoja no sellar adecuadamente.
   3. Lavar 5 veces a 50 ° C con 180 l de MOPS recién hechos tampón de lavado para un total de 3 h. A continuación, lavar 3 veces (15 min) con 180 l de MOPS de tampón de lavado a temperatura ambiente. Recuerde mezclar embriones en el tampón de lavado cada vez con la pipeta suavemente varias veces.
4. La incubación de anticuerpos
   1. Aspirar el MOPS tampón de lavado y se mezclan los embriones en 180 l de tampón de bloqueo que consiste en 10% de suero de oveja normal y 5 mg / ml de BSA en MOPS tampón de lavado y se incuba durante al menos 45 minutos a temperatura ambiente o 4 ° C durante la noche.
   2. Eliminar el tampón de bloqueo y luego mezclar embriones en tampón de bloqueo que contiene una dilución 1: 1500 de anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina diluido en tampón de bloqueo. Incubar toda la noche a temperatura ambiente en una placa de sellado para evitar la evaporación. NOTA: No deje de anticuerpos en más de una noche.
   3. Lavar los embriones de 6 veces (5 min o hasta que caen embriones) en MOPS tampón de lavado a temperatura ambiente. Los embriones puedenser almacenados durante la noche a 4 ° C.
5. En desarrollo in situ
   1. Lavar embriones 3 veces (10 min) a temperatura ambiente con tampón de pH 9,5 recién hecho que consiste en 0,1 M Tris pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl ₂ mM 50 mM, levamisol 1, y 0,1% de Tween-20.
      1. Por 20 ml pH 9,5 tampón uso 2 ml de Tris 1 M pH 9,5, 400 l de NaCl 5 M, 1 ml 1 M MgCl _2, 20 l de Tween-20, 16,6 ml _dH2O, y 0,0048 g levamisol.
   2. Incubar los embriones a 37 ° C en tampón de tinción protegido de la luz. tampón de tinción se compone de 10% dimetil formamida, 4,5 l / mL 4-Nitro cloruro de azul tetrazolio (NBT) y 3,5 l / ml 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) en recién hecho tampón de pH 9,5 .
      1. Para 1 ml de tampón de tinción utilizar 100 l dimetil formamida, 4,5 l NBT y BCIP 3,5 l.
   3. Detener la reacción de la fosfatasa alcalina mediante el lavado de 3 a 5 veces en tampón de lavado MOPS. La reacción wiº la sonda foxq2 normalmente tarda 30 minutos a 1 hora. Algunas sondas pueden necesitar de incubación durante la noche a RT, ya sea o 4 ° C.
   4. Mezclar los embriones en una solución de lavado MOPS 70% y 30% de glicerol. El glicerol proporciona un índice de refracción necesario para microscopía. Los embriones se pueden almacenar en esta solución durante varias semanas. Sellar las placas con parafina de plástico para evitar la evaporación.
6. Preparación de los portaobjetos y la captura de imágenes
   1. Preparar un portaobjetos mediante la disposición de tres pequeñas tiras de cinta adhesiva de doble cara en un triángulo con pequeños espacios entre las tiras en un portaobjetos.
   2. La transferencia de los embriones en el lavado MOPS 70% y solución de glicerol al 30% hasta el centro del triángulo y cubrir con un cubreobjetos.
   3. Sellar el cubreobjetos mediante la aplicación de una capa de esmalte de uñas alrededor de los bordes del cubreobjetos.
   4. Capturar imágenes utilizando un microscopio de luz compuesto con un objetivo de 20X y una cámara adjunta.

Resultados

En el embrión de erizo de mar hemos demostrado que 3 de señalización Wnt diferentes ramas (Wnt / β-catenina, Wnt / JNK, y Wnt / PKC) ^{4, 25} interactúan para formar una red de señalización Wnt que gobierna anterior-posterior patrón (AP). Una de las consecuencias más importantes de estos eventos de señalización es que el expresado en términos generales neuroectodermo anterior (ANE) GRN inicial se restringe a un pequeño ...

Discusión

La metodología que aquí se presenta es un ejemplo que ilustra el poder de utilizar embriones con menos complejidad genómica y morfológica de los vertebrados para entender las vías de transducción de señales y GRNs que rigen los mecanismos fundamentales del desarrollo .. Muchos laboratorios están usando ensayos similares durante el desarrollo de erizo de mar temprano para diseccionar el vías que participan en otros eventos de especificación del destino celular de señalización (por ejemplo, Notch, Hed...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino	Gene Tools LLC	Customized	More information at www.gene-tools.com
Glycerol	Invitrogen	15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)	Invitrogen, Life Technologies	D1821	Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
MOPS	Sigma Aldrich	M1254-250G
Tween-20	Sigma Aldrich	23336-0010
Formamide	Sigma Aldrich	47671-1L-F
Yeast tRNA	Invitrogen	15401-029
Normal Goat Serum	Sigma Aldrich	G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody	Roche	11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole)	Sigma Aldrich	L9756-5G
Tris Base UltraPure	Research Products Internationall Corp	56-40-6
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate	Roche	11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)	Roche	11 383 213 001
Dimethyl Formamide	Sigma Aldrich	D4551-500mL
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541-5KG
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761-500G
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	M7506-2KG
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016-500G