El campo local microscopía de fluorescencia: Imágenes señales celulares en los corazones intactos

Resumen

En el corazón, los eventos moleculares coordinan la función eléctrica y contráctil del órgano. Un conjunto de técnicas de microscopía de fluorescencia de campo locales que aquí se presenta permite el registro de las variables celulares en los corazones intactos. La identificación de los mecanismos que definen la función cardíaca es fundamental para entender cómo el corazón trabaja en situaciones patológicas.

Resumen

En el corazón, los estudios moleculares de señalización se realizan generalmente en miocitos aislados. Sin embargo, muchas situaciones patológicas tales como la isquemia y las arritmias sólo pueden comprenderse por completo en todo el nivel de órganos. A continuación, presentamos la técnica de espectroscopia de fluorescencia local de microscopía de campo (LFFM) que permite la medición de señales celulares en el corazón intacto. La técnica se basa en una combinación de un corazón perfundido Langendorff y fibras ópticas para registrar señales fluorescentes. LFFM tiene varias aplicaciones en el campo de la fisiología cardiovascular para estudiar el corazón bajo condiciones normales y patológicas. las variables cardiacas múltiples pueden ser controlados utilizando diferentes indicadores fluorescentes. Estos incluyen citosólico [Ca ^{2 +],} el retículo sarcoplásmico intra-[Ca2 ^+] y los potenciales de membrana. Las sondas fluorescentes se excitan exógenos y la fluorescencia emitida detectaron con tres modalidades diferentes de la técnica LFFM epifluorescencias presentado en este documento. Las diferencias centrales entre estas técnicas son el tipo de fuente de luz utilizada para la excitación y en el camino se modula la luz de excitación. El LFFM pulsado (PLFFM) utiliza pulsos de luz láser de onda continua, mientras que LFFM (CLFFM) utiliza luz láser para la excitación continua. Por último, diodos emisores de luz (LEDs) se utilizaron como fuente de luz tercera. Esta disposición no coherente se llama pulsada microscopía de fluorescencia LED (PLEDFM).

Introducción

El corazón es el órgano central del sistema cardiovascular. La contracción del corazón se inicia por un aumento de intracelular [Ca ^{2 +].} La relación entre la excitabilidad eléctrica y los cambios en la liberación ^de Ca2 ⁺ intracelular ha sido históricamente estudiado en células disociadas enzimáticamente ^{1, 2.} Sin embargo, las células cardiacas son eléctricamente, metabólicamente y mecánicamente acoplados ^{3, 4.} Cuando aislada, los miocitos no son sólo físicamente desacoplado, pero miocitos de las diferentes capas se mezclan durante la disociación ^5. Por otra parte, a pesar de las enormes ventajas que han surgido a partir del estudio de las células aisladas en condiciones de tensión de la abrazadera, ^{6, 7, 8} la naturaleza intrínseca del corazón como un sincitio eléctrica always plantea la cuestión de cómo funcionalmente diferentes son células disociadas de los presentes en el tejido ^3.

En este manuscrito, se describen los avances obtenidos en el conocimiento de la fisiología cardiaca mediante el uso de técnicas de microscopía de campo local de la fluorescencia (LFFM) en el corazón intacto. LFFM utiliza indicadores fluorescentes para medir múltiples variables fisiológicas tales como ^{Ca2 +} citosólico, intra retículo sarcoplásmico (SR) Ca2 ⁺ y el potencial de membrana. Estas mediciones se pueden obtener de forma simultánea y en conjunción con la presión ventricular ^{9, 10,} electrocardiogramas ^9, los potenciales de acción eléctricos (APs), grabaciones de corriente iónica y la fotólisis de destello de compuestos enjaulados ^{4, 11.} Además, estas mediciones pueden obtenerse por estimular el corazón intacto a frecuencias más altas cercar a las tasas fisiológicas. Aunque varios artículos ^{9, 11, 12, 13, 14} han sido publicados por nuestro grupo utilizando técnicas LFFM, la presunción de complejidades técnicas asociadas con esta técnica ha impedido su uso masivo en el estudio de los fenómenos fisiológicos ex vivo en el corazón y otros órganos.

La técnica LFFM (Figura 1) se basa en mediciones de epifluorescencia obtenidos utilizando una fibra óptica multimodo en contacto con el tejido. Como cualquier técnica de imagen de contacto de fluorescencia, la resolución óptica depende del diámetro y la apertura numérica (NA) de la fibra. Un diámetro mayor NA y más pequeño de la fibra aumenta la resolución espacial de las mediciones. AN y diámetros de fibra pueden variar desde 0,22 hasta 0,66 y de 50 micras a 1 mm, respectivamente. Enarrugar la AN mejorar la relación señal a ruido (S / N) mediante la aceptación de los fotones que llegan desde un ángulo sólido más grande. Con el fin de actuar como un dispositivo de epifluorescencia, el haz de luz se enfoca en la fibra óptica con una lente asférica o un objetivo de epifluorescencia en el que el NA de la lente y el partido de la fibra. Esta coincidencia maximiza la transferencia de energía para la excitación y para recoger de nuevo los fotones emitidos por el fluoróforo.

Con el fin de excitar los indicadores fluorescentes exógenos cargados en el tejido, diferentes fuentes de luz y modos de iluminación pueden ser utilizados. Nuestros estudios pioneros de impulsos utilizando el campo local de la microscopía de fluorescencia ^{3, 12} (PLFFM) emplean un láser de bajo costo de picosegundos (Figura 1a, PLFFM). Este tipo de fuente de luz tiene la enorme ventaja de excitar una gran fracción de moléculas de fluoróforo en el marco del área de iluminación y sin blanquear sustancialmente el tinte debidoal impulso corto duraciones ^12. Además, el uso de pulsos ultracortos permitió la evaluación de la vida de la fluorescencia del colorante ^12. El tiempo de vida de fluorescencia es una propiedad que se puede usar para cuantificar la fracción de moléculas de colorante unidas a Ca2 ^+. Desafortunadamente, el jittering temporal de los impulsos y las variaciones de amplitud de pulso a pulso limitar la aplicación de esta estrategia experimental para los casos en que el cambio en la fluorescencia producida por la unión al colorante ligando es grande.

Wave (CW) láseres continuos se utilizan generalmente como la fuente de iluminación principal en LFFM (Figura 1b, CLFFM). El rayo láser puede iluminar de forma continua el tejido o puede ser modulada ferroelectrically. La modulación ferroeléctrico del haz permite la generación de pulsos de microsegundos de la luz. Esta modulación puede ser controlado por hardware externo. Este procedimiento no sólo reduce drásticamente tque jittering temporal de impulsos de luz, sino también permite que los haces de diferentes longitudes de onda de mezclado. La mezcla de vigas se realiza mediante multiplexación rayos de diferentes láseres. Como consecuencia de ello, múltiples colorantes que tienen diferentes propiedades espectrales pueden ser excitados para llevar a cabo las mediciones de una variedad de variables fisiológicas, por ejemplo, Rhod-2 para citosólica ^de Ca2 ^+, MagFluo4 para Ca-intra SR ²⁺ y di-8-ANEPPS para Potencial de membrana.

Aunque los láseres presentan varias ventajas como la fuente de luz en LFFM, otros tipos de fuentes de luz se pueden utilizar incluyendo diodos emisores de luz (LEDs). En este caso, la fuente de luz de excitación consiste en un LED InGaN (Figura 1c, PLEDFM). En LEDs, los fotones son emitidos espontáneamente cuando los electrones de la banda de conducción se recombinan con los agujeros en la banda de valencia. La diferencia con los láseres de estado sólido es que la emisión no es estimulada por otros fotones. Esto resulta en un haz no coherente yuna emisión espectral más amplio para LEDs.

Diferentes tipos de LED de alta potencia pueden ser utilizados. Para grabaciones AP utilizando Di-8-ANEPPS y para el Ca ^{2 +} transitorios registraron usando Fluo-4 o Mag-Fluo-4, se utilizó un LED que tiene un pico de emisión típica en 485 nm (azul) y una anchura media de 20 nm (Figura 1d). Para Ca ^{2 +} transitorios grabados con Rhod-2, el LED tenía un pico de emisión típico a 540 nm (verde) y una anchura media de 35 nm (Figura 1d). LED emiten una longitud de onda en banda y por lo tanto requieren filtros para limitar su emisión espectral. Además, la luz pulsada se puede generar a una velocidad de 1,6 kHz, con una duración de 20 mu s. Los LED se pulsaron con una rápida MOSFET de potencia del transistor de efecto de campo. grabaciones simultáneas con diferentes indicadores pueden ser realizadas por el tiempo de multiplexado de los LEDs. Desafortunadamente, la luz emitida por los LEDs es más difícil de enfocar en una fibra óptica en comparación con un haz láser. Por lo tanto, el principal inconveniente de nosotrosing LEDs es que sus perfiles de emisión tienen desplazamientos angulares (± 15 °) con respecto al eje principal, y una óptica auxiliar se deben utilizar para corregirlo.

En todas las configuraciones ópticas descrito anteriormente, la luz de excitación se refleja con la ayuda de un espejo dicroico. El haz se enfoca posteriormente por una lente asférica y un objetivo de microscopio sobre una fibra óptica multimodo que se coloca sobre el tejido. Como en cualquier disposición de epifluorescencia, el espejo dicroico también sirve para separar la excitación de la luz emitida. El espectro de la luz emitida viaja de nuevo a través de un filtro de barrera para eliminar cualquier excitación reflejada. Por último, la luz emitida es enfocada con un objetivo en un fotodetector (Figura 1).

La transducción de la luz a la corriente eléctrica se realiza mediante fotodiodos de avalancha de silicio. Estos diodos tienen una respuesta rápida y una alta sensibilidad que permite la detección de poca luz. losfotocorriente producida por los fotodiodos de avalancha puede ser amplificada en dos formas: un amplificador de transimpedancia que tiene un elemento de realimentación resistiva (Figura 1e) o por un integrador para convertir la corriente en una tensión (Figura 1f). Usando el primer enfoque, la tensión de salida es proporcional a la fotocorriente y la resistencia de realimentación. Un ejemplo típico de la detección de resistencia de pulsos de láser de picosegundos se muestra en las Figuras 2a, 2b y 2c. Panel 2a ilustra la salida del amplificador de transimpedancia y el panel 2b muestra una expansión en el tiempo del intervalo indicado con un asterisco (*). Un algoritmo de rastreo de picos se llevó a cabo para detectar el pico (rojo) y la base (verde) para las respuestas fluorescentes ^12. La medición de la fluorescencia de base proporciona información tanto de la corriente oscura del fotodiodo de avalancha y las interferencias introducido por lig ambienteht y acoplamiento electromagnético. Una representación de picos y bases se muestra en la Figura 2c. Esta figura ilustra la fluorescencia emitida por el tinte (Rhod-2) unido a Ca ²⁺ durante el ciclo cardíaco de un corazón que late periquito.

En el segundo método, la tensión de salida del integrador es una función de la realimentación de corriente y capacitiva (figuras 2d, 2e, y 2f). Figura 2f muestra dos ciclos consecutivos de integración: el primero sin la iluminación interior y la segunda con pulsos de luz aplicada desde un LED pulsada. Una descripción detallada se presenta en las Figuras 2G y 2H. Este enfoque, aunque más laborioso, proporciona una mayor S / N debido a la ausencia de ruido térmico en el condensador de realimentación. El instrumento incluye una etapa de temporización que genera todo el control y la multiplexación de la luz de excitación y los comandos de la integración cabezal de la platina y reset períodos. Esto se realiza por lo general con un circuito de procesamiento de señal digital que también realiza una diferenciación digital de la señal de salida integrado mediante el cálculo de una regresión en línea de los datos. En el caso de utilizar una realimentación resistiva, cualquier tarjeta de adquisición de A / D se puede utilizar.

Finalmente, nuestra técnica LFFM es muy versátil y puede adaptarse para grabar desde más de una región. La adición de un divisor de haz en el camino de la luz nos permite dividir la luz en dos fibras ópticas. Cada fibra óptica entonces se puede colocar en diferentes regiones de un tejido que, independientemente, excitar y emisión registro de las sondas fluorescentes exógenos. Esta modificación nos permite evaluar la forma anatómica diferencias regionales influyen en las variables fisiológicas. La Figura 3 muestra un divisor de haz que se emplea para dividir la luz de excitación CW tal que dos fibras ópticas se utilizan para medir transmural intracelular eléctrico o [Ca2 ^+] niveles ingenioh menor invasividad. señales transmurales se pueden grabar mediante la colocación de una fibra en el endocardio y el otro en la capa de epicardio de la pared ventricular. Por lo tanto, la técnica LFFM tiene la capacidad de medir la evolución temporal de señales celulares en diferentes regiones y se puede utilizar para probar si los cambios regionales se producen en situaciones patológicas.

Protocolo

Este protocolo y todo el manejo de los ratones fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UC Merced (N ° 2008-201). Los experimentos se llevaron a cabo con periquitos en 1999 de acuerdo con las políticas generales para el uso de animales establecida por la comisión científica del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).

1. Preparación de Langendorff Configurar

1. Preparar la solución de Tyrode que contiene las siguientes concentraciones de soluto en mM: NaCl 140, KCl 5,4, 2 _{CaCl2, MgCl2} 1, 0,33 Na ₂ HPO _4, 10 glucosa, 10 HEPES. Ajustar el pH de la solución de Tyrode a 7,4 con NaOH y filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 micras.
2. Cargar la solución Tyrode en las jeringas 60 ml y todos los tubos de la Langendorff horizontal configuración ^{11, 12} se ilustra en la Figura 4. Asegúrese de eliminar todas las burbujas de aire.
3. Equilibrar solución Tyrode con _O2 al 100% utilizando un "difusor de aire" sumergida plástico como se ilustra en la Figura 4.
   1. Conectar un tubo de plástico a un tanque de _O2.
   2. Añadir un adaptador de soporte de plástico para bajar un "tubo 5 en la solución de Tyrode en la jeringa de 60 ml.
   3. Adjuntar un difusor de aire de plástico para el extremo del tubo de 5 ", de modo O ₂ voluntad burbuja a cabo en la solución de Tyrode.
4. Colocar una sutura quirúrgica no absorbible alrededor de una aguja usada como una cánula. La aguja está acoplado al colector (véase la figura 4) que permite retro-perfusión con soluciones diferentes. Por último, la aorta del corazón se canuló en la aguja.

2. Preparación de los animales y disección del corazón

1. Pesar e inyectar el ratón con heparina (ex. Ratón de peso 20 g, inyectar con 20 unidades o 200 mu l) 15 min antes de la eutanasia por dislocación cervical. Anestesiar periquitos de acuerdo to las guías de uso de los animales de su protocolo de IACUC y luego proceder con la dislocación cervical.
   NOTA: Use las 8 semanas de edad ratones o 20 g periquitos.
2. Retire el corazón de la cavidad torácica después de la eutanasia. Extraer los corazones parakeet exactamente de la misma manera como se describe para los ratones.
   1. Limpiar el pecho del ratón con etanol.
   2. Con unas tijeras de disección, hacer una incisión en la parte inferior del abdomen y luego se corta por los lados hacia el cuello.
   3. Tire hacia atrás el tejido cortado y el pin hacia abajo.
   4. Cortar el diafragma. Tenga cuidado al cortar el diafragma para evitar daños en el corazón.
   5. Retire los pulmones y el tejido circundante.
   6. Use pinzas para sacar el corazón sin apretar. Cortar la aorta el mayor tiempo posible.
3. Transportar el corazón en un pequeño barco sopesar con aproximadamente 1 ml de solución de Tyrode.
4. El uso de una sutura quirúrgica no absorbible, atar la aorta sobre el aparato de Langendorff horizontal a través de unaaguja. Ate la aorta del corazón con la ayuda de dos pinzas finas. Comience retro-perfusión mediante la apertura de la válvula situada en serie con las jeringas de 60 ml que contenían solución Tyrode.
5. Deje que el corazón se estabilice durante 10 min. Utilizar este tiempo para limpiar la sangre y el tejido graso que rodea el corazón antes de cargar el colorante. Tire del tejido graso, cerca de la base del corazón con unas pinzas y cortar el uso de pequeñas tijeras de disección. Asegúrese de hacer esto bajo el punto de vista de un microscopio de disección.

3. citosólica de Ca ^{2 +} Medidas: Preparación del tinte Rhod-2AM

1. Añadir 20 l de la Pluronic 20% (un tensioactivo no iónico) en DMSO a un vial de plástico empaquetado especial proporcionado por el fabricante de colorante que contiene 50 g del colorante.
2. Mezclar pipeteando arriba y hacia abajo, evitando las burbujas.
3. Transferir el DMSO se mezcla con el tensioactivo no iónico y el colorante del vial de plástico empaquetado especial en un vial de vidrio transparente. Añadir 1 ml de Tyrode Solución al vial de vidrio transparente.
4. Someter a ultrasonidos durante 15-20 minutos en un baño de ultrasonido.
5. Perfundir el colorante usando bombas peristálticas durante 30 min a temperatura ambiente.
   1. Coloque el colorante en la cámara de tinte.
   2. Usar una abrazadera mecánica para comprimir todas las otras líneas de tubos conectados al colector. La abrazadera se coloca sobre el colector. Esto evitará cualquier reflujo en el tubo conectado a los 60 jeringas ml.
   3. Encienda la bomba peristáltica de perfusión para comenzar a hacer circular el tinte. cerrar inmediatamente la válvula de 3 vías por debajo de la jeringa de 60 ml.
   4. Coloque un pequeño tubo que está conectado a la bomba peristáltica de succión al lado del corazón para recircular el colorante que se ha perfundido en el corazón.

4. Intra-SR ^{Ca2 +} Medidas: Preparación del tinte Mag-Fluo4AM

1. Preparar Mag-Fluo4AM de la misma manera como Rhod-2AM. Consulte la sección 3 para obtener instrucciones graduales.
2. After de cargar el colorante, abrir la válvula situada en serie con las jeringas de 60 ml que contenían solución Tyrode para comenzar retro-perfusión. Asegúrese de retirar la pinza por encima del colector.
3. Añadir solución de Tyrode a la cámara horizontal y calentar a 37 ° C.
4. Retro-perfuse con solución Tyrode durante 45 minutos para eliminar el tinte citosólica.

5. Membrana medidas de potencial: Preparación del tinte Di-8-ANEPPS

1. Añadir 5 ml de etanol al 99% al vial de tinte que contiene 5 mg del colorante.
2. Alícuota de 10 l en 500 viales de 1 ml de plástico individuales utilizando una pipeta repetidora.
3. Desecar en un vacío de velocidad y se almacena a -20 ° C.
4. Añadir 20 l de 20% de Pluronic en DMSO a un vial de plástico con 10 g del colorante desecado.
5. Mezclar pipeteando arriba y hacia abajo, evitando las burbujas.
6. Transferir la mezcla que contiene DMSO con pluronic y el tinte del vial de plástico a un cilindro graduado (10 ml). Añadir solución de Tyrode a un vo últimolume de 5 ml.
7. Someter a ultrasonidos durante 20-25 minutos en un baño de ultrasonido.
8. Perfundir en el corazón durante 30 minutos usando bombas peristálticas. Consulte las instrucciones paso a paso en la Sección 3.5.

6. Grabación de señales de epicárdicos

1. Después de cargar el colorante, retro-perfundir el corazón con una solución de Tyrode mediante la eliminación de la pinza por encima del colector. Abrir la válvula situada en serie con la jeringa 60 ml que contenía solución de Tyrode. solución Tyrode Retro-perfuse durante 10 minutos para estabilizar el corazón.
2. Llenar la cámara horizontal con solución de Tyrode y encienda la unidad Peltier para llevar la temperatura del baño a 37 ° C.
3. Coloque la fibra óptica en la superficie del corazón.
   1. Coloque la fibra óptica dentro de una pipeta de 2 ml y luego coloque la pipeta a un micromanipulador.
   2. Utilice el micromanipulador para presionar ligeramente la fibra óptica contra la superficie de la LV.
4. Externamente el ritmo de la HEART con un estimulador controlado por un generador de ondas.
   1. Programar el generador de ondas para proporcionar un impulso cuadrado con una anchura de 1 ms.
   2. Ajuste el estimulador para ser sincronizado externamente y conectar la entrada externa al generador de ondas.
   3. Para cada salida del estimulador, conectar un cable con una aguja de acupuntura soldada en el extremo.
   4. Coloque ambas agujas de acupuntura en el vértice del corazón aproximadamente 3 mm uno de otro.
   5. Sólo después de que las agujas se colocan en el tejido, activar la salida del estimulador para evitar descargas eléctricas.
5. En el software de adquisición, ajustar la frecuencia de adquisición a 10 kHz.

7. Grabación de señales de endocárdico

1. Consulte el paso 6.1 y 6.2 para estabilizar el corazón después de cargar el colorante.
2. El uso de un punto de 23Ga agudo sobre el tamaño de la fibra óptica, hacer un pequeño agujero en la superficie del corazón en el ventrículo izquierdo cerca del tabique.
3. coloca un adaptador cirugía sclerotomy intravítrea para ayudar en la colocación de la primera fibra óptica en el endocardio usando un micromanipulador.
4. Externamente el ritmo del corazón. Consulte el paso 6.4.
5. En el software de adquisición, ajustar la frecuencia de adquisición a 10 kHz.

Resultados

AP y Ca ^{2 +} transitorios en el endocardio y el epicardio

Con el fin de comparar las señales a través de la pared ventricular, una fibra óptica está posicionado en el endocardio y el otro en el epicardio. La comparación de la morfología de un AP grabado desde el endocardio con uno desde el epicardio es la mejor manera de evaluar la función transmural. La pared ve...

Discusión

Este documento se centra en la descripción de las técnicas de fluorescencia de campo de la zona para evaluar la función de los miocitos cardíacos ex vivo. El estudio de estas células en un medio ambiente junto no sólo es más fisiológica, pero también es muy adecuado para evaluar patologías a nivel de órganos. Los eventos celulares que subyacen acoplamiento excitación-contracción (ECC) se pueden evaluar en todo el nivel de órganos con el uso de sondas moleculares que controlan la dinámica ^de<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma	7647-14-5
D-(+)-glucose	Sigma	50-99-7
Potassium chloride	Sigma	7447-40-7
HEPES	Sigma	7365-45-9
Sodium phosphate	Sigma	10049-21-5
Calcium chloride solution	Sigma	10043-52-4
Magnesium chloride solution	Sigma	7786-30-3
Sodium hyrdoxide	Sigma	S-8045
0.2 μm nylon membrane filter	Whatman	7402-004
Manifold MPP	Warner	64-0216
21G1.5 Precision glide needle	B-D	305167
Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)	AllMech Tech	LOOK-SP105
Heparin sodium injection 1000USP/mL	AllMech Tech	NDC63323-540-11
DMSO D8779	Sigma	67-68-5
Blebbistatin	Sigma	856925-71-8
Pluronic F-127 20% solution	Biotium	59004
Materflex C/L peristaltic pump	Cole-Parmer	77122-26
Isostim stimulator	World Precision Instruments	A320RC
Waveform generator	Teledyne Lecroy	WaveStation 2012
Ultrasonic cleaner FS20	Fisher Scientific	1533530
Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32"	Component Supply	TET-031A
Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32"	Component Supply	TET-094A
Adapter luer lock to 3-way valve	Cole-Parmer	EW-31200-80
Tee adapters and plastic fittings	Cole-Parmer	6365-90
Plastic clamp	WaterZoo	2465
Peltier	TE Technology	TE-127-2.0-2.5
Rhod-2AM	ThermoFisher Scientific	R1245MP
Di-8-ANEPPS	ThermoFisher Scientific	D3167
Mag-Fluo-4AM	ThermoFisher Scientific	M14206
Acupunture needles	LHASA	TC1.20x13
60 mL BD syringe with luer-lok	Fisher Scientific	14-820-11
LabView	National Instruments
Speed vacuum Eppendorf Vagufuge	Fisher Scientific	07-748-13
Digital signal processing circuit DSP TMS 320	Texas Instrument
Longpass Dichroic mirror 567 nm	ThorLabs	DMLP567L
Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective	Edmund Optics	Stock# 33-437
Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective	Edmund Optics	Stock# 33-438
Longpass colored glass filter 590 nm	ThorLabs	FGL590
Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW
Micromanipulator for laser	Siskiyou	MX130R
Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39	ThorLabs	FT200UMT
LEDs blue	Lumileds	L135-B475003500000
LEDs green	Lumileds	L135-G525003500000
Cube beam splitter, non-polarizing	ThorLabs	BS007
36" Length, Dovetail Optical Rail	Edmund Optics	54-402
2.5" Width, Dovetail Carrier	Edmund Optics	54-404
0.75" Travel, micrometer stage	Edmund Optics	37-983
Dovetail optical rail 3"	ThorLabs	RLA075/M
Dovetail rail carrier 1"	ThorLabs	RC1
Avalanche photodiode Helix 902	Digi-Key	HELIX-902-200
Objective holder XY Translator	ThorLabs	ST1XY-S
Aluminum breadboard 6" x 6"	ThorLabs	MB6
Nexus otpical table 4' x 6'	ThorLabs	T46HK
Stainless steel cap screws	ThorLabs	HW-KIT5/M
Acrylic  sheet	Home Depot/Lowes
Sylgard Silicone elastomer kit	Dow Corning	Sylgard 184
Epoxy gel	Walmart/Home Depot	2-part 5 min clr 1oz
21G1.5 Precision glide needle	B-D	305167
23G Precision glide needle	B-D	305145
Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm	ThorLabs	BA1/M
Wire shelve posts 36"	Alera	AALESW59PO36SR
Wire shelves	Alera	ALESW582424SR
Post and angle clamp	ThorLabs	SWC/M-P5
Glass syringe for dye chamber	Wheaton	W851020
Rubber stopper	Home Science Tools	CE-STOP01C