La determinación de metabolismo de la glucosa Kinetics Uso<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG Micro-PET / CT

Resumen

This study describes a protocol that uses ¹⁸F-FDG and positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) imaging, together with kinetic modelling, to quantify the in vivo, real-time uptake of ¹⁸F-FDG into tissues.

Resumen

This paper describes the use of ¹⁸F-FDG and micro-PET/CT imaging to determine in vivo glucose metabolism kinetics in mice (and is transferable to rats). Impaired uptake and metabolism of glucose in multiple organ systems due to insulin resistance is a hallmark of type 2 diabetes. The ability of this technique to extract an image-derived input function from the vena cava using an iterative deconvolution method eliminates the requirement of the collection of arterial blood samples. Fitting of tissue and vena cava time activity curves to a two-tissue, three compartment model permits the estimation of kinetic micro-parameters related to the ¹⁸F-FDG uptake from the plasma to the intracellular space, the rate of transport from intracellular space to plasma and the rate of ¹⁸F-FDG phosphorylation. This methodology allows for multiple measures of glucose uptake and metabolism kinetics in the context of longitudinal studies and also provides insights into the efficacy of therapeutic interventions.

Introducción

El propósito de este estudio fue desarrollar una tomografía por emisión de positrones / tomografía computarizada (PET / CT) metodología basada cuantificar el, la captación en tiempo real in vivo de glucosa desde el torrente sanguíneo a los tejidos específicos en ratones. Esto se logró usando fluorodeoxiglucosa marcado con F ¹⁸ (FDG) para medir la captación de glucosa y modelado cinético para estimar las tasas de captación ^{de 18} F-FDG desde el plasma al espacio intracelular, la tasa de transporte desde el espacio intracelular al plasma y la tasa de ¹⁸ fosforilación F-FDG.

En roedores, ¹⁸ F-FDG se ha utilizado en la evaluación pre-clínica de numerosos tratamientos para el cáncer ^1, estudios de la progresión tumoral ² y el metabolismo tumor ^3, así como formación de imágenes de los depósitos de grasa marrón ^4, neuroinflamación ⁵ y el cerebro metabolismo ⁶ .

Los métodos tradicionales utilizados para examinar la absorción específica de tejido de la glucosa en ratones (y ratas) generalmente implican el tratamiento con radiomarcado 2-desoxiglucosa, ya sea con ³ H o ¹⁴ C seguido de la eutanasia, la recogida de tejidos y la medición de la radiactividad en cada tejido ^7. El uso de PET / CT permite la determinación no invasiva de la captación de glucosa y el metabolismo en múltiples órganos y regiones simultáneamente en animales vivos. Adicionalmente, como la eutanasia no es un requisito, esta técnica es adecuada para uso en estudios longitudinales.

Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) se caracteriza por un metabolismo alterado de la glucosa y la hiperglucemia secundaria a la reducida respuesta tisular a la insulina (resistencia a la insulina) y la incapacidad de -Cells pancreáticas para producir cantidades adecuadas de insulina ^8. El análisis cinético de la captación de glucosa y el metabolismo puede proporcionar importantes conocimientos sobreel mecanismo de acción y la eficacia de las intervenciones terapéuticas, así como permitir la supervisión avanzada de la progresión de la enfermedad.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este estudio fueron aprobados por el Sydney área básica de salud y de la Universidad de Sydney Comités de Ética Animal y siguieron la Guía del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio, Octava edición (2011).

1. Preparación Animal

NOTA: En este db macho / protocolo de ratones db (BKS.Cg- Dock7 ^m + / + Lepr ^db / J) se mantuvieron en el alojamiento en grupo con acceso ad libitum a Chow y agua hasta las 6 semanas de edad. En el momento de formación de imágenes, los ratones se pesaron ~ 30 g. Todos los ratones utilizados en este protocolo habían ayuno niveles de glucosa en sangre entre 10 y 14 mmol / L.

1. Si es necesario, ayunar a los ratones. En el presente ejemplo, ayunar a los ratones durante 5 h antes del procedimiento experimental.
2. Tratar ratones con el agente deseado (por ejemplo, fármaco, proteína, péptido) antes del comienzo de formación de imágenes. En este ejemplo, administrar una inyección subcutánea de insulina (3U / kg de insulina humana) o un volumen equivalente de PBS 30 min antes del inicio de formación de imágenes.

2. Configurar flujo de trabajo

NOTA: Este protocolo se llevó a cabo en un escáner PET / CT. Adquirir datos de PET en primer lugar, seguido de adquisición de datos de la TC.

1. Configuración de PET:
   1. Seleccionar isótopo como ¹⁸ F, establece la duración del análisis a 3.600 s, y la discriminación de energía de nivel superior e inferior a 350 keV - 650 keV (por defecto) con una ventana de tiempo coincidencia de 3.432 ns (por defecto). Histograma de datos en modo de lista en 16 marcos (6 x 10 s, 4 x 60 s, 1 × 300 s, 5 × 600 s) para la el período 0 - 60 min después de la inyección del trazador. Reconstruir emisión sinogramas utilizando 2D-FBP con un zoom 1.5.
      NOTA: Las imágenes reconstruidas consistieron en 16 cuadros dinámicos, cada uno con 128 × 128 × 159 voxels y un tamaño de vóxel de 0,52 × 0,52 × 0,796 mm ^3.
2. Configuración CT:
   1. poruna TC de todo el cuerpo, establece la corriente a 500 A, voltaje a 50 kV, tiempo de exposición de 500 ms y 200 proyecciones más de una rotación de 360. Ajuste el campo detector de visión (FOV) a 30722048, el número de posiciones de la cama a 3 (para cubrir la gama completa FoV PET), la superposición entre las posiciones de cama = 30,234713% y detector binning a 4.
      NOTA: TC reconstrucción se realizó mediante tomografía de haz de software de reconstrucción de la imagen cono con la calibración HU, la interpolación bilineal y el filtro Shepp-Logan.
3. ¹⁸ F-FDG:
   1. Suficiente orden ¹⁸ F-FDG (por ejemplo 450 MBq en 0,5 ml) de un proveedor local para llegan ~ 30 min antes de la primera inyección. Alícuota y diluir la ¹⁸ F-FDG para que los animales reciben ~ 10 MBq de ¹⁸ F-FDG en un volumen final de 0,1 ml.

3. Protocolo Imaging

1. Limpie cámara de inducción y la cama de imagen con 80% (v / v) de etanol para mantener las condiciones asépticas. Place el ratón en una cámara de inducción y anestesiar con 5% de isoflurano en oxígeno.
2. Coloque el ratón sobre un lecho de formación de imágenes equipado con una almohadilla de calefacción eléctrica para mantener la temperatura corporal y un cono vaporizador nariz precisión para entregar isoflurano (mantenimiento, 1,5 - 2%) a una velocidad de flujo de 1 L / min. Aplicar pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
3. Coloque el ratón en una posición de decúbito prono sobre una almohadilla de sensor para supervisar la respiración y asegurar un plano adecuado de anestesia se mantiene.
4. Calentar la cola usando un paquete de calor para 1 - 2 min para dilatar la vena de la cola lateral. Cateterizar la vena lateral de la cola mediante la inserción de una aguja de calibre 30 en la vena lateral de la cola. Fije la aguja en su lugar con pegamento quirúrgico y asegurar el catéter.
5. formación de imágenes carga del lecho en el escáner y mover el lecho a través de la máquina de modo que el catéter se puede acceder desde la parte posterior de la máquina.
6. Una el catéter a la jeringa ¹⁸ F-FDG en un syrInge conductor. Calcular la ¹⁸ dosis F-FDG exacta (10 MBq) en base a la actividad en la jeringa antes de la inyección y el volumen a ser administrado (<100! L, se inyecta más de 10 s).
7. Para minimizar el impacto de la anestesia en la variabilidad de la absorción de glucosa, asegurar una constante de tiempo entre la inducción de la anestesia y la inyección de ¹⁸ F-FDG (por ejemplo, 30 min).
8. Comenzar la TEP inmediatamente antes de la inyección de ¹⁸ F-FDG. Después de terminar la exploración PET (3,600 s), realizar una exploración CT (~ 10 min) para permitir la co-registro de la captación de radiotrazador con los tejidos.
9. Mover la cama de formación de imágenes a la posición de partida, retirar el animal de la cama.
10. En este punto sacrificar al animal o permite que se recupere:
    1. Para la eutanasia, realice dislocación cervical, mientras que todavía bajo anestesia y recoger órganos de interés para su posterior análisis.
    2. Si permitiendo el ratón para recuperar, colocar el ratón en el alojamiento individual en una almohadilla de calefacción odelante de una lámpara de calentamiento. Monitorear el ratón hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Permitir que el ratón para recuperar durante 1 h antes de volver a la vivienda grupo.

4. Procesamiento de imágenes PET

NOTA: la reconstrucción de imágenes se realizó utilizando el lugar de trabajo de adquisición y análisis de software v1.5.0.28 en investigación de software v4.2 lugar de trabajo.

1. Co-registro de CT y PET imagen y asegurar que la alineación es correcta en las 3 dimensiones.
   1. En el menú 'Archivo', seleccione 'carpeta de búsqueda / Importar' y seleccionar la carpeta que contiene los datos. Seleccione los datos de PET y CT deseados y haga clic en la pestaña "Análisis General.
   2. Ordenar los datos para que el CR se designa 'Fuente' y PET se designa 'Target'. En el menú 'flujo de trabajo', seleccione 'Registro'. Si las imágenes requieren un ajuste para ser correctamente registradas conjuntamente, utilizar las herramientas de XXmenú 'Registro' e.
2. En el menú 'flujo de trabajo', seleccione 'ROI Cuantificación'.
   1. Utilizar las funciones de la 'Pan' y 'zoom' en la pestaña 'Imagen' para localizar la región deseada. En el menú 'Herramientas', seleccione la pestaña 'Crear' y haga clic en el icono de pincel. Dibujar el retorno de la inversión en la imagen
3. Extraer curvas de tiempo-actividad seleccionando 'Guardar ROI cuantificación' en el menú 'Guardar'. Guardar los datos como un archivo CSV.
4. Cuantificar la captación de radiactividad como Bq por cm ³ de tejido. Convertir los valores en porcentaje de dosis inyectada por cm ³ (% ID / cm ³⁾ mediante la carga el archivo CSV en una hoja de cálculo.

5. Función de entrada

1. Para corregir para la función de dispersión de punto del sistema, deconvoluir la PSF sistema estimado para 5 iteraciones utilizando el método de desconvolución de Van Cittert reblurred como se describió previamente ^9.
   NOTA: Esto es necesario debido al pequeño tamaño de la vena cava en un ratón.
2. Utilice imágenes enviar deconvolución para generar una curva de función de tiempo de actividad de entrada de sangre como se describió anteriormente.

6. Modelado Cinético

NOTA: La FDG de dos tejido modelo de compartimentos (Figura 1) requiere la función de entrada de plasma.

1. Convertir la función de entrada de sangre en el archivo CSV a la función de entrada de plasma usando la siguiente ecuación ^10: Input_plasma = × Input_blood (0,386 e ^{- 0.191t} + 1,165).
2. En la herramienta de modelado cinético haga clic en el botón de 'Kinetic'. Importar el tejido y la actividad total en plasma cuentan archivos CSV en la herramienta de modelado cinético mediante la selección de 'Actividad curva de tiempo de carga' del 'Menú'.
3. En el menú 'Modelo' seleccionar 2 compartimentos de tejido. Asegúrese de que la casilla junto a K4 no está seleccionadae introducir un valor de 0. Para el montaje inicial, desactive la casilla para VB (fracción de volumen de sangre) e introduzca un valor de 2%.
4. Haga clic en la 'región actual Fit'. Corregir la región extraída de interés para la dispersión ^{11, 12.} Lograr esto mediante la minimización del valor de Chi-cuadrado para el modelo FDG para diferentes tiempos de dispersión.
5. Realizar un segundo ajuste utilizando el valor vB flotante (marca la casilla junto a la caja para VB) y el valor de dispersión optimizada para calcular las constantes de velocidad regionales (k ₁ -k _3). Calcular la constante como K _i = (k ₁ × k ₃₎ afluencia regional / (k + ₂ k _3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Hemos utilizado anteriormente el / modelo de ratón db db para investigar el impacto del aumento de los niveles plasmáticos de apoA-I en la cinética de la captación de glucosa y el metabolismo de ^13. En este estudio se utilizó ratones db / db tratados con insulina para demostrar la utilidad de formación de imágenes PET / CT para monitorizar la captación de ¹⁸ F-FDG desde el plasma en el músculo gastrocnemio en tiempo real.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

El protocolo descrito aquí representa una metodología sólida, no invasivo para determinar la cinética de la absorción de glucosa desde el torrente sanguíneo en el tejido y la posterior metabolismo en ratones.

El ratón db / db es un es un modelo animal bien establecido de la diabetes de tipo 2 ¹⁴ que ha sido utilizado ampliamente para examinar la resistencia a la insulina y las intervenciones pertinentes. Sin embargo, los estudios anteriores sólo han cuantifica...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PET/CT Scanner	Siemens	Inveon
18F-FDG	PETNET Solutions
Isoflurane	Pharmachem
30 guage needle	BD	305106
PMOD modelling software	PMOD Technologies
BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J mice	Jackson Laboratory	000642
Human insulin	Sigma-Aldrich