3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

Resumen

Condrogénesis de células madre requiere un ajuste fino de las condiciones de cultivo. A continuación, presentamos un enfoque magnético para la condensación de las células, un paso esencial para iniciar la condrogénesis. Además, mostramos que la maduración dinámica en un biorreactor se aplica estimulación mecánica a las construcciones celulares y mejora la producción de la matriz extracelular cartilaginosa.

Resumen

Ingeniería de cartílago sigue siendo un desafío debido a las dificultades en la creación de un implante funcional in vitro similar al tejido nativo. Un enfoque poco explorado para el desarrollo de reemplazos autólogas implica la diferenciación de células madre en condrocitos. Para iniciar este condrogénesis, un grado de compactación de las células madre se requiere; por lo tanto, hemos demostrado la viabilidad de las células magnéticamente de condensación, tanto dentro de los andamios de espesor y libre de andamio, utilizando fuentes de campo magnético miniaturizados como atractores de células. Este enfoque magnético también se utiliza para guiar fusión agregada y para construir libre de andamio, organizado, en tres dimensiones (3D) tejidos de varios milímetros de tamaño. Además de tener un tamaño mejorada, el tejido formado por la fusión magnético impulsado presentó un aumento significativo en la expresión de colágeno II, y se observó una tendencia similar para la expresión de agrecano. A medida que el cartílago nativo fue sometido a fuerzas tsombrero influenciado su estructura en 3D, también se llevó a cabo la maduración dinámica. Un biorreactor que proporciona estímulos mecánicos se utilizó para la cultura de los andamios magnéticamente sembradas durante un período de 21 días. maduración Bioreactor mejoró en gran medida la condrogénesis en los armazones cellularized; la matriz extracelular obtenido bajo estas condiciones era rico en colágeno II y agrecano. Este trabajo describe el potencial innovador de condensación magnética de las células madre etiquetados y maduración dinámica en un biorreactor para mejorar la diferenciación condrogénica, tanto andamios de polisacárido libre de andamio y dentro.

Introducción

Las nanopartículas magnéticas se utilizan ya en la clínica como agentes de contraste para formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), y sus aplicaciones terapéuticas mantienen en expansión. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado que las células marcadas pueden ser manipuladas in vivo utilizando un campo magnético externo y pueden ser dirigidas y / o mantenidas en un sitio definido de implantación ^{1, 2, 3.} En la medicina regenerativa, que pueden ser utilizados para diseñar tejidos organizados in vitro ^4, incluyendo el tejido vascular ^{5, 6, 7, 8} de hueso y cartílago ^9.

El cartílago articular está inmerso en un entorno avascular, hacer reparaciones de los componentes de la matriz extracelular muy limitados cuando se producen daños. Por esta razón, research se centra actualmente en la ingeniería de sustitutos cartílago hialino que se pueden implantar en el sitio del defecto. Con el fin de producir un reemplazo autólogo, algunos grupos de investigación están explorando el uso de condrocitos autólogos como una fuente de células ^{10, 11,} mientras que otros hacen hincapié en la capacidad de las células madre mesenquimales (MSC) para diferenciarse en condrocitos ^{12, 13.} En estudios anteriores aquí se ha resumido, se seleccionaron MSC, ya que su toma de muestras de médula ósea es bastante sencillo y no requiere el sacrificio de los condrocitos sanos, que corren el riesgo de perder su fenotipo ^14.

Un primer paso esencial para iniciar la diferenciación condrogénica de las células madre es su condensación. Los agregados celulares se forman comúnmente usando centrifugación o cultivo en micromasa ^15; sin embargo, estos métodos de condensación neither presentar el potencial de crear grupos de células dentro de los andamios de espesor ni el potencial de controlar la fusión de agregados. En este trabajo se describe un enfoque innovador para condensar las células madre utilizando MSC marcaje magnético y la atracción magnética. Esta técnica se ha demostrado para formar constructos 3D libre de andamio a través de la fusión de los agregados entre sí para obtener un tejido cartilaginoso a escala milimétrica ^9. siembra magnética de andamios gruesas y grandes también ha permitido la posibilidad de aumentar el tamaño de la ingeniería tisular, el diseño de una forma más fácilmente útil para la implantación, y diversificar el potencial para aplicaciones clínicas en la reparación del cartílago. Aquí, nos detalle el protocolo para la siembra magnético de MSC en andamios porosos compuestas de polisacáridos naturales, pululano y dextrano, andamios utilizado anteriormente para confinar las células madre ^{16, 17.} diferenciación condrogénica era finally lleva a cabo en un biorreactor para asegurar continuos de los nutrientes y la difusión de gas en el núcleo de matriz de los andamios sembradas con una alta densidad de células. Además de proporcionar nutrientes, factores de crecimiento condrogénicas, y gas a las células, el biorreactor ofreció la estimulación mecánica. En general, la tecnología magnética se utiliza para confinar las células madre, combinado con la maduración dinámica en un biorreactor, puede mejorar notablemente la diferenciación condrogénica.

Protocolo

1. Construcción de los dispositivos magnéticos

NOTA: Los dispositivos utilizados para la siembra de células varían dependiendo de la aplicación (Figura 1). Para formar agregados, el número de células está limitado a 2,5 × 10 ⁵ / agregado, por lo que las puntas magnéticas deben ser muy delgada (750 micras de diámetro). Para sembrar los andamios de 1,8 cm ^2/7 mm de espesor, los imanes deben ser más grande (3 mm de diámetro) y se asegurará de la migración de células a través de los poros de la andamio.

1. Construcción de un dispositivo con micro-imanes para la formación de agregados (Figura 1A)
   1. Hacer micro-orificios con una broca de 0,8 mm a través de placas de aluminio (3 cm de diámetro y 6 mm de espesor).
   2. Inserte una punta magnética (750 m de diámetro) en cada orificio de la placa.
   3. Coloca este disco en un imán de neodimio permanente, lo que asegura la magnetización a la saturación.
2. Construcción de un dispositivo para la siembra andamio ( Figura 1B)
   1. Cortar poliestireno duro en 2,4 cm ² casillas.
   2. Inserción 9 imanes pequeños (3 mm de diámetro, 6 mm de largo) a la misma distancia sobre un área superficial de 1,6 cm ^_2.
   3. Colocar este dispositivo a través de un imán de neodimio permanente.

Etiquetado Cell 2. Stem

NOTA: células madre fueron etiquetados con nanopartículas magnéticas 0,1 mM durante 30 min (2,6 ± 0,2 pg de hierro / célula) para formar agregados, mientras que se marcaron con nanopartículas magnéticas 0,2 mM durante 30 minutos (5 ± 0,4 pg de hierro / célula) a la semilla andamios. Estas concentraciones de nanopartículas y tiempos de incubación se han utilizado anteriormente y publicado para MSC y otras células ^{18, 19,} y se ha determinado que las nanopartículas afectados ni la viabilidad celular ni capacidad de diferenciación MSC. La masa de hierro incorporada por las células madre se midió a través de un solo cell magnetoforesis ^{19, 20.}

1. Células de cultivo humanos madre mesenquimales (MSC) en medio de crecimiento de células madre mesenquimales completa (MSCGM) a 37 ° C y 5% de CO ₂ hasta cerca de la confluencia (~ 90%).
2. Preparar la solución de marcaje magnético mediante la mezcla de 0,1 o 0,2 mM maghemita óxido de hierro citrato recubierto (γFe ₂ O _3; núcleo: 8 nm de diámetro) en medio 5A de McCoy exento de suero modificado en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) sin glutamina y que contiene 5 citrato de sodio mM.
3. Desechar el medio, lavar las células con medio RPMI libre de suero sin glutamina, y añadir 10 ml de disolución de nanopartículas de hierro óxido por 150 cm ² frasco de cultivo, el volumen mínimo requerido para cubrir todas las células.
4. Incubar durante 30 min a 37 ° C y CO ₂ al 5% y luego desechar la solución de nanopartículas. Enjuague durante 5 min con medio RPMI libre de suero sin glutamina para internalizar el nanoparticles todavía unido a la membrana plasmática.
5. Descartar el medio RPMI y añadir 25 ml de medio MSCGM completa por matraz. Incubar durante la noche a 37 ° C y 5% de _CO2.

3. La siembra de células magnéticas

1. Recién preparar el medio condrogénica usando medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) alto contenido de glucosa con L-glutamina mediante la adición de 50? M de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 0,1 M de dexametasona, piruvato de sodio 1 mM, 0,35 mM de L-prolina, cultura universal 1% suplemento que contiene insulina, transferrina humana y ácido selenioso (ITS-Premix), y 10 ng / mL factor de crecimiento transformante beta 3 (TGF-β3).
2. Desprender las células magnéticas utilizando 8 ml de 0,05% de tripsina-EDTA por 150 cm ² matraz de cultivo y centrifugar las células disociadas a 260 x g durante 5 min. Aspirar el medio y contar las células resuspendidas.
3. Coloque un plato Petri de cultivo celular con fondo de vidrio (35 mm) en la parte superior de ambos dispositivos magnéticos.
4. para magnetically formar agregados, añadir 3 ml de medio de condrogénica a la placa de Petri y suavemente depositar el volumen más pequeño posible (no más de 8 l) que contiene 2,5 × 10 ⁵ células marcadas por agregado (hasta 16 agregados puede ser depositado). Deja la placa de Petri durante 20-30 min sin moverlo, permitiendo que se forman esferoides, y luego colocar el dispositivo completo, incluyendo la placa de Petri que contiene los 16 agregados, en la incubadora a 37 ° C y 5% de _CO2.
5. agregados control de formulario siguiendo el mismo protocolo y reemplazar el medio completo con medio condrogénica sin TGF-β3.
   1. Para generar el constructo agregado 3D, coloque 2 agregados en contacto en el día 8 para formar 8 dobletes e iniciar la fusión. En el día 11, combinar 2 dobletes para formar 4 cuatrillizos. Por último, fusionar las 4 cuatrillizos en el día 15 para obtener la estructura final.
   2. Al mismo tiempo, formar agregados por centrifugación 2,5 × 10 ⁵ células madre marcaron en los 26015; g durante 5 min en 15 mL tubos con 1,5 ml de medio de condrogénica con o sin TGF-β3 (para la muestra y el control, respectivamente).
6. Para magnéticamente andamios de semillas, colocar cada andamio se secó en una placa de Petri. Utilice polisacáridos andamios porosos hechos de pululano / dextrano ^21. Para cada andamio, diluir 2 × 10 ⁶ células madre marcadas en 350 l de medio de condrogénica sin TGF-β3 y cuidadosamente pipetear las células sobre el andamio.
   1. Incubar durante 5 min a 37 ° C para permitir la penetración de células completo dentro del andamio y luego agregar suavemente 3 ml de medio de condrogénica con o sin TGF-β3 (para la muestra o control, respectivamente) para la placa de Petri.
   2. Incubar el andamio cellularized en su dispositivo magnético a 37 ° C y 5% de _CO2 durante 4 días para permitir la migración celular a través de los poros de andamio y confinamiento.
7. Al mismo tiempo, la semilla de andamios con 2 × 10 ⁶ células madre etiquetados siguiendo el mismo método y se incuba sin el imán para obtener andamios uniformemente cabezas de serie como controles positivos.

4. La diferenciación en condrocitos

NOTA: Después de 4 días de incubación, retirar los imanes y continuar la maduración condrogénica ya sea en una placa de Petri (condiciones estáticas) o en un biorreactor (condiciones dinámicas). muestras de control negativas se maduraron en condiciones estáticas con medio condrogénica sin TGF-β3.

1. En condiciones estáticas, mantener a los andamios cellularized o agregados en la misma placa de Petri. Cambiar el medio condrogénica dos veces por semana durante 21 días.
2. En condiciones dinámicas, preparar el biorreactor.
   1. Cortar tubo de silicona a la longitud apropiada de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   2. Autoclave todos los materiales: 500-ml cámara de cultivo, la tubería, de 2 vías volteadoras, y jaulas.
   3. Colocar las piezas de biorreactor en un microbio estérilestación de seguridad lógica. Conecte el tubo a las 2 vías rotadores y de la cámara de cultivo siguiendo las instrucciones del fabricante.
   4. transferir con cuidado los andamios cellularized en jaulas esterilizadas utilizando una espátula estéril. Coloque 2 andamios por jaula. Cuando las jaulas están listos, insertarlos en las agujas de la tapa para evitar que se muevan durante la rotación adicional. Llenar la cámara de cultivo con medio condrogénica y cerrarla con la tapa que contiene las jaulas.
3. A su vez en la bomba peristáltica para llenar el tubo con medio condrogénico y para eliminar las burbujas de aire.
4. Coloque y asegure la cámara llena en el motor del biorreactor y encienda el ordenador, que controla las rotaciones tanto del brazo y de la cámara.
5. Aplicar una velocidad de rotación de 5 revoluciones por min (rpm) en el brazo y la cámara. Ajuste de la bomba peristáltica a un caudal de 10 rpm para la alimentación continua de los andamios cellularized.

5. Extracción de ARN y análisis de expresión génica

NOTA: Antes de la extracción de ARN, a digerir los andamios con una solución enzimática.

1. Preparar 1 ml de solución enzimática mediante la adición de 100 l de pululanasa (40 U / ml) y 50 l de dextranasa (60 mg / ml) a 850 ml de medio DMEM libre de suero.
2. Enjuague los andamios dos veces con medio DMEM libre de suero, desechar el medio, y añadir 800 l de la solución enzimática por andamio. Incubar durante 15-30 min a 37 ° C bajo agitación suave.
3. Cuando el andamio está completamente disuelto, la transferencia de la solución que contiene las células a un tubo de 1,5 ml, centrifugar a 300 xg durante 10 min, aspirar cuidadosamente el medio, lavar dos veces con solución salina estéril 1 × tamponada con fosfato (PBS), centrifugar a 300 × g durante 10 min, y volver a suspender las células en la solución de aislamiento de ARN.
4. Para extraer el ARN a partir de los agregados, coloque los esferoides en la solución de aislamiento de ARN yaplastarlos completamente utilizando un homogeneizador antes de realizar la extracción de RNA.
5. Aislar el RNA utilizando un kit para la extracción de ARN total de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
6. Sintetizar ADN complementaria a partir de 400 ng de ARN total usando la transcriptasa inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando 250-ng cebadores aleatorios, 1 l de mezcla de dNTP (10 mM cada uno), y 40 U / ml de RNasa inhibidor; el volumen final de reacción es de 20 l. Al final de la reacción, añadir 80 l de agua destilada para obtener un volumen final de 100! L.
7. Para la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (PCR), utilizar una mezcla de PCR que contiene un reactivo fluorescente para cuantificar la expresión relativa de los genes de interés, tales como agrecano (AGC) y el colágeno II (Col II), con 10 × cDNA diluido. Normalizar los niveles de expresión génica con la proteína ribosómica gen de referencia, Grande, P0 (RPLP0). Realizar los cálculos con el 2 ^- fórmula ^ΔΔCT, Donde ΔΔCT =? Ct de la condición diferenciada - significa? Ct de condición de control, y cada uno? Ct representa el CT del gen de interés - la CT del gen de referencia (RPLP0).
8. Determinar mediciones estadísticas como los valores medios ± el error estándar de la media (SEM). Efectuar el análisis con n ≥ 2 experimentos independientes. Utilice la prueba t de Student para analizar las diferencias estadísticas entre los gránulos centrifugó y fusiones magnéticos (* p <0,05). Determinar la significación con una prueba de Kruskal-Wallis (ANOVA de una vía no paramétrico) para analizar las diferencias estadísticas entre los andamios diferenciados y con el andamio de control (* p <0,05).

6. Análisis histológico

1. Enjuague los andamios cellularized o agregados con estéril 1 × PBS, fijarlos en solución de formalina al 10% durante 1 h a temperatura ambiente, y enjuague con 1 × PBS.
2. Retire el PBS, incrustar las muestras en cuttin óptimag compuesto temperatura (OCT), y congelarlos en un baño de isopentano sumergido en nitrógeno líquido. Almacenar la muestra a -20 ° C. Cortar las muestras con un criostato para obtener criosecciones de 8 micras para los agregados o 12-m para los andamios cellularized.
3. Tinción de las secciones criogénicas con solución de azul de toluidina al 0,5% durante 2 minutos, enjuague con agua del grifo, deshidratar con etanol al 100%, aclarar con tolueno, y montar los portaobjetos con un medio de montaje para microscopía de luz.

Resultados

En primer lugar, los agregados se pueden formar individualmente utilizando micro-imanes depositando 2,5 × 10 ⁵ células madre marcadas (Figura 2A). Estos agregados individuales (~ 0,8 mm de tamaño) pueden entonces ser fusionados en estructuras más grandes gracias a la fusión secuencial, inducida magnéticamente. Por ejemplo, en el día 8 de la maduración condrogénica, los agregados se colocaron en contacto en pares para formar dobletes; cuadrúpedos se e...

Discusión

En primer lugar, porque las técnicas que aquí se presentan se basan en la internalización de nanopartículas magnéticas, una cuestión importante es el resultado de las nanopartículas una vez que se localizan dentro de las células. Es cierto que las nanopartículas de hierro pueden desencadenar toxicidad potencial o alteración de la capacidad de diferenciación en función de su tamaño, de revestimiento, y tiempo de exposición ^{19, 22.} Sin embargo, vario...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3)	PHENIX - University Paris 6	Made and given by C. Ménager	Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge
Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds	LIOAD - University Nantes	Made and given by C. Le Visage	Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2.
TisXell Regeneration System	QuinXell Technologies	QX900-002	Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber
Cage for scaffolds: Histosette II M492	VWR	720-0909
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501	Three independant batches have been used
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL)	Life Technologies	15140-122
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
Sodium pyruvate solution 100 mM	Sigma	S8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C
TGF-beta 3 protein 10 µg	Interchim	30R-AT028
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Dextranase from Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
NucleoSpin RNA Extraction Kit	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Reverse Transcriptase	Life Technologies	18064-014
Random Primer - Hexamer	Promega	C1181	500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample
Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor	Promega	N2511	40 U/µL: put 1 µL per sample
PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix	Life Technologies	4368708
Step One Plus Real-Time PCR System	Life Technologies	4381792
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
OCT solution	VWR	361603E
Isopentane	Sigma	M32631
Toluidine blue O	VWR	1.15930.0025
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Toluene	VWR	1.08323.1000
Mounting medium Pertex	Histolab	840
RPLP0 Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'
Aggrecan Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'
Collagen II Primer for qPCR	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'