Lesión por aplastamiento aórtico murino: una eficacia<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de proliferación de células musculares lisas y función endotelial

Resumen

La reestenosis después de los procedimientos cardiovasculares (cirugía de bypass, angioplastia o stent) es un problema significativo que reduce la durabilidad de estos procedimientos. Una terapia ideal inhibiría la proliferación de células de músculo liso (VSMC) mientras promovía la regeneración del endotelio. Describimos un modelo para la evaluación simultánea de la proliferación VSMC y la función endotelial in vivo.

Resumen

La reconstrucción arterial, ya sea angioplastia o cirugía de derivación, implica un traumatismo iatrogénico que causa disrupción endotelial y proliferación de células de músculo liso vascular (VSMC). Los modelos murinos comunes estudian vasos pequeños tales como las arterias carótida y femoral. Aquí se describe un sistema in vivo en el que tanto la proliferación VSMC y la función de la barrera endotelial pueden ser evaluados simultáneamente en un vaso grande. Se estudió la respuesta aórtica infrarrenal a la lesión en C57BL / 6 ratones. La aorta se lesionó de la vena renal izquierda a la bifurcación aórtica por 30 trituraciones transmurales de 5 segundos de duración con un aplicador con punta de algodón. Los cambios morfológicos se evaluaron con histología convencional. El grosor de la pared de la aorta se midió desde la superficie luminal hasta la adventicia. EdU integración y contador tinción con DAPI y alfa-actina se utilizó para demostrar VSMC proliferación. La activación de ERK1 / 2, un moderador conocido de la formación de hiperplasia intimal, fue disuadidaExtraído por Western Blot. El efecto de la inflamación se determinó mediante inmunohistoquímica para células B, células T y macrófagos . Se visualizaron secciones frontales de endotelio con microscopía electrónica de barrido (SEM). La función de la barrera endotelial se determinó con tinción con Evans Blue. La lesión transmural resultó en un espesamiento de la pared aórtica. Esta lesión inducida por la proliferación VSMC, más prominentemente a los 3 días después de la lesión, y la activación temprana de ERK1 / 2 y disminución de p27 ^kip1 expresión. La lesión no resultó en aumento de células B, células T o infiltración de macrófagos en la pared del vaso. La lesión causó la desnudación parcial de las células endoteliales y la pérdida del contacto célula-célula. La lesión resultó en una pérdida significativa de la función de la barrera endotelial, que regresó a la línea de base después de siete días. El modelo transmural de lesión aórtica romana transmural proporciona un sistema eficiente para estudiar simultáneamente tanto la proliferación VSMC como la función de la barrera endotelial en un vaso grande.

Introducción

Restenosis Después de los procedimientos cardiovasculares (cirugía de bypass, angioplastia o stent) es un problema significativo que reduce la durabilidad de estos procedimientos. Todos los procedimientos de revascularización están plagados de reestenosis. Las estrategias actuales para prevenir la reestenosis (stents liberadores de fármacos y globos revestidos con fármacos) inhiben tanto la célula muscular lisa vascular (CMLV) como la proliferación de células endoteliales (EC). En consecuencia, estas intervenciones previenen la reestenosis mediada por VSMC, pero también previenen la regeneración del endotelio. Sin un endotelio intacto, se requiere que los pacientes estén en potentes agentes antiplaquetarios para disminuir el riesgo de trombosis in situ con riesgo de complicaciones hemorrágicas. Una terapia ideal inhibiría la proliferación de VSMC mientras que promovía la regeneración del endotelio. Por lo tanto, existe la necesidad de estudiar simultáneamente la proliferación VSMC y la función de barrera endotelial in vivo .

En la actualidad, hayModelos de ratón de restenosis ¹ . Estos modelos incluyen la ligadura de la carótida y la lesión del hilo de la arteria femoral ² . Los modelos aórticos incluyen la colocación del stent ³ , lesión por globo ⁴ y aloinjerto aórtico ⁵ . Todos los modelos actuales son limitados. La ligadura carotídea genera una lesión neoíntima mediada por flujo y no tiene lesión endotelial. Además, las arterias carótida y femoral tienen muchas capas de células plegadas menos que los vasos humanos, limitando su valor de traducción. La aorta del ratón, de aproximadamente 1,3 mm de diámetro, es el único vaso que se aproxima a una arteria humana (coronaria) clínicamente relevante (3).

A pesar del potencial de traslación de los modelos aórticos murinos de la enfermedad, los modelos actuales tienen limitaciones. Estos modelos requieren habilidades microquirúrgicas avanzadas y equipos especializados tales como globos de angioplastia y stents. Aquí presentamosUna técnica nueva y reproducible para inducir simultáneamente la proliferación de VSMC y alterar la función de la barrera endotelial.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Declaración de Ética: Los protocolos para el manejo de animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales (IACUC) de la Universidad de Maryland (protocolo número 0416009) y conducido de acuerdo con los estándares de AAALAC-International.

1. Procedimiento Quirúrgico

1. Técnica Anestésica
   1. Esterilizar todos los instrumentos utilizados en la cirugía de supervivencia con esterilización a vapor a 121 ° C durante 30 min.
   2. Inducir la anestesia a través de un tanque de inducción con 100% de O ₂ y 2,5% de isoflurano entregado a través de vaporizador de precisión. Después de la inducción, suspender el isoflurano y enjuagar la cámara con O ₂ . Mantener la anestesia con 1,5-2% de isoflurano vía mascarilla y 1 L / min de O ₂ por inhalación.
   3. Conecte la cámara de inducción y la máscara facial a un eliminador de carbón para adsorción de gases residuales para proteger al personal. Asegurar un plano anestésico adecuadoQue no hay respuesta a los estímulos nocivos (pinzamiento del dedo).
   4. Crear un campo operatorio que consiste en una bandeja quirúrgica con almohadilla isotérmica para proporcionar soporte térmico durante la cirugía. Una almohadilla isotérmica adicional proporcionará apoyo térmico a los animales en su jaula de recuperación.
2. Preparación de Animales
   1. Lleve a cabo la siguiente investigación en ratones C57BL / 6 machos de 10-12 semanas de edad.
   2. Quitar el pelo en la superficie abdominal ventral del animal desde el esternón a la región inguinal con un agente depilatorio o una podadora eléctrica con una cuchilla número 40.
      1. En caso de agente depilatorio, aplicar este compuesto en el área quirúrgica durante 2-3 minutos y luego eliminarlo con algodón. Utilizamos un compuesto comercialmente disponible de hidróxido de calcio e hidróxido de sodio.
   3. Preparar el área sobre el hombro con alcohol al 70% e inyectar por vía subcutánea carprofeno (5 mg / kg) con una aguja calibre 25 o menor. EstaEl tratamiento proporcionará analgesia postoperatoria para el animal.
   4. Transferir el animal al campo quirúrgico y colocarlo en decúbito dorsal.
   5. Prepare el sitio quirúrgico frotando 8-12% de providone-yodo con un aplicador de algodón limpio o gasa de algodón. A continuación, enjuague la piel dos veces con alcohol al 70%.
   6. Coloque lubricante ocular en ambos ojos para reducir la incidencia de desecación corneal. Cubrir el sitio quirúrgico con un paño estéril.
3. Técnica Operativa
   1. Realizar una incisión mediana de laparotomía abdominal de aproximadamente 2-2.5 cm de largo con un bisturí comenzando inmediatamente caudal el proceso xifoide y extendiéndose hacia la pelvis.
   2. Movilizar el intestino delgado y el duodeno y reflejar lateralmente a la derecha. Enrolle una tira de algodón estéril calibrado y empapado con solución salina estéril para inyección para permitir el embalaje de las vísceras para mejorar la exposición.
   3. Con el intestino delgado movilizado hacia el lado derecho delAbdomen, exponen el retroperitoneo y exponen la aorta abdominal de la vena renal izquierda a la bifurcación aórtica ( Figura 1 ).
   4. Con un aplicador estéril con punta de algodón, entregar 30 machos consecutivos, cada cinco segundos de duración.
   5. Retire el empaque y permita que las vísceras vuelvan a su posición nativa.
   6. Cerrar la fascia con una sutura de monofilamento absorbible 4-0 (polidioxanona). La piel se cierra con una sutura de monofilamento no absorbible 6-0 (nylon).
4. Recuperación y atención después del procedimiento
   1. Después del procedimiento, coloque el animal en una jaula de recuperación con ropa de cama limpia en una almohadilla isotérmica para continuar el apoyo térmico hasta que el animal pueda moverse normalmente. No deje al animal desatendido hasta que demuestre la capacidad de mantener la decúbito esternal.
   2. Vigilar el animal cada hora durante las primeras 4 h después de la cirugía. Una vez que el animal está ambulando normalmente regreso T a la sala de cría asignada. El animal no se alojará en compañía de otro animal hasta que se haya recuperado completamente.
   3. Vigilar el animal dos veces al día durante las primeras 72 h después de la cirugía y al menos 3 veces a la semana después. El monitoreo incluye el pesaje del animal tres veces a la semana.
   4. Administrar carpofen (5 mg / kg) por vía subcutánea dos veces al día durante las primeras 72 h después de la cirugía.

2. Adquisición de tejidos

1. Método de Eutanasia
   1. Eutanizar a los animales en puntos de tiempo predeterminados.
   2. Inducir la anestesia a través de un tanque de inducción con 100% de O ₂ y 2,5% de isoflurano entregado a través de vaporizador de precisión.
      1. Para estudiar la integridad del endotelio, administre el tinte azul de Evans al animal.
         NOTA: Evans Blue es un colorante azo cargado negativamente con una alta afinidad de unión para la albúmina y sólo puede manchar los vasos sanguíneos en ausencia de un endotelio intactoS = "xref"> 6.
      2. Para los estudios de integridad endotelial, en el momento de la eutanasia, perfundir a los animales con 5 ml de colorante Evans Blue 0,3% seguido por 5 ml de PBS a presión fisiológica durante 5 min. El animal se mantiene en un plano quirúrgico de anestesia durante el procedimiento de perfusión.
   3. Después de lograr un plano anestésico profundo, abra el pecho con una esternotomía. Hacer una laceración en la aurícula derecha para permitir el drenaje de la sangre del animal y acceder al ventrículo izquierdo se accede con una aguja de 21 G e inyectar solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta que el efluente de la aurícula derecha sea claro.
   4. Después de la perfusión con PBS, entrar en el abdomen a través de una incisión de línea media.
   5. Una vez más, movilice el intestino delgado hacia el lado derecho del abdomen exponiendo la aorta infrarrenal, diseccione agudamente la aorta de los tejidos adyacentes y extráigala de la vena renal izquierda a la bifurcación aórtica.
   6. Almacenar la aorta extirpada en un 4% paraformalEhyde hasta que se produzca el procesamiento del tejido.
      1. Para los estudios de integridad endotelial, abrir la aorta longitudinalmente y fijarla a una lámina de cera exponiendo la totalidad de la superficie luminal ⁶ . Realizar una evaluación cualitativa de la integridad endotelial por el grado de tinción con colorante Evans Blue ⁶ .
      2. Para otros ensayos histológicos, corte transversalmente la aorta e incorpórela en los compuestos de temperatura óptima de corte (OCT) según lo determinado por el método histológico a utilizar ⁷ .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Se seccionaron las secciones transversales aorta incrustadas en PTU y se tiñeron con hematoxilina y eosina luego se tiñeron con tinción de Verhoeff-Van Gieson (VVG) para identificar la lámina elástica interna y externa ⁷ . La lesión por aplastamiento indujo el espesamiento de la pared aórtica en comparación con las aortas de los animales tratados con un procedimiento simulado (laparotomía y movilización del intestino delgado solo). El grosor de la pared,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Hemos caracterizado los efectos de un modelo de lesión aórtica murina que resulta en hiperplasia medial y disfunción de la barrera endotelial. Desprendimiento parcial de la EC a lo largo de la aorta íntima acompañó a la pérdida de contacto célula-célula y la mejora de las protrusiones celulares. De manera correspondiente, la función de la barrera endotelial se deterioró significativamente, lo que estimuló las vías de señalización sensibles a mitógenos, dando lugar a la proliferación de VSMC y el engrosa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ocular lubricant	Dechra	17033-211-38	Pharmaceutical agents
Isoflurane	VetOne	502017	Pharmaceutical agents
Carprofen	Zoetis	26357	Pharmaceutical agents
Precision vaporizer	Summit Medical	10675	Surgical supplies
Charcoal scavenger	Bickford Inc.	80120	Surgical supplies
Isothermal pad	Harvard Apparatus	50-7053-R	Surgical supplies
Sterile cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-124	Surgical supplies
4-0 absorbable monofilament suture	Ethicon, Inc	J310	Surgical supplies
5-0 non-absorbable monofilament suture	Ethicon,Inc	1666	Surgical supplies
21-gauge x 1 inch needle	BD Biosciences	305165	Surgical supplies
25-gauge x 1 inch  needle	BD Biosciences	305125	Surgical supplies
Dry sterilizer	Cellpoint	7770	Surgical supplies
Fine scissors	Fine Science Tools	14058-09	Surgical instruments
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12	Surgical instruments
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	Surgical instruments
Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge	Fine Science Tools	15000-00	Surgical instruments
Needle driver	Fine Science Tools	91201-13	Surgical instruments
Scalpel handle #4	Fine Science Tools	10004-13	Surgical instruments
Scalpel blades #10	Fine Science Tools	10010-00	Surgical instruments
PBS	Lonza	17-516F	Reagents for tissue processing
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129	Reagents for tissue processing
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagents for tissue processing
Modeling wax	Bego	40001	Reagents for tissue processing
OCT compound	Tissue-Tek Sakura	4583	Reagents for tissue processing
Mayer's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	MHS16	Reagents for immunohistological analysis
Eosin Y solution alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110316	Reagents for immunohistological analysis
Elastin stain kit	Sigma-Aldrich	HT25A	Reagents for immunohistological analysis
Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit	Invitrogen	C10337	Reagents for immunohistological analysis
Anti-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4695	Reagents for immunohistological analysis
Anti-phospho-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4370	Reagents for immunohistological analysis
Anti-p27kip1 antibody	Cell Signaling Technology	3698	Reagents for immunohistological analysis
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	Reagents for immunohistological analysis