Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

Resumen

Presentamos en el estudio actual un ensayo basado en fluorescencia novela usando linfocitos derivados de un ratón transgénico. Este ensayo es adecuado para la selección de alto rendimiento (HTS) de moléculas pequeñas dotados de la capacidad de cualquiera de inhibición o promoción de la activación de linfocitos.

Resumen

el cribado de alto rendimiento (HTS) es actualmente el pilar para la identificación de entidades químicas capaces de modular las reacciones bioquímicas o procesos celulares. Con el avance de la biotecnología y el alto potencial de traslación de moléculas pequeñas, una serie de enfoques innovadores en el descubrimiento de fármacos han evolucionado, lo que explica el resurgimiento del interés en el uso de HTS. El campo de la oncología es actualmente el área de investigación más activo para la detección de drogas, sin gran avance realizado para la identificación de nuevos compuestos inmunomoduladores de orientación complicaciones relacionadas con el trasplante o enfermedades autoinmunes. A continuación, presentamos una novela de ensayo de linfocitos a base de fluorescentes murino in vitro puede adaptar fácilmente para la identificación de nuevos compuestos inmunomoduladores. Este ensayo utiliza células T o B derivadas de un ratón transgénico, en la que el promotor dirige la expresión Nur77 GFP en T o en la estimulación del receptor de células B. A medida que la intensidad refleja la GFPactivación / actividad transcripcional de la célula diana, nuestro ensayo define una nueva herramienta para estudiar el efecto del compuesto (s) dada en las respuestas celulares / biológicos. Por ejemplo, un cribado primario se realizó con 4.398 compuestos en ausencia de una "hipótesis objetivo", lo que llevó a la identificación de 160 éxitos potenciales que muestran actividades inmunomoduladoras. Por lo tanto, el uso de este ensayo es adecuado para los programas de descubrimiento de fármacos explorando grandes bibliotecas químicas antes de continuar los estudios de validación in vitro / in vivo.

Introducción

cribado de alto rendimiento (HTS) es una estrategia probada ampliamente adoptado para la identificación de nuevas moléculas terapéuticas o para el reposicionamiento de fármacos aprobados por la FDA en nuevas indicaciones médicas. ¹ Hasta ahora, el éxito alcanzado HTS se puede medir por la gran cantidad de medicamentos descubiertos con anterioridad. Por ejemplo, el inhibidor de tirosina quinasa lapatinib utiliza para el tratamiento de cáncer de mama, la sitagliptina; una dipeptidil peptidasa-4 (DPP-4) inhibidor utilizado como un fármaco anti-hiperglucémico, y el dasatinib por vía oral inhibidor de la tirosina quinasa Bcr-Abl se utiliza para el tratamiento de la leucemia mielógena crónica representan algunos ejemplos de una larga lista de medicamentos aprobados originalmente descubierto por HTS. ² Aunque la productividad de la industria farmacéutica ha sufrido últimamente de una falta en el descubrimiento de nuevas entidades químicas, la probabilidad de descubrimiento de fármacos con éxito se puede mejorar a través de un aumento en el número de candida pre-clínicates que exhiben propiedades biológicas / bioquímicas moduladores. En consecuencia, el desarrollo de nuevos ensayos de HTS adaptados para el cribado fenotípico podría ofrecer el potencial de proporcionar importantes herramientas farmacológicas para el descubrimiento de nuevos éxitos de drogas. ^{3, 4, 5, 6} Además, HTS ahora pueden llevarse a cabo a un ritmo más rápido debido a las transformaciones tecnológicas importantes en los últimos años, incluyendo instalaciones de diseño personalizado flexibles, nuevas tecnologías robóticas Lectura y extensa miniaturización. ^{2, 7} Entre los factores que contribuyen a la creciente interés en el uso de la detección fenotípica (aka hacia adelante farmacología) es la percepción de que se centra en los efectos funcionales en lugar de supuestos reduccionistas simplistas con respecto a dianas moleculares (detección / reacciones bioquímicas por objetivos) es más probable sho eficacia clínica w. Por lo tanto, el cribado fenotípico mantiene la promesa de descubrir nuevos compuestos potencialmente terapéuticos y vías moleculares de las enfermedades actualmente incurables. ²

Para identificar correctamente inhibidores o activadores para una diana molecular dada o la función celular, se requiere un ensayo altamente sensible y fiable con el fin de diferenciar entre los accesos de buena fe y falsos positivos. Por lo tanto, lo que hace un buen ensayo? La calidad de un ensayo dado debe ser primero juzgado por la relación de señal a ruido (que se refleja a través de un factor Z). ⁸ En segundo lugar, el efecto específico o el objetivo de la pantalla deben estar claramente establecidas. Por ejemplo, los enfoques basados ​​en células funcionales pueden ofrecer ventajas significativas para la detección del receptor en lugar de un ensayo diseñado específicamente para evaluar la unión del ligando-receptor. La razón de esto es que el último enfoque no puede diferenciar entre ligandos agonistas y antagonistas.ss = "xref"> 9 En contraste, un enfoque basado en la célula es probable que sea más eficaz como la función del receptor puede ser evaluada directamente en un fenotipo biológico (proliferación, la detención del ciclo celular, apoptosis, y / o diferenciación). Sin embargo, hay que señalar que los ensayos bioquímicos pueden proporcionar ventajas significativas sobre ensayos fenotípicos, ya que infringen una diana intracelular específica. Un ensayo bioquímico bien optimizado en general, tendrá menos dispersión de datos que un cribado fenotípico al tiempo que simplifica posteriormente las investigaciones relacionadas con el mecanismo molecular de acción de drogas. Sin embargo, el principal inconveniente de los ensayos basados ​​en diana o bioquímicos es la posibilidad de amplificar la tasa de falsos positivos hits que pueden afectar a los objetivos no específicos cuando se prueba en un sistema biológico (pérdida de la especificidad estudiado originalmente en el ensayo bioquímico). ¹⁰ Aunque un punto de corte bien establecida entre los accesos negativos y positivos puede minimizar el número de falsos positivos in el cribado primario, el uso de un sistema fisiológicamente relevante imitando el ambiente celular nativo, como células intactas, todo el tejido o animal conjunto sigue siendo el núcleo del péndulo diseño de ensayo. Por lo tanto, el cribado fenotípico permite el descubrimiento de cabezas con efectos fenotípicos biológicos / deseables para las enfermedades que no tienen objetivos de medicamentos identificados sin tener conocimiento previo de la actividad o modo de acción del compuesto. ¹¹

El estudio en el presente documento se refiere al desarrollo y ensayo de un cribado fenotípico optimizado y reproducible basado en dos componentes importantes: un modelo de ratón comercialmente disponible y un clúster sub-familia de compuestos químicos. Con respecto al modelo animal, el ensayo se basa en el uso de los linfocitos derivados de una cepa de ratón (Nur77 ^GFP) que alberga un cromosoma artificial bacteriano que contiene un casete en el que la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) es conducido por THpromotor e Nur77. ¹² La característica distintiva de esta estimulación se basa en el hecho de que Nur77 es un gen temprano inmediato hasta reguladas siguiente receptor de células T (TCR) o la estimulación del receptor de células B (BCR). ¹² En cuanto al método de detección en sí, se utilizó un enfoque para ayudar a evitar la detección de análogos triviales y reducir al mínimo el tiempo necesario para evaluar una gran biblioteca química (> 10 ⁵ compuestos). Para ello, una base de datos de compuestos químicos seleccionados por los químicos medicinales que utilizan herramientas de cribado virtual fue explotada para identificar compuestos topológicamente similares utilizando estructuras de semillas activas conocidas como referencias. Este enfoque nos ha permitido a la pantalla de 4.398 compuestos que representan una biblioteca global de más de 136.000 entidades químicas.

Protocolo

Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Montreal. Los ratones fueron sacrificados por inhalación de CO ₂ gradual hasta que no se observaron signos vitales seguido por dislocación cervical. El procedimiento se llevó a cabo por una persona certificada para garantizar que los animales fueron sacrificados de manera humanitaria y de acuerdo con las recomendaciones del Consejo Canadiense de Protección de los Animales.

1. Preparación de esplenocitos medio y citometría de flujo Buffer

1. Realizar todos los pasos bajo una campana biológica limpiado-etanol al 70%.
2. Retire 70 ml de pre-calentado Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x (disponible en el mercado y se suministra en 500 ml de volumen botellas estériles filtradas) y colocar en un tubo estéril. El medio retirado se utilizará más adelante en el protocolo.
3. Suplemento los restantes 430 ml de RPMI 1640 1x con 50 ml de suero bovino fetal inactivado (FBS), 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5ml de HEPES, 5 ml de aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 5 ml, y 0,05 ml de filtrados (1M) 2-mercaptoetanol.
   NOTA: medio de esplenocitos Pre-caliente usando un baño de agua a 37 ºC para evitar un choque térmico células. Esto es importante para evitar la inducción de la apoptosis celular.
4. Para preparar el tampón de citometría de flujo, agregar 2 ml de FBS a 98 ml de tampón fosfato salino (PBS) y mantener refrigerado hasta su uso (preferentemente dentro de los tres días).

2. Generación de Splenocyte Suspensión de la Celda de Nur77 ^GFP mouse bazos

1. A septically aislar el bazo de un 6-8 semanas de edad de ratón Nur77 ^GFP.
   1. Para lograr esto, trabajar bajo campana estéril. Remojar el ratón de piel, tijeras y pinzas sacrificados en etanol al 70%.
   2. Coloque el ratón sobre su lado derecho, cortar la piel y los músculos abdominales en el cuadrante superior izquierdo. Inspeccionar el área de la incisión para localizar de forma visible el bazo luego cortarlo. Mantenga el bazoen medio de esplenocitos en hielo hasta el momento de realizar el siguiente paso.
2. Coloque el bazo (s) en un 10 cm ² de células placa de cultivo de Petri que contiene 5 ml de medio de esplenocitos pre-calentado.
3. Triturar el bazo usando un émbolo de jeringa estéril hasta que la solución es turbia. Una matriz de colágeno bazo debe permanecer por el final del procedimiento.
4. Tras una amplia maceración en medio de esplenocitos, recoger la suspensión de células y pasarlo a través de un filtro de células de 70 micras colocado en un tubo de 50 ml de filtrado de salida cualquier residuo o coágulos.
5. Centrifugar a 500 g durante 5 min. Después de desechar el sobrenadante, volver a suspender el sedimento celular en 2-3 ml de tampón de lisis hecho en la compañía o comercial de glóbulos rojos. Después de pipeteado (2-3 veces) dejar que el resto suspensión durante 20-30 s.
6. Añadir 5 ml de PBS o un tampón adecuado de elección centrifugar la suspensión celular durante 5 minutos a 500 x g.
7. Eliminar el sobrenadante (debe ser de color rojo, ya que contiene lisaron roja bLood células) y vuelva a suspender el sedimento celular en 2 ml de medio de esplenocitos.
8. El uso de un hemocitómetro, contar el número de células teñidas con azul tripán para distinguir entre células vivas y muertas (necrosis).

3. Aislamiento de células T de la célula de suspensión de esplenocitos

1. Centrifugar la suspensión celular durante 5 minutos a 500 x g. Vuelva a suspender las células en medio RPMI libre de suero (50 ml procedentes de la etapa 1.3) para obtener una concentración celular de 10 x 10 ⁶ células / ml.
2. Transferir las células a un tubo de poliestireno de 5 ml y dejar de lado una alícuota de 100 l de esplenocitos de pureza evaluación / comparación al final de la etapa de purificación.
3. Añadir suero de rata normal a la suspensión celular a 50 l / ml seguido de T cóctel de anticuerpos de aislamiento de células (50 l / ml).
4. Mezclar la suspensión de células y se deja reposar durante 10 minutos. Este paso permite que el cóctel de anticuerpos se unen a todas las células no deseadas.
5. Añadir las esferas de estreptavidina rápidos (imánperlas IC) para 2,5 min, a continuación, llevar el volumen a 2,5 ml usando el medio libre de suero.
6. Colocar el tubo en un imán de aislamiento de células de 3 min.
7. Transferir la suspensión de células T en un nuevo tubo de poliestireno sosteniendo el imán y verter la solución en un solo movimiento.
   NOTA: La suspensión aislado contiene las células T purificadas. Todas las células no deseadas se llevan a cabo en el lado del tubo unido a las perlas de estreptavidina magnéticas.
8. Contar las células T aisladas utilizando azul tripán y un hemocitómetro.
   NOTA: En este paso la pureza de las células T aisladas puede ser verificada (opcional) mediante el análisis del porcentaje de eventos CD3 ⁺ antes y después del aislamiento de células T por citometría de flujo. ¹³
   1. Brevemente, se centrifuga 1 ml de suspensión de células de esplenocitos a 500 x g. Descartar el sobrenadante y suspender las células en tampón de citometría de flujo a una concentración de 1 x 10 ⁶ células / ml.
   2. Añadir fluorescente marcada con anti-mousanticuerpo e CD3 a una concentración de 1: 100. Se incuba a 4 ° C durante 30 min. Lavar una vez, centrifugar y resuspender en tampón de citometría de flujo (400 l) para el análisis por citometría de flujo.

4. Aislamiento de células B de la célula de suspensión de esplenocitos

1. Siguen el mismo protocolo que el descrito para las células T (pasos 3.1 a 3.8), pero utilizando un kit de aislamiento de células B. Para la evaluación de la pureza, utilizar el anticuerpo CD19 en lugar del anticuerpo CD3. ¹³
   1. Para la evaluación de la pureza (opcional), utilizar el anticuerpo CD19 en lugar del anticuerpo CD3. Centrifugar 1 ml de suspensión de células de esplenocitos a 500 x g. Descartar el sobrenadante y suspender las células en tampón de citometría de flujo a una concentración de 1 x 10 ⁶ células / ml.
   2. Añadir fluorescente marcado anti-ratón de anticuerpo CD19 a una concentración de 1: 100 y se incuba a 4 ° C durante 30 min. Lavar una vez, centrifugar y resuspender en tampón de citometría de flujo (400 l) for el análisis por citometría de flujo.

5. La activación de células T y la inducción de la expresión de GFP

1. Semillas de las células T, en suspensión, en una placa de 96 pocillos de fondo redondo en una concentración de 2,5 x 10 ⁵ células / pocillo.
2. Añadir interleucina recombinante (IL) -7 / cuentas a 2 ng mL y CD3 / CD28 magnéticas (25 l / 10 ⁶ células). Mantener una parte de las células T no tratadas con los granos para servir como un control negativo para las mediciones posteriores que representan las células T no activadas.
3. Doce horas más tarde, la cosecha de las células T de la placa de 96 pocillos pipeteando suavemente la suspensión celular en cada pocillo arriba y hacia abajo para romper cualquier complejos de células grano / agregados. Recoger la suspensión de todos los pocillos en un tubo de poliestireno de 5 ml.
4. Se coloca el tubo que contiene la suspensión dentro del mismo imán de aislamiento de células utilizado anteriormente para la purificación de las células T o B y deje reposar durante 5 minutos.
5. La transferencia de la suspensión de células T intOA nuevo tubo de poliestireno sosteniendo el imán y verter la solución en un solo movimiento.
6. Centrifugar las células a 500 xg durante 5 min. Vuelva a suspender las células en medio de esplenocitos fresca para obtener una concentración de 2 x 10 ⁶ células / ml.
7. Evaluar la expresión de GFP intensidad por citometría de flujo (opcional para el control de calidad) a las 12 a 24 h después de la estimulación en comparación con las células T no activadas. ¹²
   NOTA: La fluorescencia GFP es intrínseco a las células T Nur77 ^GFP y se manifiesta tras la activación con éxito de la TCR. ¹²
8. Para la evaluación de la viabilidad y la activación (opcional) por microscopía, teñir las células activadas con Hoechst 30 min antes del análisis a una concentración de 0,2 g / ml. Añadir un volumen adecuado de la suspensión de células a un portaobjetos de cubierta o a un pocillo de una placa de 384 pocillos negro caras de fondo plano y se examina al microscopio de fluorescencia para evaluar las células vivas. Las células muertas no conservarán nucleartinción. ¹⁴

6. La activación de células B y la inducción de la expresión de GFP

1. El uso de un frasco de cultivo T-25, volver a suspender las células B aisladas a 1 x 10 ⁶ células / ml.
2. Añadir anti-ratón IgG / IgM (H + L) a 10 l / ml y CD40L recombinante a una concentración de 200 ng / mL. Mantener una porción de las células B sin tratar para servir como un control negativo para las mediciones posteriores (que representa las células B no activadas).
3. Evaluar la expresión de GFP intensidad por citometría de flujo a las 12 ó 24 horas después de la estimulación en comparación con las células B no activadas.
   NOTA: La fluorescencia GFP es intrínseco a las células ^GFP Nur77 B y se manifiesta tras la activación con éxito de la BCR. ¹²
4. Para la evaluación de la viabilidad y la activación (opcional) por microscopía, teñir las células activadas con Hoechst 30 min antes del análisis a una concentración de 0,2 mg / ml. Añadir un volumen adecuado de la suspensión celular aun portaobjetos de cubierta o a un pocillo de una placa de 384 pocillos negro caras de fondo plano y examinar en un microscopio de fluorescencia para evaluar las células vivas. Las células muertas no conservarán la tinción nuclear. ¹⁴

7. cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

1. Preparar una suspensión de células a 2 x 10 ⁶ células / ml de las células T o B activados (perlas magnéticas o anticuerpos / CD40L) o grupos no activado.
2. Placa de 75.000 células / pocillo en una placa de 384 pocillos (volumen de 40 l). Utilice una placa de 384 pocillos negro caras de fondo plano o una cubierta de portaobjetos de microscopio para determinar la viabilidad y la activación evaluación por microscopía fluorescente (paso opcional de control de calidad antes de la HTS) usando Hoechst mancha (consulte los pasos 5.8 y 6.4 para más detalles). ¹⁴
3. Manualmente o utilizando un sistema automatizado, añadir los fármacos de elección (disuelto en 0,5% de DMSO) a cada pocillo.
4. Añadir el vehículo (DMSO) a positivo (activado) y negativo (no activada) pocillos de control. Ajuste concentración de DMSO a un máximo de 0,5%.
5. Se incuban las placas durante 24 h (o tiempo de incubación de elección) a 37 ° C y 5% de _CO2.
6. En el día de la proyección, diluir el Hoechst 33342 solución de tinción (1:. 3333; por ejemplo, para añadir 10 l a las células en las placas de 384 pocillos para generar un volumen total de 50 l). Mancha de 30 min antes del análisis GFP mediante la adición de solución de Hoechst para alcanzar una concentración de 0,2 mg / ml.
7. pipeta suavemente las células arriba y hacia abajo para obtener una distribución homogénea en cada pocillo.
   NOTA: Este paso es importante en caso de prescindir de los fármacos (paso 7,3) usando un sistema automatizado como las células tienden a acumularse en un lado del pozo, opuesta a la dirección del flujo.
8. Girar las placas a 45 xg durante 3 min a temperatura ambiente.
9. Deje las placas en reposo durante 15 minutos a temperatura ambiente.
10. Realizar placa (s) de lectura-outs, utilizando los scre alto contenido confocal automatizadosforta- sistema (HCS). ¹⁵ Cargar la placa a la máquina. Fijado el objetivo a 40X o mayor aumento. Usar cámara # 4 por Hoechst (lámpara UV) y la cámara # 1 para GFP (láser de 488). Configurar la máquina para leer 6-10 campos por pocillo. Ajustar la máquina para hacer dos lecturas secuenciales por campo a 488 nm (para leer GFP) y la luz UV (para leer Hoechst). Fijado el objetivo a 40X o mayor aumento.
    NOTA: El sistema computarizado es un microscopio que no requiere ningún ajuste. La distancia focal, la intensidad de la luz incidente y el tiempo de exposición son todos de configuración automáticamente por la máquina.

Resultados

Diseño del ensayo HTS

Dos factores importantes fueron tomadas en cuenta al diseñar el ensayo en el presente documento fluorescente. En primer lugar, tuvimos que repetir una condición fisiológica en la que la activación de células T o B representaría una enfermedad (por ejemplo, enfermedad de injerto contra huésped). En segundo lugar, la evaluación de la activación celular debe ser realizada utilizando un métod...

Discusión

Varios métodos de lectura de salida se han explotado para el desarrollo de ensayos de HTS sensibles y fiables. Estos incluyen colorimétrica, luminiscente o métodos fluorescentes. Aunque los métodos colorimétricos son simples de configuración, se requieren múltiples adiciones de productos químicos, que pueden interferir o interrumpir las células que están siendo probados. ²³ Además, no permiten la evaluación dinámica de una respuesta biológica tal como el efecto farmacológico se eva...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nur77GFP mice	The Jackson Laboratory	Mouse strain No. 016617	An in house colony was established at our animal facility
96 wells-U culture plates, sterile	VWR International	10062-902	T-cell activation using the magnetic beads
70 µm cell strainer, sterile	Corning Inc.	352350	Generation of splenocytes cell suspension
5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile	Corning Inc.	352058	Generation of splenocytes cell suspension
50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile	VWR International	89039-656	Generation of splenocytes cell suspension
10 ml syringe without needle, sterile	Becton, Dickinson and Company	305482	To mash the spleen
T-25 culture flask	Greiner Bio-One	690 175	To incudabte B cells during activation
5 ml cell culture dish, sterile	Greiner Bio-One	627 160	To mash the spleen
Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL)	WISENT Inc.	450-200-EL	Component of the splenocyte media
RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine	WISENT Inc.	350-002-CL	Component of the splenocyte media
MEM non-essential amino acids	WISENT Inc.	321-010-EL	Component of the splenocyte media
HEPES free acid 1 M	WISENT Inc.	330-050-EL	Component of the splenocyte media
Sodium pyruvate solution (100mM)	WISENT Inc.	600-110-EL	Component of the splenocyte media
Fetal Bovine Serum (FBS)	WISENT Inc.	080-910	Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer
Phosphate buffered saline (PBS)	WISENT Inc.	311-010-CL	Component of flow-cytometry buffer
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Thermo Fisher Scientific	21985-023	Component of the splenocyte media
T-Cells isolation kit	Stemcell Technologies	19851	To isolate T cells
B-Cells isolation kit	Stemcell Technologies	19854	To isolate B cells
Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads	Thermo Fisher Scientific	11452D	To activate T cells
Cell isolation magnet	Stemcell Technologies	18000	To isolate T cells and remove the magnetic beads
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.	115-006-068	To stimulate B cells
Recombinant Murine IL-7	Peprotech	217-17	To support T-cell survival during activation
Recombinant CD40L	R&D Systems	8230-CL/CF	To stimulate B cells
Anti-mouse CD3 antibody	BD Pharmingen	561799	To stain T cells for flow-cytometry
Anti-mouse CD19 antibody	BD Pharmingen	553786	To stain B cells for flow-cytometry
Biomek FXp	PerkinElmer Inc.	A31842	To re-suspend cells after 24 h incubation
Opera Phenix High Content Screening System	PerkinElmer Inc.	HH14000000	To analyze GFP/Hoechst signal