Inducida por la forskolina Hinchazón en organoides intestinal: Una<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo para evaluar la respuesta de drogas en pacientes con fibrosis quística

Resumen

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Resumen

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 °C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Introducción

CF está causada por mutaciones en el gen de la fibrosis quística regulador de la conductancia transmembrana (CFTR) que codifica un canal de aniones epitelial. CF afecta a aproximadamente 85.000 personas en todo el mundo ^1. Más de 2.000 mutaciones CFTR se han identificado ( www.genet.sickkids.on.ca ). Esta diversidad explica parcialmente un amplio espectro de fenotipos de la enfermedad observados ( www.CFTR2.org ) ^{2, 3.} Seis clases de mutaciones CFTR se definen en función de su efecto sobre la expresión de la proteína CFTR y la función: (I) la síntesis de NO, (II) el tráfico deteriorado, (III) canal gating defectuoso, (IV) conductancia alterado, (V) niveles de reduce normalmente funcionamiento CFTR, y (VI) la estabilidad de la superficie celular alterada ^4. Aunque las mutaciones CFTR comunes están bien estudiados, la función de CFTR y su relación con el estado clínico permanecen poorlY entiende a nivel del individuo, en particular para el gran grupo de mutaciones raras "huérfanos" ( www.CFTR2.org ) ^{1, 3.}

Recientemente, se han desarrollado medicamentos que se dirigen a la proteína CFTR en una manera-mutación específica. Dos clases de fármacos de proteínas CFTR de metas se encuentran actualmente en uso clínico y tienen modos de acción diferentes. Potenciadores, como el VX-770, aumentan la probabilidad de apertura de-CFTR mutante localizada apicalmente y actúan directamente sobre su adición a las células ^5. Correctores, tales como VX-809, restauran el tráfico de endoplásmico CFTR misfolded retículo-localizados y requieren pre-incubación con las células antes de que los efectos se observan ^6. El potenciador CFTR, VX-770, ha sido registrada para los sujetos con la mutación G551D ^{7, 8,} así como para otros ochoCFTR gating mutaciones, incluyendo S1251N ^9; En conjunto, estas mutaciones se realizan en un 5% de todos los sujetos con FQ. Otros ensayos clínicos han indicado que VX-770, combinado con el corrector VX-809, ha limitado efectos todavía significativos sobre la función pulmonar y causa una disminución en las tasas de exacerbación en los sujetos homocigotos para la mutación F508del llevado por 45 a 50% de los pacientes ^{10, 11.}

ensayos clínicos convencionales para identificar sujetos sensibles al fármaco dentro del 50% restante de los pacientes con FQ son costosos y consumen mucho tiempo y no son factibles para los individuos con genotipos CFTR extremadamente raros. Novela, personalizados, métodos rentables son cruciales para que coincida con el creciente número de moduladores de CFTR a los individuos portadores de cualquier tipo de mutación CFTR. Hasta ahora, la inclusión de los ensayos de grupos de pacientes portadores de mutaciones CFTR específicos se ha guiado por los estudios que utilizan la transfección mutante del gen CFTR en hsistemas de células de eterologous, seguido de estudios electrofisiológicos en cámaras Ussing ^{5, 6, 12.} Debido a la falta de modelos animales adecuados CF, estudios de eficacia de los medicamentos en las células epiteliales bronquiales de aire-líquido-interfaz-diferenciadas derivadas a partir de materiales de explantes de pulmón CF se han utilizado para el desarrollo de fármacos ^{13, 14, 15.} Sin embargo, la limitada disponibilidad de tejidos de explantes de pulmón y los procedimientos invasivos para obtener células bronquiales de los sujetos sin enfermedad en fase terminal obstaculizar el análisis de mutaciones CFTR menos comunes y evitar las pruebas de drogas de una manera personalizada. Para superar estas limitaciones, los tejidos "fácil acceso", como organoides colorrectal, células de las vías respiratorias nasales y las vías respiratorias células derivadas de células madre pluripotentes inducidas, están actualmente siendo explorado por los tratamientos farmacológicos personalizados.

Anteriormente, hemos establecido los protocolos para las células madre epiteliales cultura de cualquier órgano digestivo en forma de 3D organoides ^{16, 17.} factores de crecimiento para el colon / recto humano, las condiciones de cultivo implican definido (factor de crecimiento epitelial (EGF), gastrina, Wnt-3A, R-espondina 3 (Rspo3), y Noggin) en combinación con moléculas pequeñas (nicotinamida, A83-01, y SB202190) en una matriz de membrana basal. En estas condiciones, las células madre individuales o fragmentos de tejido pequeños crecen hacia fuera en, quística, estructuras 3D cerrado formado por epitelio altamente polarizada con su lado basal orientada hacia el exterior. Todos los tipos de células suelen aparecer en sus proporciones y posiciones normales. Organoides pueden ampliarse durante períodos de tiempo largos por rotura mecánica semanal y re-recubrimiento. Ellos son genéticamente y fenotípicamente estables y pueden ser almacenados, lo que permite la expansión a largo plazo y bio-banca ^17. Son susceptibles detodas las manipulaciones de células / biológica estándar genéticos y técnicas de análisis desarrolladas para líneas celulares 2D ^18.

Recientemente hemos demostrado que la función de CFTR se puede medir fácilmente en organoides colorrectal en un ensayo de inflamación inducida por la forskolina (FIS) ^{19, 20.} Cuando se expone a la forskolina (FSK) o, alternativamente, a la toxina del cólera, organoides aumentan rápidamente su monofosfato de adenosina cíclico niveles (AMPc), que a su vez se traduce en la apertura del canal CFTR ^19. Organoides de individuos sanos o de sujetos con mutaciones CFTR asociados con la función residual, posteriormente se hincharán como consecuencia de transporte de iones y agua al lumen de organoides, el equivalente in vitro de la diarrea secretora. La respuesta FIS de organoides colorrectal fue previamente demostrado ser totalmente dependiente de CFTR, como se indica por organoides derivados de individuos CFTR nulo unand por el uso de inhibidores de CFTR farmacológicas específicas ^19. Grandes conjuntos de datos de temas específicos se pueden derivar dentro de varias semanas después de tomar una biopsia.

Para el ensayo de la FIS se describe en detalle aquí, organoides se cultivan a partir de biopsias rectales que se pueden obtener a cualquier edad y con la única incomodidad limitada ^21. Organoides se pasan semanalmente por la ruptura mecánica en criptas individuales que se vuelva a sellar y formar nuevos organoides fácilmente. Para ejecutar el ensayo de FIS, ~ 30-80 de estos pequeños organoides alterado son sembraron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos ^19. En el día del ensayo, los organoides se tiñeron con calceína verde, un colorante fluorescente de células permeable que está retenido dentro de las células vivas, lo que facilita imágenes en vivo. Entonces, FSK, lo que eleva el AMPc intracelular y por lo tanto activa CFTR, se añade con el fin de estimular la hinchazón organoide. Potenciadores que actúan sobre CFTR apical se añaden simultáneamente won la forskolina, mientras que los correctores que restauran el tráfico de CFTR se añaden 24 h antes de la adición de FSK. La hinchazón organoide se cuantifica mediante un análisis de imagen automatizado que calcula el aumento relativo de la superficie total de todos los objetos fluorescentes para cada punto de tiempo después de la adición de forskolina.

3D organoid hinchazón ofrece ventajas y desventajas sobre las lecturas de CFTR electrofisiológicos existentes en las vías respiratorias células cultivadas 2D en cámaras Ussing. Una ventaja importante es el rendimiento del ensayo de hinchamiento. Las células se cultivan y se ensayaron utilizando un único tipo de medio de cultivo, y un técnico con experiencia pueden cultivo hasta 25 muestras de organoides sobre una base semanal, mientras que la cuantificación de aproximadamente 1200 puntos de datos por semana en 12 muestras de pacientes. Que convencionalmente escribir una sola condición experimental por medio de mediciones por duplicado o triplicado por placa y repetir dichas mediciones en tres momentos de incubación independientes. En total, aproximadamente 300-500 single organoide estructuras se miden por condición experimental, lo que lleva a mediciones muy precisas de la función de CFTR con variabilidad técnica limitada. Esta precisión nos permite definir con claridad las diferencias en la función y la respuesta residual a moduladores de CFTR y nos permite recoger fácilmente a efectos de fondo genéticas entre los pacientes portadores de mutaciones CFTR idénticos ^{19, 22, 23, 24, 25.} calidad de los datos se puede evaluar fácilmente a partir de imágenes de microscopio. Mientras FIS es totalmente dependiente de CFTR, que es una medida de resultado indirecto de la función de CFTR, su lectura fuera causado por el acoplamiento del transporte de iones para el transporte de fluidos. Esto contrasta con las mediciones de la función de CFTR directos en cámaras Ussing, que miden las corrientes de iones transepiteliales ^26. cámaras Ussing permiten la estimulación de selección de c apical o basolateralompartments (que el ensayo no permite organoid); por permeabilización de la membrana basolateral, la secreción de aniones CFTR dependiente apical se puede medir de forma selectiva ^27.

Protocolo

Toda la experimentación utilizando tejidos humanos descritos en este documento fue aprobado por el comité de ética de la Universidad del Centro Médico de Utrecht (UMCU; TcBio # 14-008). El consentimiento informado para la recogida de tejidos, generación, almacenamiento y uso de los organoides se obtuvo de los pacientes en el Hospital -UMCU (WKZ) Wilhelmina niños.

Equipo	Consumible	Herramientas
Campana de flujo laminar	15 y 50 ml tubos cónicos	Zeiss LSM 800 - Zen 2 (edición azul) de software para la medición de las imágenes
Incubador de CO2	tubos de microcentrífuga	programa de Microsoft Excel
Microscopio de cultivo celular (microscopio óptico / óptica)	0.22 micras filtros
Centrífugo	pipetas serológicas
Rodando Shaker	puntas con filtro micropipeta
4 ° C o C sala de nevera 4 ° de la incubadora	crioviales
CoolCell celda helada de contenedores
pipeta serológica
Micropippette (1000, 200 y 20 l)
Repita Viaflo pipeta
(Células vivas) Microscopio Confocal
Computadora
tanque de nitrógeno líquido
Multicanal (200 l)

1. Reactivos Preparación para la Cultura

NOTA: Todos los pasos se realizan dentro de una cabina de bioseguridad y siguiendo las directrices estándar para trabajar con cultivos celulares. Con el fin de facilitar la formación de buenos gotas de matriz de membrana basal, mantener una acción pre-calentado de 96-, 24-, y placas de 6 pocillos en la incubadora a 37 ° C.

1. Basal Medium Preparación
   NOTA: El medio basal (BM) se refiere a de avanzada Eagle modificado por Dulbecco con la Mezcla de Ham nutrientes F-12 (Ad-DF) suplementado con 4- (2-hydroxyethil) ácido -1piperazineethanesulfonic (HEPES), glutamina, y penicilina / estreptomicina (Pen / Strep).
   1. En una botella de medio 500 ml Ad-DF, añadir 5 ml de glutamina 200 mM, 5 ml de 1 M HEPES, y 5 ml de las soluciones de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml, 10,000 g / ml).
   2. BM Conservar en el refrigerador a 4 ° C durante al menos 4 semanas.
2. Wnt-3A-medio condicionado Preparación
   NOTA: medio condicionado-Wnt-3A se hace en la casa using la línea celular L-Wnt-3A de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   1. Para recoger el medio de Wnt-3A-acondicionado, recoge el medio se expone a las células durante una semana y lo hace girar hacia abajo durante 5 minutos a 450 xg para eliminar las células flotantes.
   2. Se filtra el medio condicionado-Wnt-3A a través de un filtro de 0,22 micras y se divide en partes alícuotas de 40 ml en 50 ml tubos cónicos. Almacenar a 4 ° C durante al menos 4 meses sin pérdida de actividad.
   3. Prueba de la actividad del medio de Wnt-3A-acondicionado en un ensayo de TOP / FOP usando riñón embrionario humano (HEK) -293 células transfectadas con láminas superior y FOP-luciferasa y TK- Renilla y se mide con un kit de ensayo de Renilla -luciferase según las instrucciones del fabricante.
      NOTA: TOP-luciferasa es un plásmido indicador que contiene de tipo salvaje regiones de unión a TVC. Si el medio acondicionado Wnt-3A está activo, se activa la señalización Wnt canónica. Beta-catenina se transloca en el núcleo de asociar el ingenioh TCF / LEF factores de transcripción y activa la transcripción del informador de luciferasa, que induce un aumento en la actividad luciferasa relativa cuando se añade el sustrato. El FOP-luciferasa se usa como un control negativo debido a que el TCF se mutado regiones de unión aguas arriba del gen de la luciferasa.
3. Preparación de colon Medio
   NOTA: preparar y diluir todos los factores de crecimiento y reactivos de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Use alícuotas de tamaño pequeño un evitar ciclos de congelación-descongelación. factores de crecimiento funcionales son esenciales para los resultados.
   1. Preparar medio de dos puntos (CM), completándolo con BM 1x B27, 1,25 mM N-acetilcisteína, 50 ng / ml de hEGF, 5 nM gastrina, nicotinamida 10 mM, 300 ng / ml hRspo3, 100 ng / ml hNoggin, 500 M A83-01 , 10 M SB202190, y 100 mg / ml de un agente antimicrobiano para las células primarias.
   2. Divida el CM en alícuotas y congelar a -20 ° C durante un máximo de 4 meses. Descongelar las alícuotas para preparar el colon completomedio (FCM) mediante la adición de 50% de medio Wnt-3A-conditoned a la CM. Tienda FCM hasta 7 días a 4 ° C sin pérdida de actividad.
   3. Para el establecimiento de una cultura organoide de biopsias rectales, complementar FCM con 50 mg / ml de vancomicina, 50 mg / ml de gentamicina, y 10 mM proteína serina / treonina quinasa inhibidor-espiral de la bobina formando rho-asociado (RhoKi). Utilizar este medio, llamado medio de aislamiento (IM), sólo para los primeros dos o tres días en cultivo.
4. EDTA Stock Preparación de la solución
   1. Preparar ácido 0,5 M etilendiaminotetraacético (EDTA), pH 8, en ultrapura H ₂ O, esterilizada con un filtro de 0,22 micras.
5. La manipulación de la membrana basal para la matriz
   1. Preparar la matriz de la membrana basal (BMM) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
   2. Descongelar BMM noche en hielo.
   3. Cuando la transferencia de la BMM de la botella a un tubo cónico de 15 ml, el usouna pipeta de 5 ml y 15 ml de un tubo cónico de pre-enfriado a -20 ° C.
   4. Una vez descongelado, almacenar el BMM en un refrigerador a 4 ° C y se incuba en hielo durante al menos 30 a 60 min antes de su uso.
      NOTA: Con el fin de obtener los mejores resultados, el BMM debe ser frío y se mezcla adecuadamente antes de clavarse criptas o organoides.

2. El establecimiento de organoides Colon partir de una biopsia de pacientes con FQ

NOTA: Después de la recogida de tejidos, es importante mantener la muestra en hielo en solución salina, fosfato de Dulbecco solución salina tamponada sin Ca2 ⁺ y Mg2 ⁺ (DPBS), o BM. Se recomienda un rápido procesamiento de las biopsias, pero se ha demostrado que es posible establecer cultivos de biopsias de organoides almacenados en hielo durante un máximo de 7 días.

1. Deje que las biopsias se depositan en el fondo de un tubo cónico de 15 ml y eliminar el sobrenadante.
2. Añadir 10 ml de DPBS a las biopsias y la pipeta hacia arriba y abajo 10-20 veces usando una pipeta de 10 ml.
   NOTA: La pipeta tiene que ser pre-humedecida con BM antes de pipetear la biopsia.
3. Deje que las biopsias se depositan en el fondo y eliminar el sobrenadante.
4. Repita los pasos 2.2 y 2.3 de 4-5 veces hasta que el sobrenadante es claro.
5. Añadir 10 ml de subproductos de desinfección y 200 l de EDTA (0,5 M) para las biopsias y colocar el tubo en una plataforma oscilante tubo de 60-120 min a 4 ° C.
   NOTA: El tiempo de incubación puede variar por paciente. Si criptas son liberados, DPBS se vuelve turbia. incubación EDTA puede ser finalizado cuando criptas se pueden observar bajo un microscopio.
6. Permitir a las criptas se asienten. Descartar el sobrenadante.
7. Tomar hasta 2 ml de BM y añadirlo a un nuevo tubo cónico de 15 ml. Agitar este nuevo tubo manualmente de tal manera que el interior se cubre con BM.
8. Usando una pipeta de pre-humedecida con BM, añadir 2 ml de DPBS al tubo que contiene las biopsias y la pipeta arriba y abajo de 10-20 veces.
9. Permitir que las biopsias se asienten y transfieren los DPBS con las criptas a la nuevatubo que contiene los 2 ml de BM que se preparó en el paso 2.7.
10. Repita los pasos 2.8 y 2.9 hasta que no haya más criptas son liberados.
11. Girar las criptas hacia abajo a 130 xg durante 5 min a 8 ° C.
12. Mientras tanto, la transferencia de IM a la cabina de seguridad a temperatura ambiente (RT).
13. Eliminar el sobrenadante y añadir 10 ml de BM a la etapa de pellets cripta y la repetición de 2.11.
14. Resuspender el precipitado en 1 ml de BM. Tome 5-10 l y contar el número de criptas a simple vista bajo un microscopio.
15. Girar las criptas hacia abajo a 130 xg durante 5 min a 8 ° C.
16. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 55% BMM (v BMM a v IM).
    NOTA: Las criptas se resuspenden en el volumen correspondiente de 55% en BMM 1 cripta por l. Si no hay suficientes criptas, el volumen mínimo de BMM es de 40 l.
17. Para la siembra, la pipeta 35 l por pocillo (en una placa de 24 pocillos). Divida a los 35 l de BMM en 3-5 gotas por separado con el fin de mejorar la difusión de growth factores en el BMM. No crear burbujas.
18. Coloque y dejar la placa al revés en la incubadora a 37 ° C durante al menos 20 min para la BMM se solidifique.
19. Añadir 500 l de mensajería instantánea por pocillo y mantenerlo en la incubadora a 37 ° C y 5% de _CO2.
20. Refrescar el medio cada 2-3 días. Retire el medio de edad pipeteando con una pipeta P1000, dejando el BMM cae intacta. Añadir con cuidado FCM con la pipeta en el lado del pozo, no directamente sobre las gotas de BMM.
    NOTA: Si no hay criptas se liberan en el protocolo de aislamiento, centrifugar el sobrenadante, lavar el pellet 2-3 veces con BM, y resuspender en BMM. Tome el tejido sobrante y cortarlo en pequeños trozos con una cuchilla de afeitar. Recoger estos en un tubo cónico de 15 ml, centrifugar ellos, y volver a suspender en el mismo BMM. Si todas las células madre epiteliales están presentes, estos también generan organoides.

3. pases de organoides Colon para el mantenimiento, congelación, y paraInflamación inducida por skolin Ensayo (FIS)

NOTA: Cada cultura tiene su propia organoid tiempo de duplicación. Normalmente, organoides CF colorrectales pueden ampliarse 1: 3-1: 5 veces cada 7-10 días. Es una buena señal si se observan estructuras en ciernes. Organoides colorrectal CF son menos quística (Figura 2A - 2C) que organoides normales colorrectales (Figura 2D). Para el establecimiento y mantenimiento, organoides se cultivan en placas de 24 pocillos; para congelar, en placas de 6 pocillos; y para el ensayo de FIS, en patés 96 pocillos.

1. Pases de organoides
   1. Mantenga el BMM en hielo durante al menos 30 a 60 min antes de usarla.
   2. Mantenga el FCM a TA durante al menos 1 hr antes de usarlo.
   3. Etiquetar un tubo de 15 ml cónico con el nombre de la muestra y el otro tubo como "lavado".
   4. aspirar cuidadosamente el medio de los pocillos utilizando una pipeta P1000 sin molestar a las gotas para los BMM.
   5. Añadir 1 ml de BM a 1 bien y break el BMM gotas mediante el uso de una pipeta P1000. Transferir este 1 ml en el tubo cónico de 15 ml con el nombre de la muestra.
   6. Lavar el bien con otro 1 ml de BM y transferirlo al mismo tubo de 15 ml.
   7. Repita los pasos 3.1.5 y 3.1.6 con 5 pozos más (hasta 6 pocillos de una placa de 24 pocillos se lavaron en uno 15 ml tubo cónico).
   8. Llenar el tubo hasta 12 ml con BM. Pipeta hacia arriba y abajo utilizando una pipeta ml previamente mojado 5.
   9. Giran a 85 xg durante 5 min a 8 ° C.
   10. Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de BM al sedimento. Con la misma punta de la pipeta P1000, tomar hasta una punta P10 sin un filtro, y la pipeta hacia arriba y abajo 20 veces. Desechar ambos consejos P10 P1000 y.
   11. Añadir 4 ml de BM con una pipeta de 5 ml y mantener el tubo inclinado en unos 70 ° de la vertical a un lado. Humedecer previamente una nueva punta P1000 y mezclar enérgicamente 2-3 veces con el P1000 (volumen 1 ml).
   12. Contar hasta 10, mientras que permanece en la posición inclinada, recoger la capa superior con cuidado wITH la pipeta P1000, y la transferencia de 4 x 1 ml en el tubo etiquetado como "lavado".
   13. Observar los organoides depositarse en el fondo del tubo inclinado; organoides no desorganizada y trozos más grandes se hunden hasta el fondo. Centrifugar los 15 ml "lavan" tubo durante 5 minutos a 85 xg y 8 ° C.
   14. Eliminar el sobrenadante y añadir la cantidad requerida de medio y BMM al sedimento organoide a una concentración final de 55% BMM. Mezclar pipeteando arriba y abajo sin crear burbujas (Figura 3B).
       NOTA: Una buena densidad se logra mediante la siembra de 25-30 organoides en 10 l de BMM.
   15. Siga los pasos del 02/17 a 02/19.
2. Pases de congelación
   1. Mantenga el BM en hielo durante al menos 30 a 60 min antes de su uso. Mantenga el FCM a TA durante al menos 1 hora antes de su uso.
   2. Preparar FCM suplementado con RhoKi (Paso 1.3.3).
   3. Tome la tripsina de la nevera y se deja a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes de su uso.
   4. Siga los pasos 3.1.5-3.1.10.
   5. Eliminar la mayor cantidad posible sobrenadante, añadir 4 ml de tripsina, y agitar durante 30 seg.
   6. Poner el tubo en un baño de agua caliente a 37 ° C durante 1 min y agitar vigorosamente durante 30 segundos.
   7. Inspeccionar la solución en el tubo. Si organoides intactos son todavía visibles bajo el microscopio, repita el paso 3.2.7.
   8. Cuando se interrumpen los organoides, añadir 8 ml de BM para neutralizar la tripsina y la pipeta de 10 veces.
   9. Centrifugado durante 3 minutos a 450 xg a 8 ° C.
   10. Eliminar el sobrenadante y añadir la cantidad necesaria de medio y BMM a los organoides para llegar a una solución BMM 55%. Mezclar pipeteando arriba y abajo sin crear burbujas.
       NOTA: Para la congelación, organoides deben ser sembradas en una relación 1: 1 después de tripsinización.
   11. Seed 250 l en un solo pocillo de una placa de cultivo de tejidos pre-calentado de 6 pocillos, produciendo pequeñas gotas, separadas de ~ 10 l. Coloque la placa boca abajo en la incubadora a 37 ° C y dejar elBMM se solidifique durante 20-30 min.
   12. Añadir 2,5 ml de FCM fresca + RhoKi en cada placa de 6 pocillos y así transferir la placa de la incubadora (Figura 3C).
3. Organoides pases para el Ensayo de esquí alpino
   NOTA: En función del número y tamaño de los organoides, entre 4 y 6 pocillos de una placa de 24 pocillos son suficientes para la siembra de 27 pocillos de una placa de 96 pocillos.
   1. Procesar los organoides como se describe en los pasos 3.1-3.1.13.
   2. Resuspender el precipitado en 120 l de 50% de BMM.
   3. Confirmar el número de organoides (30-50) en un 3 l gota BMM bajo el microscopio.
   4. Plate los organoides utilizando una sola gota de 3 l colocados en el medio de cada pocillo de una pate 96 pocillos.
   5. Colocar la placa en la incubadora a 37 ° durante 15 min para el BMM se solidifique; medidas adicionales se describen en el paso 6.1.1.

4. Congelación de colon CF organoides

NOTA: Órganooids están listas para ser congelados hasta 1-2 días después de la tripsinización y el cultivo, por lo organoides todavía serán pequeños, lo que aumenta la eficiencia de la supervivencia después de la descongelación.

1. Añadir 1 ml de BM y romper el BMM gotas con una pipeta P1000. Transferir a un tubo cónico de 15 ml.
2. Lavar bien con el otro 1 ml de BM y traslado al mismo tubo de 15 ml.
3. Repita los pasos 4.1 y 4.2 con todos los pocillos.
   NOTA: Para evitar el exceso de BMM, 3 pocillos de una placa de 6 pocillos compartirán un tubo de 15 ml.
4. Llenar el tubo de 15 ml que contiene los organoides con 12 ml de BM frío y la pipeta hacia arriba y abajo con una pipeta de 5 ml. Deje el tubo en hielo durante 5 min.
5. Girar durante 3 minutos a 450 xg y 8 ° C y separar el sobrenadante.
6. Disolver la pastilla de organoides con medio de congelación y la pipeta hacia arriba y abajo para volver a suspender adecuadamente los organoides.
   NOTA: 500 l de medio de congelación se utiliza para cada 100 l de BMM.
7. Usando una pipeta de 5 ml, transferir 0,5 ml deorganoides se volvieron a suspender en medio de congelación estériles para viales criogénicos.
8. La transferencia de los viales a un contenedor de congelación celular y lo puso a -80 ° C.
9. Después de 24 horas, la transferencia de los viales para su almacenamiento en nitrógeno líquido.

5. El establecimiento de cultivos de congelados organoides

NOTA: Descongelar la BMM en hielo y mantener en hielo. Deje que el BM alcanzar la temperatura ambiente, y se caliente una alícuota de 10 ml a 37 ° C antes de comenzar el procedimiento de descongelación uno criovial.

1. Descongelar el vial rápidamente por agitación en un baño de agua C 37 ° hasta que todavía hay un poco de material congelado.
2. La transferencia de los organoides descongeladas a un tubo cónico de 15 ml usando una pipeta P1000.
3. Inmediatamente después, añadir 1 ml de gota BM caliente a gota mientras se agitaba la parte inferior del tubo. Una vez que se añade de 1 ml de medio, mezclar cuidadosamente con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces para diluir el medio de congelación.
4. Lentamente (gota a gota) añadir 9 ml de tibia BM a la conta tubo cónicoIning los organoides. Invertir varias veces.
5. Girar la suspensión de células durante 3 minutos a 85 x g y 8 ° C.
6. Descartar el sobrenadante con cuidado, sin perturbar el sedimento. Resuspender el organoide en 90 l de FCM suplementado con RhoKi (etapa 1.3.3). A continuación, añadir 110 l de BMM.
7. Añadir 35 l a cada pocillo de una placa de 24 pocillos pre-calentado, haciendo pequeñas, gotitas separadas.
8. Colocar la placa en el incubador a 37ºC, dejando la placa boca abajo durante 20-30 min.
9. Añadir 500 l de FCM con RhoKi a cada pocillo y la transferencia de la placa posterior a la incubadora (Figura 4A - 4C).
10. Una vez organoides se han recuperado correctamente a partir de la descongelación, se diluye en más BMM por lo que cada 10 l de BMM contiene 25-30 organoides. Este procedimiento se puede realizar de 2-3 días después de la descongelación (Figura 4D - 4G) y garantiza el buen crecimiento de la organoide.

6. inducida por la forskolina Hinchazón Comodecir (FIS)

NOTA: Fsk titulación permite la medición de la función residual CFTR. Para la modulación CFTR, organoides se exponen a un corrector dado (por ejemplo, VX-809) y / o potenciador (por ejemplo, VX-770), dependiendo del genotipo. Por lo general, el VX-809 se añade 18-24 h antes de la medición, mientras que el VX-770 y Fsk se añaden justo antes de iniciar las mediciones. Tenga en cuenta que algunos moduladores (correctores / potenciadores) pueden unirse a la superficie de plástico de la placa de ensayo.

1. Plating para el Ensayo
   NOTA: VX-809 poblaciones se dividen en partes alícuotas a 20 mM y se almacenaron a -80 ° C. Al descongelar, deje a temperatura ambiente y protegido de la luz.
   1. Procesar los organoides como se describe en la sección 3.3.
   2. Si probar el corrector VX-809, preparar una curva de dosis-respuesta por triplicado con las concentraciones siguientes: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0, y 30 mM. Preparar las diluciones de FCM.
   3. Para la placa de 96 pocillos, añadir o bien 100 μ; L de FCM con los respectivos concentración o 100 l VX-809 de FCM única e incubar la placa.
2. La medición de la Ensayo
   NOTA: VX-770 poblaciones se dividen en partes alícuotas a 20 mm, mientras que Fsk está a 10 mM; tanto se almacenan a -80 ° C. Al descongelar, dejar a temperatura ambiente y protegido de la luz.
   1. Tomar un vial de calceína y DMSO y dejar a temperatura ambiente durante 15 min.
   2. Añadir 5,1 l de DMSO al vial que se presta el calceína como un polvo, si no se abre. De lo contrario, utilice un vial calceína ya se resuspendieron que contiene 2,5 l de calceína.
   3. Añadir 2,5 l de calceína a 580 l de BM en un tubo de 1,5 ml y etiquetarlo.
   4. Añadir 10 l de esta solución de colorante (BM + calceína) a cada pocillo usando una pipeta de repetición.
   5. Resuspender una vez con una multicanal para asegurar que el tinte se mezcla bien.
   6. Se incuba la placa en una incubadora a 37 ° durante 30 min.
   7. Durante la incubación calceína, comenzar a preparar FSKy soluciones VX-770, si es necesario.
   8. Si se utiliza un potenciador de VX-770, preparar una curva de dosis-respuesta por triplicado con las concentraciones siguientes: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0, y 30 mM. En el caso de una valoración de FSK, las concentraciones son: 0, 0,008, 0,02, 0,05, 0,12, 0,32, 0,8, 2,0, y 5,0 mM. Preparar las diluciones en BM.
      NOTA: para FSK, VX-770, o cualquier otro fármaco añadido en el segundo día, las diluciones debe estar preparado a una concentración final de 2x, desde 100 l de Fsk se añadió solución / titulación fármaco a cada pocillo, que ya contienen 100 l de la FCM.
   9. La transferencia de la FSK y VX-770 soluciones, una pipeta P200, y consejos para la sala de microscopio.
   10. Para obtener imágenes del ensayo de esquí alpino, utilizar una imagen de células microscopio confocal en vivo equipado con una etapa automatizada, una cámara calentada, y el flujo de CO _2.
       NOTA: Los pasos siguientes se refieren a un microscopio específico. Diferentes configuraciones deben aplicarse a otros microscopios siguiente fabricante deinstrucciones.
   11. Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte de la placa.
   12. Introduzca los ajustes confocal para la imagen.
       1. Preestablecer la herramienta de imágenes en vivo a 37 ° C y 5% de CO ₂ y dejar que la cámara de pre-incubar durante un mínimo de 30 minutos antes de la medición.
       2. Utilice la opción "Configuración Inteligente" para seleccionar la pista Alexa Fluor-488.
       3. Ajuste el objetivo de 5X y un área de escaneado a 0.6x para alejar y capturar todo el pozo.
       4. Adaptar la sensibilidad de la potencia del láser y el detector para permitir la detección óptima de organoides etiquetados calceína verde sobre el fondo. El agujero de alfiler se puede aumentar a 130 micras y el cálculo del promedio imagen se puede ajustar a 2.
       5. Ajuste la profundidad de bits de 8 y el tamaño de cuadro de 512 x 512.
       6. Use la opción de series de tiempo para establecer la medición del tiempo, la frecuencia y los intervalos.
          NOTA: Sugerido para mediciones regulares: 1 hora con 10 minutos de intervalo: ciclos = 7 (Ciclo 1 es T = 0). Para medidas de reducción de la hinchazón, organoids se pueden obtener imágenes de hasta 3 horas.
       7. Use la opción de baldosas para determinar manualmente las posiciones de los pocillos individuales.
   13. Añadir 100 l de la FSK y / o VX-770 soluciones a los pocillos correspondientes, siguiendo el mismo orden que la medición. Empezar a añadir las soluciones en la primera fotografiados y así continuar con el orden de formación de imágenes.
   14. Iniciar la medición.
   15. Una vez finalizado el experimento, guardar el archivo.
3. Análisis de FIS de ensayo de datos
   1. Crear una macro "análisis organoide" para el análisis de los datos del ensayo FIS usando la herramienta de análisis en un software de análisis de imágenes que reconoce todas las estructuras de imagen formada a través de la pista de Alexa-488 y llena las estructuras identificadas para calcular el aumento de área organoide total sobre el diferentes puntos de tiempo.
   2. Abra el archivo de datos con las imágenes adquiridas en el programa de análisis de imágenes.
   3. Seleccione la macro para el análisis organoid.
   4. Establecer el umbral de equilibrar la relación señal-ruido en un pozo en el punto 1 vez y asegurarse de que todas las estructuras de organoides se reconocen y se llenan.
      1. Llegada 4-6 pozos para ver si todas las estructuras también son reconocidos en el punto 7. tiempo ligeramente modificar el umbral para asegurar que las señales de fondo en el punto 7 veces no se reconocen como estructuras (el umbral específico puede cambiar un poco entre los experimentos).
   5. Establecer los criterios de tamaño de área mínima de objetos reconocidos a 1.000 m ^2.
   6. Pulse el botón "Analizar" para comenzar. El análisis toma aproximadamente unos 3 minutos, dependiendo del software utilizado.
   7. Cuando se termina el software, vaya a "crear la tabla" y seleccione los siguientes datos: así los números (tabla debe aumentar en este orden), los puntos de tiempo, y el área total por pocillo.
   8. Guardar archivo como un .xlm exportar a un programa de hoja de cálculo.
   9. En este programa, se calcula el aumento relativo de la superficie por well mediante el establecimiento de la zona del punto 1 vez al 100%. Calcular el área bajo la curva (AUC) de los puntos de tiempo de 1-7 por condición; el límite inferior de la zona (valor Y) se fija en el 100%. FSK o drogas titulaciones (eje X) se representan frente a las AUC (eje Y).

Resultados

La figura 1A muestra un aislamiento fresca representante de criptas incrustados en BMM. Las criptas son de una biopsia de colon de un sujeto CF. Por lo general, un organoide se genera a partir de cada cripta (Figura 1A - C). Debido a la disfunción de la CFTR, la mayoría de los organoides de colon CF no son quística, sino más bien son compactos y con proyecciones y injertos (Figura 2A - 2B). Sin embar...

Discusión

A continuación, ofrecemos un protocolo completo para la generación, la expansión, la congelación, descongelación y de organoides colorrectal humano. Si bien hemos establecido culturas organoides humanos alguna vez hace ^{17 años,} que a veces ha sido difícil establecer la tecnología en otros laboratorios sin la formación práctica. Anticipamos que estos protocolos se sustituya dicha formación.

Wnt-3A-medio condicionado es uno de los reactivos más importantes p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#12634	stored at 4 °C
GlutaMax	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#35050	stored at 4 °C
Hepes	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	# 15630-056	stored at 4 °C
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#15140-122	stored at -20 °C
96 well culture plate	Cellstar	#655180
24 well culture plate	Cellstar	#662160
6 well culture plate	Cellstar	#657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)	Life Technologies: Gibco	#14190-094	stored at 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500 ml	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#31966-021	For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Bovogen	#SFBS LOT#11113	For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C
L Wnt3A cell line	ATCC	#CRL-2647	For Wnt-3A Conditioend Medium Production.
TOP/FOP plasmids	Millipore	#17-285	For measuring Wnt activity
pTK-Renilla	Promega	#E2241	For measuring Wnt activity
HEK-293	ATCC	#CRL-1573	For measuring Wnt activity
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	#E1910	For measuring Wnt activity
Zeocin	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#R250-01	For Wnt-3A Cell line selection
B27 supplement	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#17504-044	stored at -20 °C
N-Acetylcysteine	Sigma Aldrich	#A9165-5G	stored at -20 °C
Nicotinamide	Sigma Aldrich	#N0636	stored at -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF)	PrepoTech	#AF-100-15	stored at -20 °C
Gastrin	Sigma Aldrich	#G9145	stored at -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)	Tocris	#2939	stored at -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)	Selleckchem	#S1049	stored at -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)	Sigma Aldrich	#S7067	stored at -20 °C
Primocin	InvivoGen	#ant-pm-1	stored at -20 °C
Human Noggin (hNoggin)	PrepoTech	#120-10C	stored at -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3)	R&D Systems	#3500-RS/CF	stored at -20 °C
Vancomycin	Sigma Aldrich	#861987- 250mg	stored at -20 °C
Gentamycin	Life Technologies: Gibco	#15710-049	stored at -20 °C
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	#431788	Stored at 4 °C
Matrigel	Corning	#354230	stored at -80 °C
TryplE Express	Life Technologies: Gibco	#12605-010	for trypsinizing organoids for freezing
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies: Gibco	#12648010	for freezing
Calcein	Life Technologies: Gibco	#C3100MP	stored at -20 °C
Forskolin	R&D Systems	#1099-50 mg	stored at -80 °C
Lumacaftor (VX-809)	Selleckchem	#s1565	stored at -80 °C
Ivacaftor (VX-770)	Selleckchem	#s1144	stored at -80 °C
Name of Reagents/Material	Solvent	Stock Concentration	Final Concentration
GlutaMax		200 mM	2 mM
Hepes		1 M	10 mM
Penicillin/Streptomycin		10K U/ml 10K µg/ml	100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin		100 mg/ml	125 µg/ml
B27 supplement		100x	1x
N-Acetylcysteine	MiliQ H2O	500 mM
Nicotinamide	DPBS	1 M	10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF)	DPBS 0.1% BSA	0.5 mg/ml	50 ng/ml
Gastrin	DPBS	100 µM	10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)	DMSO	5 mM	500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)	DMSO	10 mM	10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)	DMSO	30 mM	10 µM
Primocin		50 mg/ml	100 µg/ml
Human Noggin (hNoggin)	DPBS 0.1%BSA	100 µg/ml	100 ng/ml
Human R-spondin 3 (hRspo-3)		varies per lot	300 ng/ml
Vancomycin		10 mg/ml	50 µg/ml
Gentamycin		10 mg/ml	50 µg/ml
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	MiliQ H2O	0.5 M	2 mM
Calcein	DMSO	10 µg/ml	3.3 ng/ml
Forskolin	DMSO	10 mM	variable
Lumacaftor (VX-809)	DMSO	20 mM	variable
Ivacaftor (VX-770)	DMSO	20 mM	variable