La cuantificación de la histidina quinasa bacteriana autofosforilación mediante un ensayo de nitrocelulosa Encuadernación

Resumen

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Resumen

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

Introducción

respuesta de adaptación es crucial para la supervivencia bacteriana. Con el fin de detectar y responder a los cambios ambientales, las bacterias utilizan un sistema de estímulo-respuesta conocida como señalización de dos componentes. ^1,2 En un sistema de dos componentes típico, la histidina quinasa detecta un estímulo cognado, autophosphorylates su residuo de histidina conservado, a continuación, transfiere el fosfato a un residuo de aspartato conservado en el dominio receptor de una proteína de regulador de la respuesta. ³ Este evento desencadena un cambio en la actividad del regulador de la respuesta, que estimula un efecto aguas abajo. ^4,5 Por lo tanto, las bacterias son capaces de sentir y adaptarse a los cambios en el medio ambiente local. Algunos sistemas de señalización de dos componentes se desvían de este arquetipo. En algunos casos, el dominio sensorial de la histidina quinasa es una proteína independiente, que detecta directamente la entrada sensorial y modifica la actividad de quinasa a través de una interacción proteína-proteína. ^{6 - 8} Sin embargo, el fondoamental proceso y el papel global del sistema sigue siendo el mismo. señalización de dos componentes es un sistema de estímulo-respuesta omnipresente que es esencial para la supervivencia bacteriana, y histidina quinasas juegan un papel crítico en la transducción de la señal. ⁹

A pesar de la importancia de la histidina quinasas a la biología bacteriana, siguen siendo mal caracterizado. Esto es debido a la inestabilidad inherente de fosfohistidina, y la falta de un método práctico para la medición de la autofosforilación. Fosfohistidina es más lábil que fosfoserina, fosfotreonina y fosfotirosina. ¹⁰ Por lo tanto, las técnicas que se utilizan comúnmente para analizar quinasas Ser / Thr / Tyr no son aplicables para histidina quinasas. ¹¹ ensayos in vitro para el estudio de histidina quinasas en gran medida se han limitado a autorradiografía SDS-PAGE. ^12,13 En este método, [γ- ³² P] -ATP se incuba con la quinasa, y la fosforilación de la quinasa se analiza por polelectroforesis en gel de yacrylamide (PAGE) seguido por autorradiografía del gel. Este método puede ser usado para monitorear la autofosforilación de la quinasa, así como phosphotransfer de la quinasa a un regulador de la respuesta. Sin embargo, este método tiene notables deficiencias. Los ensayos basados ​​en páginas son de bajo rendimiento y consume mucho tiempo. Tales limitaciones no son propicias para la caracterización de una proteína y la determinación de sus parámetros cinéticos. Un método alternativo para el estudio de quinasas de histidina que fue publicado recientemente utiliza anticuerpos fosfohistidina para detectar la autofosforilación. ¹⁴ Si bien este método tiene la ventaja de distinguir entre 1-fosfohistidina y 3-fosfohistidina, dependiendo de la instrumentación utilizada para la detección, este método puede no ofrecer una amplia gama dinámica o límite superior alto de detección. Por lo tanto, hay una necesidad para un ensayo más rápido, menos laborioso y más sensible que puede ser utilizado para estudiar estas proteínas importantes.

A continuación, describimos ydemonstrate un ensayo de unión de nitrocelulosa cuidadosamente desarrollado que se puede utilizar para cuantificar la autofosforilación de histidina quinasas bacterianas purificadas in vitro. Este ensayo es un mayor rendimiento y menos tiempo que los ensayos basados ​​en páginas. El método también utiliza la radiación Cherenkov para la cuantificación fosfohistidina, que ofrece un alto límite superior de detección y un gran rango dinámico. El ensayo se puede usar para determinar los parámetros cinéticos para la histidina quinasas.

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Protocolo

Precaución: Este protocolo requiere una formación adecuada en el uso y manejo de materiales radiactivos. Utilice el equipo de protección personal requerido al realizar este ensayo, incluyendo protección contra la radiación beta. Los residuos radiactivos debe manejarse con cuidado, ya que se generan grandes cantidades de residuos durante la fase de lavado del experimento. Asegúrese de que los residuos se almacena en un recipiente en posición vertical, como un gran cubo o una botella que no va a ser volcado fácilmente o se derrama. Una vez concluido el experimento, transferir cuidadosamente todos los residuos líquidos de marcado, los contenedores de residuos radiactivos. Manejar todos los materiales con cuidado, y mantener un contador Geiger cerca para vigilar el espacio de trabajo para la contaminación.

NOTA: Este protocolo es una versión revisada de un ensayo se informó anteriormente de nuestro grupo. ¹⁵ phosphohistidine estabilidad en H ₃ PO ₄ debe ser probado por cualquier histidina quinasa no caracterizado antes de utilizar este método. El phosphohistidine stprueba de la capacidad se ha descrito previamente. ¹⁵ Un control negativo que no contiene quinasa debe ser incluida. Esto es necesario con el fin de restar la señal de fondo de cada muestra, y asegúrese de que [γ- ³² P] -ATP se lava suficientemente de la membrana.

1. Preparación de Reactivos y materiales

1. Purificar histidina quinasas de cultivo bacteriano antes de usar este ensayo.
   1. Se purifica una histidina quinasa (ID gen 1.189.383) a partir de Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802) para el desarrollo de este ensayo. Clonar la quinasa en el vector de expresión pET-23aHis-VET utilizando NdeI y sitios de restricción XhoI, y llevar a cabo la mutagénesis dirigida al sitio para producir el mutante construir Vp1876 D499A.
   2. Transformar el plásmido en E. coli BL21 (DE3) pLysS, y hacer crecer las células en medio TB a 37 ° C. culturas suplemento con ampicilina (100 mg / ml) y cloranfenicol (34 mg / ml), y crecer con agitación(250 rpm) a un OD ₆₀₀ de 0,6.
   3. Inducir la expresión de proteína con IPTG a una concentración final de 25 mM, y crecer cultivos durante la noche a 16 ° C. Las células de la cosecha por centrifugación (5.000 xg), se lisan por sonicación, y se centrifuga para eliminar los restos celulares (18.000 xg).
   4. Se purifica el quinasa marcada con His usando Ni-NTA agarosa. Confirmar pureza por SDS-PAGE. Optimizar la purificación para cada proteína, y confirmar la pureza antes de usar este ensayo.
2. Preparar la solución de lavado mM H 25 ₃ PO _4. Para 1 L de agua desionizada destilada, añadir H ₃ PO ₄ a una concentración final de 25 mM. El pH de esta solución es aproximadamente 2,0. Coloca 25 mm de H ₃ PO ₄ en hielo.
3. Preparar una solución 13x social de 325 mm de H ₃ PO _4, que se utiliza para apagar la reacción quinasa. El pH de esta solución es aproximadamente 1,5. Coloque 325 mm de H ₃ PO ₄ en hielo.
   NOTA: H ₃ PO ₄ A una concentración final de 25 mM suficientemente apaga la reacción, y también ayuda a bloquear fosfato radiomarcado que no está unido a la histidina de la unión a la membrana de nitrocelulosa.
4. Preparar una solución de tampón de reacción de stock 4x que contiene mM Tris-HCl pH 8,0 160, KCl 600 mM, 16 mM MgCl _2, y 40% de glicerol.
5. Cuantificar la concentración de histidina quinasa de proteínas por métodos establecidos de concentración (Bradford, UV-Vis, etc.). ^16,17 Preparar una solución de histidina quinasa con una concentración que es 4 veces la concentración final deseada. Para obtener la señal sea adecuada, la concentración final de proteína en la reacción debe ser idealmente al menos 5 micras.
6. Preparar una radiomarcado 4x [γ- ³² P] -ATP solución con la concentración 4x apropiada de ATP no marcado y etiquetado: relación no marcado para el experimento.
   NOTA: La cantidad de [γ- ^32P] -ATP que debe ser incluida en esta mezcla depende de la cantidad de [^7; - ³² P] -ATP última instancia, se vio para cada reacción. Hemos obtenido señal adecuada con concentraciones finales que varían de entre 0,1 - 5 Ci por reacción. Es importante que la etiqueta: unlabeled relación ATP se mantiene constante para todas las reacciones en un experimento dado. Las diluciones en serie se deben hacer cuando se desean múltiples concentraciones de ATP, ya que esto así mantener el marcado: no marcado constante relación de ATP en todas las concentraciones. Las concentraciones finales de ATP típicamente varían de 10 M a al menos 1 mM, y cada concentración se deben ensayaron por triplicado para obtener datos cinéticos fiables.
7. 96- aparato de transferencia así punto
   1. Cortar un niño de 8 cm x 12 cm pedazo de membrana de nitrocelulosa (tamaño de poro de 0,2 micras).
   2. nitrocelulosa posición en un aparato de transferencia de mancha, asegurándose de que la membrana se ajusta de tal manera que el aparato está sellado, y todos los pocillos están completamente cubiertos por la membrana. Si se ensambla correctamente, no debe haber ninguna fuga de aire cuando el vacío es aplIED.
   3. Para recoger filtrado, conectar el aparato a un matraz de brazo lateral secundaria. Desde el vástago de la válvula, conectar la tubería adecuada tal que el aparato puede ser utilizado cómodamente sin inclinar el matraz secundaria.
   4. Conectar el matraz de brazo lateral secundaria a la fuente de aspiración / vacío.
   5. Prueba de que el aparato está completamente sellado mediante la aplicación de vacío al aparato. Si el aparato está montado correctamente, un fuerte vacío estará presente en todos los pozos. Todas las conexiones de los tubos pueden ser envueltos en Parafilm o Saran Wrap para asegurar un sellado hermético.
   6. Opcionalmente, para poner a prueba el vacío, pipeta de 100 l de tampón de reacción en un pocillo. El vacío debe ser lo suficientemente fuerte como para extraer todo el líquido a través del pozo y sobre la membrana.
   7. Desactivar el vacío hasta que todas las muestras están listas para ser visto en la membrana.

2. reacción de iniciación y el temple

1. Mezcla de componentes de la reacción
   1. Antes de Initiación, preparar los cuatro componentes de la reacción como soluciones madre 4x: tampón de reacción (ver sección 1.4), histidina quinasa (1.5), [γ- ^32P] -ATP (1,6), y _ddH2O
   2. Mezclar volúmenes iguales de tampón de reacción, histidina quinasa, y ddH ₂ O. permitir que estos componentes de la reacción se equilibren a temperatura ambiente durante un corto tiempo (10 min).
      Nota: El volumen final de reacción depende de si el experimento es dependiente del tiempo, enzima dependiente de, o dependiente de sustrato. reacciones dependientes del tiempo deben ser más grandes, como múltiples alícuotas se toman de la misma reacción y templan en el punto de tiempo deseado. El volumen de reacción dependerá del número de puntos de tiempo deseados. El ensayo se optimiza para cada punto de la membrana de nitrocelulosa para contener 30 l de la reacción. Por lo tanto, si se desean 10 puntos de tiempo, el volumen de reacción debe ser de al menos 300 l (un volumen mayor tal como 330 l sería preferible en el caso de los errores de pipeteo).La enzima y el sustrato experimentos dependiente requieren volúmenes de reacción más pequeños. El volumen de reacción para estos experimentos puede ser tan pequeño como 30 l, ya que este es el volumen final que va a ser detectado en la membrana de nitrocelulosa.
   3. Para iniciar la reacción, añadir un volumen de solución [γ- ^32P] -ATP a la reacción y mezclar pipeteando arriba y abajo. Seguimiento de tiempo de reacción transcurrido con un temporizador y permitir que la reacción tenga lugar durante el tiempo deseado.
   4. Para detener la reacción, agregar 1/13 del volumen de reacción total de 325 mM H ₃ helada PO ₄ a la reacción y la mezcla pipeteando arriba y abajo. Alternativamente, añadir una parte alícuota de la reacción a 325 mm de H ₃ PO _4.
      NOTA: La concentración final de H ₃ PO ₄ debe ser de 25 mM para saciar suficientemente la reacción. Por ejemplo, añadir 2,5 l de 325 mM de H ₃ PO ₄ a 30 l de reacción, o añadir 30 l de reacción de 2,5 l de 325 mM de H ₃ PO 4. El pH final de la reacción es de aproximadamente 4,0. Esta concentración de H ₃ PO ₄ ha sido probado y confirmado para detener la reacción quinasa en este tampón sin degradar fosfohistidina.
      1. Por ejemplo, la mezcla de 7,5 l de tampón de reacción 4x, 7,5 l de 4x histidina quinasa, y 7,5 l _ddH2O iniciar la reacción con 7,5 l [γ- ^32P] -ATP. Se detiene la reacción con 2,5 l 325 mM H ₃ PO _4.
   5. Colocar inmediatamente reacciones enfriadas en hielo hasta que todas las reacciones han sido terminados.
      NOTA: Para maximizar la eficiencia, es aconsejable para iniciar una reacción se inician cada 15 o 20 s hasta que todas las reacciones, y una vez que ha pasado el tiempo de reacción deseado, apagar una reacción cada 15 o 20 s hasta que todos se apaga. Para aquellos que están usando el ensayo por primera vez, un intervalo más largo puede ser más manejable.

3. Spotting oReacciones f templado en nitrocelulosa

1. Comience vacío en bien de 96 aparatos de transferencia de puntos
   1. Colocar el aparato de transferencia de puntos de 96 pocillos pre-ensamblado (sección 1.7) en un recipiente secundario. Este recipiente debe ser lo suficientemente grande para que el aparato pueda ser desmontada fácilmente en, como el aparato y la membrana serán radioactivo después de su uso.
   2. Aplicar vacío al aparato de transferencia de puntos de 96 pocillos.
   3. Una vez que el aparato está en vacío, pipetear cuidadosamente la reacción se inactivó directamente sobre la membrana de nitrocelulosa en cada pocillo. Repetir hasta que todas las reacciones se cargan en la membrana. Dado que la capacidad de unión de nitrocelulosa (75 a 110 g / cm ²⁾ es mayor que la cantidad de histidina quinasa que está manchado, se puede suponer que casi la totalidad de la quinasa se une a la membrana cuando se cargan correctamente.
      NOTA: En función del aparato utilizado, se debe tener cuidado de no perforar la nitrocelulosa. Observe que toda la reacción ha hecho contacto con THe nitrocelulosa. Es fácil para algunos o la totalidad de la reacción a pegarse a las paredes del pozo, y no llegan a la nitrocelulosa.
   4. Lavar los pocillos con 100 l de 25 mM H ₃ PO ₄ enfriado con hielo. Esto permitirá que cualquier volumen de reacción que pueda haber quedado atrapado en el pozo para llegar a la membrana, asegurando la carga completa de todas las reacciones. Permitir que todo el volumen fluya a través de la membrana.
2. desmontaje Aparato y la transferencia de membrana de nitrocelulosa
   1. Con cuidado, desmontar el aparato antes de apagar el vacío. Se informa de que tanto el aparato y la membrana de nitrocelulosa son radiactivos en este momento. No quite ninguna componentes del aparato desde el recipiente secundario en este momento.
   2. Con unas pinzas, transferir cuidadosamente la membrana de nitrocelulosa desde el aparato a un contenedor de aproximadamente 200 ml 25 mM enfriado con hielo H ₃ PO _4. Colocar una tapa sobre el envase, como el lavado será radioactive. En este momento, el vacío puede ser apagado.

4. Procesamiento de nitrocelulosa

1. lavado de nitrocelulosa
   1. Coloque el recipiente con la membrana de lavado en un eje de balancín. Deje que la membrana hasta el rock suavemente durante 20 minutos.
   2. Después de 20 minutos, decantar cuidadosamente la solución de lavado utilizado en un gran cubo que se utiliza para el almacenamiento temporal de residuos. Añadir 200 ml de helado 25 mM de H ₃ PO ₄ a la membrana y repetir.
      NOTA: Por lo menos tres 20 min lavados son necesarias para eliminar de fondo [γ- ³² P] -ATP señal de la membrana. Después del tercer lavado, probar la solución de lavado usado para la radiación con un contador Geiger. Continuar el lavado de la membrana como se describe anteriormente hasta que no hay señal presente en la solución de lavado.
2. secado de nitrocelulosa
   1. Después de que la membrana se lava suficientemente, permitir que la membrana se seque al aire brevemente. Esto suele tardar 5 minutos o menos.

5. La exposición a la pantalla de almacenamiento de fósforo

Nota: Esta sección es opcional. La exposición de la membrana a una pantalla de fósforo es beneficioso en que permite la visualización de la intensidad de la quinasa radiomarcado en cada punto de la membrana. La intensidad relativa de estas manchas es directamente proporcional a la cantidad de histidina quinasa fosforilada en cada punto. La intensidad se puede cuantificar con el software de procesamiento de imágenes, y estos resultados se puede comparar con los generados de la sección 7. Además, este paso permite el control de calidad. Las anomalías observadas en este análisis podrían explicar los resultados irregulares obtenidos de recuento de centelleo.

1. preparación pantalla de fósforo
   1. Antes de exponer la membrana a la pantalla de almacenamiento de fósforo, exponer la pantalla de fósforo a la luz blanca durante al menos 5 min. Esto asegura que cualquier imagen residual que pueda estar en manos de la pantalla se borra.
   2. Asegúrese de que la pantalla está limpiay seco. Si es necesario, limpie suavemente la pantalla con una solución de limpieza pantalla de fósforo aprobado por el fabricante de la pantalla, y seque.
2. preparación de membrana de nitrocelulosa
   1. envolver con cuidado la membrana de nitrocelulosa seca en una delgada envoltura de plástico para evitar que la humedad residual de dañar la pantalla de fósforo. Asegúrese de que no queden arrugas o burbujas.
3. La exposición a la pantalla de fósforo
   1. Colocar la membrana de nitrocelulosa envuelto en el casete de pantalla de fósforo de almacenamiento, coloque la pantalla boca abajo sobre la membrana, y cerrar el casete. No abra el casete o mover la membrana hasta que sea tiempo para escanear la pantalla de fósforo, como el desplazamiento de la membrana durante la exposición hará que una imagen doble o manchada para ser capturado.
   2. Exponer durante al menos 4 h, o siempre que el fabricante de la pantalla de fósforo sugiere.
   3. Una vez que se completa la exposición, escanear la pantalla de fósforo y la captura de la imagen con un escáner de fósforo.

6. Preparación de nitrocelulosa de membrana para recuento de centelleo

1. Ponceau S tinción y la decoloración
   1. Brevemente sumergir la membrana de nitrocelulosa en solución de tinción Ponceau S (0,1% Ponceau S (w / v) en 5% de ácido acético) para 1 - 2 min. Mojar toda la membrana con la mancha antes de la decoloración.
   2. Decantar el exceso de Ponceau S de la membrana.
   3. Enjuague la membrana con _ddH2O hasta que sólo las manchas de la histidina quinasa están manchadas. Tenga en cuenta que este procedimiento sólo funcionará si todos los lugares contienen cantidades detectables de proteína.
      NOTA: Este paso es necesario para confirmar que la quinasa se une a la nitrocelulosa, y que la carga de proteína es incluso a lo largo de todos los puntos. También permite la quinasa manchado a cortar fácilmente hacia fuera de la membrana.
2. Recorte de las manchas
   1. Con unas tijeras, corte cada punto de la membrana de nitrocelulosa. No es necesario cortar perfectamente along del borde de la mancha manchado; si la membrana se lavó suficientemente, de fondo debido a la variación del tamaño de los puntos cortados será insignificante. Sólo es importante que cortar todo el lugar para cada reacción.
   2. Con unas pinzas, transferir cuidadosamente cada punto en viales de centelleo. Sin cóctel de centelleo es necesario ya que el ^P32 es fácilmente detectable por la radiación de Cherenkov.
      NOTA: Como alternativa, el punto se puede cortar a cabo mediante una sonda afilada. Retire cada punto de la nitrocelulosa con el perforador de corcho, y empujarlo en un vial de centelleo con un alfiler. Con este método, la membrana no tiene que ser tocado, minimizando aún más la exposición de radiación.
3. La determinación de CPM / pmol de solución de [γ- ^32P] -ATP
   1. Contado varias diluciones de [γ- ^32P] -ATP solución (sección 1.5) a 1 cm x 1 cm cuadrados de nitrocelulosa. seca brevemente al aire.
   2. Con unas pinzas, transferir cuidadosamente cada cuadrado en centelleoviales. No cóctel de centelleo es necesario. Estas muestras se utilizaron para generar una curva estándar para determinar el CPM / pmol de la solución de ATP.

Recuento de centelleo 7.

1. Cargar todos los viales de centelleo en casetes contador de centelleo. casetes de carga en un contador de centelleo.
2. Ejecutar programa de recuento de centelleo para medir la RPC para cada vial. Estos datos, junto con el CPM / pmol de la mezcla de ATP radiomarcado (de la sección 6.3), se pueden utilizar para calcular la cantidad de histidina quinasa fosforilada presente en cada punto, y por lo tanto la velocidad de autofosforilación. ^18,19

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Resultados

Un conjunto de datos representativo fue generado que ofrece una imagen capturada con un fósforo de imágenes (Figura 1), Ponceau S tinción de la membrana de nitrocelulosa (Figura 2), y los datos de recuento de centelleo (Figura 3). La figura 3A muestra las constantes cinéticas de la enzima en una representación de Lineweaver-Burk. Estos resultados se obtuvieron utilizando una histidina quinasa purificada de la ...

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Discusión

El ensayo de unión de nitrocelulosa que hemos descrito tiene muchas ventajas sobre los métodos previamente usados ​​para caracterizar histidina quinasas. En comparación con / autorradiografía basado-PAGE SDS tradicional, nuestro método es un mayor rendimiento y menos tiempo. La membrana de nitrocelulosa es más fácil de manejar que los geles de SDS, y no necesita ser fijado. Ponceau tinción de la nitrocelulosa permite que las manchas de proteínas para ser visualizadas. Esto proporciona una manera fácil de c...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphoric acid	VWR	AAAA18067-AP	For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base	RPI	T60040-5000.0	Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride	RPI	P41000-2500.0	For kinase reaction buffer
Magnesium chloride	RPI	M24000-500.0	For kinase reaction buffer
Glycerol	RPI	G22020-4000.0	For kinase reaction buffer
5'-ATP	Promega	E6011	Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP	Perkin Elmer	NEG002Z250UC	6,000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus	Bio-rad	1706545	For spotting reactions
Nitrocellulose	Whatman	32-10401396-PK	For spotting reactions
Ponceau S	Sigma aldrich	P3504-50G	For staining nitrocellulose