RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano

Resumen

Aquí, presentamos un enfoque combinatorio para clasificar los tipos de células neuronales antes del aislamiento y para la posterior caracterización de los transcriptomas de una sola célula. Este protocolo optimiza la preparación de muestras para el éxito de secuenciación de ARN (RNA-Seq) y describe una metodología diseñada específicamente para la mejora de la comprensión de la diversidad celular.

Resumen

El descubrimiento de los marcadores específicos de tipo celular puede proporcionar una visión de la función celular y los orígenes de la heterogeneidad celular. Con un impulso reciente para la comprensión mejorada de la diversidad neuronal, es importante identificar genes cuya expresión define varias subpoblaciones de células. La retina sirve como un excelente modelo para el estudio de la diversidad del sistema nervioso central, ya que está compuesto de múltiples tipos de células principales. El estudio de cada clase principal de células ha producido marcadores genéticos que facilitan la identificación de estas poblaciones. Sin embargo, existen múltiples subtipos de células dentro de cada una de estas clases principales de células retinianas, y pocos de estos subtipos tienen marcadores genéticos conocidos, aunque muchos se han caracterizado por morfología o función. Un conocimiento de los marcadores genéticos para los subtipos individuales de la retina permitiría el estudio y la asignación de los objetivos cerebrales relacionados con funciones visuales específicas y también puede aportar una visión de las redes de genes queMantener la diversidad celular. Las vías actuales utilizadas para identificar los marcadores genéticos de subtipos poseen inconvenientes, como la clasificación de los tipos de células después de la secuenciación. Esto representa un desafío para el análisis de datos y requiere métodos de validación rigurosos para asegurar que los clústeres contengan células de la misma función. Proponemos una técnica para la identificación de la morfología y la funcionalidad de una célula antes de aislamiento y secuenciación, lo que permitirá la identificación más fácil de subtipo específico de marcadores. Esta técnica puede extenderse a tipos de células no neuronales, así como a poblaciones raras de células con variaciones menores. Este protocolo proporciona datos de excelente calidad, ya que muchas de las bibliotecas han proporcionado profundidades de lectura superiores a 20 millones de lecturas para celdas individuales. Esta metodología supera muchos de los obstáculos presentados por Single-cell RNA-Seq y puede ser adecuado para los investigadores con el objetivo de perfil de tipos de células de una manera directa y altamente eficiente.

Introducción

La diversidad neuronal se observa en todo el sistema nervioso central, particularmente en la retina vertebrada, un tejido altamente especializado que consta de 1 tipo glial y 6 tipos de células neuronales que surgen de una población de células progenitoras de la retina ^{1 , 2 , 3} . Muchos subtipos de células se pueden clasificar funcionalmente, morfológicamente y genéticamente. El objetivo de este protocolo es vincular la variabilidad genética de los tipos de células con sus características funcionales y / o morfológicas identificables. Se han identificado varios genes para la clasificación de las células, pero muchos subtipos continúan no caracterizados, ya que representan una pequeña fracción de la población total. La identificación de genes dentro de estos subtipos específicos permitirá una mayor comprensión de la diversidad neuronal dentro de la retina y también puede arrojar luz sobre la diversificación de las células neuronales en otros lugares. FuAdemás, los estudios monocelulares permiten descubrir nuevos tipos de células, que pueden haber sido pasadas por alto debido a su baja representación entre la población total ^{4 , 5 , 6 , 7} .

Uno de los beneficios de la transcriptómica monocelular es que se pueden descubrir marcadores únicos o combinaciones de marcadores que definen un subtipo celular particular. Estos pueden ser utilizados para obtener acceso genético a ese tipo de célula para diferentes manipulaciones. Por ejemplo, estamos utilizando este protocolo para caracterizar los genes específicos del tipo celular de un subconjunto de células ganglionares de la retina que expresan el fotopigmento melanopsina. El uso de un marcador fluorescente en la melanopsina que expresan las células ganglionares de la retina permite el estudio de estas células, ya que se agrupan juntos debido a su expresión de un gen conocido. Curiosamente, hay cinco subtipos conocidos de esta célula popuEn la retina del ratón ⁸ . Por lo tanto, con el fin de aislar el ARN de las células de cada tipo, hemos utilizado clasificaciones morfológicas establecidas dentro del modelo transgénico para identificar cada subtipo antes del aislamiento celular. Esta técnica permite la caracterización de las células, así como para su aislamiento directamente de la retina, sin necesidad de disociación de los tejidos, lo que puede causar una respuesta al estrés dentro de las células y la contaminación debida a las dendritas cortadas [ ^9] .

Una multitud de nuevas técnicas han salido a la luz en los últimos años como el método de RNA-Seq continúa desarrollándose. Estas herramientas permiten maximizar la adquisición de células y una mayor eficiencia de costos al abordar la cuestión en cuestión ^{4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13} . Sin embargo, mientrasEstas técnicas han sido excelentes pasos, hay una serie de obstáculos todavía se encuentran que este protocolo es capaz de abordar. En primer lugar, muchos de los procedimientos actuales aislar las células de tejido disociado y tratar de utilizar ya sea el análisis de componentes principales o agrupación jerárquica post-hoc para determinar la clasificación de células. Basarse en estas herramientas para clasificar subtipos no puede producir resultados confiables y puede forzar a uno a encontrar nuevas formas de validar estos datos para la correlación de un marcador genético con un tipo de célula funcional. El requisito de disociación en otros protocolos puede a veces resultar en daño tisular y puede provocar que los procesos neuronales sean cortados, dando como resultado una pérdida potencial de mRNA. Además, en las preparaciones de células disociadas, las respuestas de estrés pueden comenzar a afectar a los transcriptomas de estas células [ ^14] . Este protocolo supera estos desafíos mediante la determinación del tipo de célula funcional antes del aislamiento, y mantiene mejor la hLa salud de las células, manteniendo el tejido retiniano intacto.

Una técnica se introdujo en 2014 y consistió en el análisis in vivo del transcriptoma de células vivas [ ^15] . Aunque esta técnica permite el examen del transcriptoma con una interrupción mecánica mínima del tejido, carece de la capacidad de clasificar tipos de células específicas dentro del tejido antes de examinar sus transcriptomas sin usar un ratón reportero muy específico. Nuestro protocolo no requiere un reportero específico, ya que utilizamos el relleno celular y la electrofisiología para caracterizar las células antes de su aislamiento. Otra limitación de este protocolo anterior es que requiere una longitud de onda específica para excitar el elemento fotoactivable, mientras que nuestro protocolo permite el uso de un reportero fluorescente y un colorante fluorescente, que están fácilmente disponibles o pueden ser seleccionados individualmente por cada laboratorio. Sin embargo, otros laboratorios se han casado con los dos métodos de electrFisiología y transcriptómica para el estudio de la diversidad celular. El uso de grabaciones de patch-clamp para caracterizar la función de una célula antes de su aislamiento se ha realizado en neuronas disociadas ¹⁶ y, en algunos casos, ha precedido al uso de análisis de microarrays ¹⁷ para estos estudios. Las mismas complicaciones son encontradas por estos enfoques, ya que requieren la disociación de tejidos o el uso de la tecnología de microarrays, que se basa en la hibridación de las muestras a las sondas disponibles. Uno de los avances más recientes ha sido el desarrollo de Patch-Seq, una técnica que combina el uso de grabaciones de patch-clamp y la tecnología RNA-Seq para entender las células de las rodajas del cerebro entero [ ^18] . Si bien esta técnica tiene sus similitudes con el protocolo presentado aquí, es importante recordar que nuestro enfoque permite que el tejido permanezca intacto para la salud de las células. Aquí, presentamos un protocolo para el optimizatDe esta alianza, que genera bibliotecas de una sola célula de alta calidad para el uso de RNA-Seq para obtener una alta profundidad de lectura y cobertura de mapeo.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad Northwestern.

1. Preparación de soluciones para electrofisiología (4 h)

1. Hacer 0,1% de H2O tratada con DEPC añadiendo 1 mL de pirocarbonato de dietilo (DEPC) a 999 mL de H2O purificada por ósmosis inversa. Mezclar bien y dejar que la mezcla se incube durante 1 h a temperatura ambiente (RT). Después, autoclave el H ₂ O mezclado con DEPC durante 15 min en un ciclo de líquido. Dejar enfriar la H ₂ O tratada con DEPC a TA.
2. Hacer la solución extracelular mezclando una botella de medio de Ames y 1,9 g (23 mM) de bicarbonato de sodio en 1 L de H2O. Burbujear la solución extracelular con
   95% de O ₂ /5% de CO ₂ y mantenerlo a un pH de 7,3-7,4.
3. Generar la solución intracelular mediante la combinación de 125 mM K-gluconato, 2 mM MgCl ₂ , 10 mM EGTA, 10 mM HEPES, y 0,1% de DEPC tratados con H₂ O. Almacenar en alícuotas de 1 mL a -20 ° C. Añadir 10 μM de trazador fluorescente al comienzo de cada experimento.
4. Haga la solución enzimática añadiendo 10.000 unidades de colagenasa y 83 mg de hialuronidasa a 4.15 ml de solución extracelular. La solución enzimática debe almacenarse en alícuotas de 50 μL a -20 ° C.

2. Preparación del tejido retiniano (2 h)

NOTA: Todos los procedimientos en esta sección deben realizarse bajo iluminación roja tenue

1. Oscurecer los animales durante al menos 1 h antes de la disección. Realice todos los procedimientos bajo iluminación de color rojo tenue.
2. Eutanasiar a los animales mediante asfixia con CO ₂ y enuclear los globos oculares en una placa de Petri con una solución extracelular previamente oxigenada.
3. Empujar la córnea con una aguja y cortarla cortando con tijeras oftálmicas en el borde de la córnea y esclerótica ¹⁹ .
4. Retire la lente utilizandoPinzas # 5. Gentilmente hacer un desgarro en la esclerótica con la pinza y cortar el nervio óptico donde la retina y esclerótica se encuentran. Termine con cuidado la eliminación de la esclerótica de la retina.
5. Retire el vítreo transparente con pinzas # 5; Una vez eliminado, el vítreo aparece como una sustancia gelatinosa pegada a la pinza. Cortar las retinas por la mitad (de manera que haya 4 piezas / animal) y almacenarlos en solución extracelular oxigenada a RT hasta su uso.
6. Cuando esté listo para montar el tejido en la cámara de registro, coloque una pieza de retina para incubar en solución enzimática diluida en 500 μl de solución extracelular oxigenada. Incubar en una placa de Petri durante 2 minutos a RT en un agitador.
   1. Lave la pieza de retina en solución extracelular oxigenada y coloque el tejido en una cámara de registro de fondo de vidrio; Utilice una pipeta de transferencia de plástico con la punta cortada para permitir que la retina se transfiera sin causar daño al tejido.
7. Usar paraCeps para aplanar cuidadosamente el tejido con la capa del fotorreceptor hacia abajo. Retire el exceso de líquido con una pipeta. Ancle el tejido usando un anillo de platino con malla de nylon.
   NOTA: Este método también podría usarse para preparar el tejido para el aislamiento de ARN de amacrina marcada y células bipolares.
8. Llenar la cámara con solución extracelular oxigenada y montarla en un microscopio. Perfunda el tejido con una solución extracelular oxigenada a 2-4 ml / min.

3. Visualización y selección de GFP + Células de ganglio retiniano (10 min)

NOTA: Todos los procedimientos en esta sección deben realizarse bajo iluminación roja tenue

1. Antes de comenzar, tire de las micropipetas de cristal (OD: 1,2 mm, ID: 0,69 mm) para grabaciones electrofisiológicas utilizando un extractor de micropipeta. Utilice el siguiente protocolo para los electrodos (tenga en cuenta que los parámetros deben ajustarse en consecuencia para lograr la resistencia deseada yVarían entre tiradores y con diferentes vidrios): Calor: Rampa +10; Pull: 0; Vel: 23; Retardo: 1; Presión: 500; Bucle del programa: 5 veces. Asegúrese de que las puntas tengan un diámetro de ~ 1 μm, con resistencias de 2-4 MΩ para la orientación de células grandes y de 5-7 MΩ para dirigir células más pequeñas.
2. Observe la capa de células ganglionares utilizando la óptica de contraste de interferencia diferencial infrarrojo (IR-DIC) ( Figura 1A ). Identificar GFP + células de ganglio de la retina (RGCs) utilizando epifluorescencia (~ 480 nm) ( Figura 1B ].
3. Localice la pipeta llena con solución intracelular en DIC. Aplique una ligera presión positiva y cero cualquier compensación de tensión en el amplificador.
4. Presione la micropipeta de vidrio contra una célula GFP + y aplique presión negativa para formar un sello GΩ entre la pipeta y la membrana celular. Aplique pasos de prueba de tensión ( por ejemplo, 5 mV) para controlar la resistencia del sello. Después de formar un sellado estable, rompa la membrana aplicando breves pulsos de nPresión negativa para obtener acceso a toda la célula.
5. Espere 1-2 min para que las dendritas de la célula se llenen con trazador fluorescente.
   NOTA: La célula puede ser tipificada morfológicamente examinando la morfología en epifluorescencia ( Figura 1C ). En el caso de RGCs que expresan melanopsina, la estratificación dendrítica en la capa plexiforme interna se visualiza examinando las dendritas llenas de trazador fluorescente bajo iluminación epifluorescente y determinando si se estratifican lejos del soma en la sublamina OFF (M1 ipRGCs), cerca del ganglio Capa celular en el ON sublamina (M2 y M4 ipRGCs), o ambos (M3 ipRGCs). Esta observación, combinada con el tamaño del soma (M4s tienen somas claramente grandes en comparación con todos los otros subtipos ipRGC), permiten la identificación del tipo de célula ^{20 , 21 , 22} . Por lo tanto, esta técnica permite la identificación del tipo de célula in vitro antes de ARN isoLación. Este método podría modificarse para otros protocolos de identificación de tipo celular que implican ya sea morfología dendrítica o fisiología celular.

4. Aislamiento celular (2 min)

1. Antes de comenzar, coloque la microcentrífuga de sobremesa en 2.000 x g. Prepare un aparato de expulsión de muestras conectando la tubería (OD: 3/32 in, ID: 1/32 in) con una jeringa de 1 cc.
2. Coloque tubos de PCR de 0,2 ml que contengan 10 μl de tampón de lisis y 1% de β-mercaptoetanol sobre hielo. Prepare una jeringa de 1 cc que contenga H2O tratada con DEPC para enjuagar las puntas de la pipeta. Preparar un recipiente de hielo seco para congelar el tampón de lisis después de la recolección de la muestra.
3. Extraiga cuidadosamente el contenido citoplásmico de la pipeta celular aplicando presión negativa usando una jeringa de 10 ml; Todo el contenido citoplásmico, incluyendo orgánulos, debe ser extraído si es posible.
   1. Monitorear la extracción en DIC visualizando el cuerpo celular disminuyendo en tamaño. Después de extraer El contenido citoplasmático, levante la pipeta cuidadosamente fuera del tejido y rápidamente retire la pipeta de la solución.
4. Retire rápidamente la pipeta del soporte del cabezal y enjuague brevemente la punta de la pipeta con H2O tratada con DEPC con una jeringa de 1 ml. Conecte la pipeta a una jeringa de 1 ml a través de un tubo apretado para expulsar la muestra.
5. Expulsar inmediatamente las células en 10 μl de tampón de lisis 1 que contiene 1% de β-mercaptoetanol en tubos de PCR de 0,2 ml.
   NOTA: El aspirado completo con las células debe ser expulsado suavemente para no introducir burbujas.
   1. Centrifugar brevemente el tubo en una mini centrífuga de mesa a 2.000 xg durante 10 s. Se congelan inmediatamente las muestras durante 5 min en hielo seco. Después de la congelación, guárdelos a -80 ° C durante un máximo de dos semanas para obtener los mejores resultados; Las muestras pueden durar más tiempo, pero se recomienda que se procesen lo más rápidamente posible.

E "> 5. Purificación de ARN (30 min)

1. Antes de comenzar, instale un separador magnético pegando la parte superior de un soporte de punta invertida P20 o P200 al soporte magnético de 96 pocillos ²³ .
2. Preparar etanol fresco al 70% (EtOH) - aproximadamente 1 ml por muestra será suficiente. Retire las perlas magnéticas de ARN de 4 ° C de almacenamiento y descongelarlos a la RT durante al menos 30 min.
   NOTA: No más de 8 muestras deben ser procesadas al mismo tiempo, ya que muchos pasos en este protocolo dependen de la eficiencia y el manejo rápido.
3. Una vez que las perlas magnéticas están a RT, agite durante 30 s para asegurar que la solución esté bien mezclada.
   NOTA: Las perlas utilizan un tampón específico de ARN para unirse selectivamente al ARN, y permiten la eliminación de otros desechos celulares cuando se emplean con un soporte de placa magnética.
4. Descongelar las células a RT durante 1 min, ya continuación añadir 5 μl de H ₂ O libre de ARNasa a cada muestra; Pipetear hacia arriba y hacia abajo. Añadir 22 μL de perlas de ARN a cada tubo y pipettE a fondo para mezclar. Incubar las muestras a la RT durante 5 min para permitir que el ARN para interactuar y se unen con las perlas magnéticas.
5. Colocar los tubos en un dispositivo separador magnético y dejar reposar durante 8 min; Antes de proceder, asegúrese de que el sobrenadante es claro. Observe las perlas de una pastilla y asegúrese de no separarla durante la pipeta.
6. Eliminar el sobrenadante de las muestras y añadir 150 μl de EtOH al 70%. Retire el EtOH y repita el lavado dos veces más.
7. Deje que las muestras se sequen al aire durante 6 min. Compruebe intermitentemente para ver si se ha acumulado más EtOH en la parte inferior del tubo. Quítelo en consecuencia.
8. Mientras se secan las muestras, se prepara tampón de reacción 10X combinando 19 μl de tampón de lisis 2 y 1 μl de inhibidor de RNasa (40 U / μl). Bajar brevemente y mantenerlo en hielo.
9. Una vez que las muestras están secas y los gránulos de cuentas ya no aparecen brillantes, retire los tubos del separador magnético y añada 9,5 μl de H ₂ O libre de RNasaPara rehidratar las muestras. Coloque las muestras sobre hielo y agregue 1 μl de tampón de reacción 10x a cada muestra.

6. Transcripción inversa (10 min)

NOTA: Antes de comenzar, descongelar los reactivos necesarios para la transcripción inversa (RT, excepto la enzima) en hielo. Estos incluyen: cebador II, tampón 1, oligonucleótido e inhibidor de RNasa.

1. A cada tubo, añadir 2 μl de cebador II (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT ₍₃₀₎ N _-1 N, para el cual N _-1 puede ser A, C o G y N puede ser A, C, G o T; 12 μM). Coloque los tubos en un termociclador que ha sido precalentado a 72 ° C durante 3 min.
2. Durante la incubación, preparar la mezcla principal RT. Para cada reacción, se a~naden 4 μl de tampón 1 (Tris-HCl 250 mM, pH 8,3, KCl 375 mM y MgCl2 30 mM), 1 μl de oligonucleótido (48 μM) y 0,5 μl de inhibidor de RNasa (40 U / ΜL).
3. Inmediatamente después de la incubación, coloque los tubos enHielo durante 2 min.
4. Añadir 2 μL por reacción de la transcriptasa inversa (100 U / μl) a la mezcla maestra y pipetear a fondo. Añadir 7,5 μL de mezcla maestra a cada tubo y mezclar suavemente pipeteando. Girar brevemente los tubos para recoger el contenido en la parte inferior y colocarlos en un termociclador precalentado con el siguiente programa: 42 ° C durante 90 min, 70 ° C durante 10 min y una retención a 4 ° C.
5. Almacenar los tubos a -20 ° CO / N antes de proceder, aunque se recomienda que las muestras se lleven a cabo a través de la etapa de amplificación antes de ser almacenado durante largos períodos de tiempo; Otras fuentes sugieren que el almacenamiento de O / N a 4 ° C también sería aceptable en este paso ²⁴ .

7. Amplificación de cDNA (2,5 h)

NOTA: Antes de comenzar, descongelar el tampón de PCR y el cebador de PCR en hielo y centrifugar los tubos en una mini centrífuga de mesa antes de realizar la mezcla principal de PCR.

1. Para cada reacción, pReparar una mezcla principal de PCR que contiene 25 μL de tampón de PCR, 1 μl de cebador de PCR (12 μM), 1 μl de ADN polimerasa y 3 μL de H2O libre de nucleasa. Añadir la ADN polimerasa en último lugar justo antes de la adición De mezcla maestra a las muestras.
2. Añadir 30 μl de mezcla maestra a cada tubo y centrifugar a 2.000 xg durante 10 s para recoger el contenido en la parte inferior de los tubos.
3. Colocar los tubos en un termociclador precalentado con el siguiente programa: 95 ° C durante 1 min; 34 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 65 ° C durante 30 s, y 68 ° C durante 3 min; 72ºC durante 10 min; Y una retención a 4 ° C.
   NOTA: El número de ciclos para esta PCR se ha incrementado a 34, diferenciándose de las instrucciones del fabricante sugeridas. Después de repetir las pruebas, se encontró que este número de ciclo producía resultados consistentemente confiables.
4. Guarde los tubos a -20 ° C hasta un año antes de proceder.

8. Purificación de cDN amplificadoA (30 min)

1. Antes de comenzar la purificación, llevar las perlas de ADN y el tampón de elución a RT durante al menos 30 min. Preparar 80% de EtOH fresco; 1 ml por muestra debe ser suficiente. Añadir 1 μl de tampón de lisis 10X a cada muestra.
2. Vórtice las perlas de ADN durante 30 s y añada 50 μl de perlas de ADN a cada muestra. Mezcle minuciosamente pipeteando, y luego brevemente girar a 2.000 xg durante 10 s. Incubar los tubos a RT durante 8 min.
3. Coloque los tubos en el dispositivo de separación magnética durante 5 min. Pipetar suavemente el sobrenadante arriba y abajo dos veces y dejar que las muestras se sienten durante 2 min. Mientras las muestras están en el dispositivo magnético, retire el sobrenadante y deséchelo.
4. Añadir 150 μl de EtOH 80% recién hecho a cada muestra y dejar que se sienten a TA durante 30 s. Se retira el EtOH y se repite el lavado con EtOH una vez.
5. Girar brevemente las muestras y colocarlas nuevamente en el separador magnético durante 1 min. Elimine cualquier resto de EtOH y deje que las muestras se sequen al aire durante 5 min.
6. Revise las muestras de forma intermitente para ver si se ha recolectado EtOH y retírelo con una pipeta.
7. Una vez que el gránulo de gránulos ya no aparece brillante, pero antes de que comiencen a aparecer grietas, retire el tubo del separador magnético y añada 17 μl de tampón de elución. Pipetar suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender las perlas completamente.
8. Incubar las muestras resuspendidas a RT durante 2 min.
9. Girar brevemente las muestras para recoger todo el líquido en la parte inferior y colocarlas en el separador magnético durante 2 min. Transferir 15 μL de sobrenadante transparente a un tubo libre de RNasa de 1,5 ml y almacenarlo a -20 ° C.
10. Examinar la calidad y el tamaño de la biblioteca de cDNA con un chip de bioanalizador de alta sensibilidad utilizando 1 μ l de cDNA. El tamaño ideal de una biblioteca de ADNc es 0,3-2 Kb, con una concentración de al menos 10 ng / μl ( Figura 2 ).
    NOTA: Puede optar por emplear PCR como una forma de muestrear muestras para asegurar la expresión de marcadores conocidos antes de proceder con la muestra prSeparación.

9. Determine las concentraciones y el cDNA de marcaje (20 min)

1. Antes de comenzar, llevar el reactivo de ensayo, el tampón de dilución y los patrones a RT durante 30 min. Preparar una mezcla principal que contenga 1 μl de reactivo de ensayo y 199 μl de tampón de dilución por reacción. Alícuota de 199 μl de esta mezcla en 500 μ l de tubos de ensayo. Añadir 1 μl de muestra y mezclar bien.
2. Alícuota de 190 μl de mezcla maestra con el tubo 1 y 2. Agregue 10 μl del estándar 1 al tubo 1 y 10 μl del estándar 2 al tubo 2. Vórtice todos los tubos de muestra y tubos estándar durante 5 s; Incubar a TA durante 3 min.
3. Determine la concentración de muestras con un fluorómetro de alta sensibilidad. Asegúrese de que la cantidad de muestra correcta se ha introducido seleccionando la opción "calcular solución de stock" y resaltando "1 μL". Diluir cada muestra en un tubo separado de 1,5 ml a una concentración final de 0,2 ng / μl en H ₂ O libre de RNasa.
   NOTA:Mientras que las instrucciones del fabricante sugieren que uno debe comenzar con 1 ng / μL de ADN total, hemos utilizado un menor cantidad inicial y también hemos ajustado el protocolo para tener en cuenta esta enmienda.
4. En los nuevos tubos de PCR de 0,2 ml, pipetee 2,5 μl de tampón 2. Agregue 1,25 μl de cDNA al tubo apropiado para un total de 250 pg. Por último, añadir 1,25 μL de mezcla de marcaje a cada tubo y pipetear a fondo para mezclar; La transposasa dentro de la mezcla de marcaje fragmentará el ADN en hebras cortas y recocerá los adaptadores a cada extremo de cada hebra, para uso posterior por el instrumento de secuenciación.
   NOTA: Los volúmenes utilizados para la etiquetado y el acoplamiento de índice son una fracción de la cantidad sugerida por las instrucciones del fabricante. Esto no sólo permite la conservación de reactivos, sino que también ha producido constantemente muestras marcadas en nuestra experiencia.
5. Centrifugar los tubos en una microcentrífuga de encimera durante 1 min.
6. Colocar los tubosEn un termociclador precalentado con el siguiente programa: 55 ° C durante 10 min y una retención a 10 ° C.
   NOTA: La duración de esta incubación es de 10 min, en contraposición a la propuesta de 5 minutos de las instrucciones del fabricante.
7. Inmediatamente después de completar este programa, retire los tubos y añada 1,25 μl de tampón neutralizador de marcaje a cada uno. Pipetar bien para mezclar e incubar a RT durante 5 min. Completar este paso con prontitud, ya que la transposasa permanece activa hasta que el tampón neutraliza la enzima y detiene la reacción.

10. Acoplamiento y purificación de índice (1 h)

NOTA: Antes de comenzar, llevar las perlas de ADN y el tampón de resuspensión a la RT durante al menos 30 min. Decida qué índices utilizar para cada una de las muestras.

NOTA: Estos índices se unirán a los respectivos extremos 5 'y 3' del ADN fragmentado para la identificación de muestras después de la secuenciación. Asegúrese de que no hay dosLos emparejamientos son los mismos para las muestras que pueden ser secuenciadas juntas. Por ejemplo, si la muestra 1 usa los índices blanco 1 y naranja 1, la muestra dos debe usar blanco 1 y naranja 2 o blanco 2 y naranja 2, pero nunca la misma combinación de índices. Este kit contiene 4 índices distintos de color blanco y 6 distintos de color naranja. Todas las diferentes combinaciones posibles permiten agrupar hasta 24 muestras en un carril de secuenciación. Aunque típicamente sólo se agrupan 10 muestras en un carril, también se puede usar el kit que contiene 24 índices, lo que permitiría la agrupación de 96 muestras en un solo carril de secuenciación, si se desea.

1. A cada tubo, añada 1,25 μl del índice izquierdo y 1,25 μl del índice derecho para esa muestra específica. Añadir 3,75 μL de la mezcla madre de PCR y pipetear bien para mezclar.
2. Centrifugar en una microcentrífuga de encimera durante 1 min.
3. Colocar los tubos en un termociclador precalentado con el siguiente programa: 72 ° C durante 3 min; 95ºC durante 30 s; 12 ciclos de 9576ºC, C durante 10 s, 50ºC durante 30 s, y 72ºC durante 1 min; 72ºC durante 5 min; Y una retención a 4 ° C.
   NOTA: El primer paso de 95 ° C se cambió de 98 ° C, que fue sugerido por las instrucciones del fabricante. Además, los detalles del ciclo se ajustaron de manera que las temperaturas y las longitudes de tiempo permitieron la marcación óptima de nuestras muestras. La incubación final a 72 ° C también se añadió a nuestro protocolo y no se incluyó en las instrucciones del fabricante.
4. Gire brevemente los tubos para recoger el contenido en la parte inferior. Vortex las perlas de ADN durante 30 s, y luego agregar 30 μL a cada tubo y mezclar bien pipeteando.
5. Incubar las muestras a RT durante 5 min.
6. Colocar las muestras en un separador magnético durante 2 min. Pipetear el sobrenadante arriba y abajo dos veces e incubar las muestras durante 1 min.
7. Retire y deseche el sobrenadante transparente. Añadir 150 μl de EtOH al 80% a cada muestra y retirar. Repetir el lavado con EtOH una vez.
8. PermitirE muestras para secar al aire durante 10 min. Compruebe intermitentemente para ver si se ha acumulado EtOH en la parte inferior de los tubos y retire cuando sea necesario.
9. Una vez que comienza a aparecer una grieta en el gránulo de perlas de ADN, retire la muestra del separador magnético y añada 27,5 μl de tampón de resuspensión para rehidratar el gránulo. Asegúrese de que el sedimento se resuspende completamente, y luego se incuba a RT durante 2 min.
   NOTA: El volumen utilizado para el tampón de resuspensión se modificó para tener en cuenta la menor cantidad de material de partida en nuestro protocolo y difiere del volumen sugerido en las instrucciones del fabricante.
10. Coloque los tubos en el separador magnético durante 2 min. Transferir 25 μL de sobrenadante transparente en un tubo libre de RNasa y almacenar a -20 ° C.
    NOTA: No proceda con las instrucciones del fabricante para completar la normalización de la biblioteca. Las muestras se preparan con éxito después de este paso y se preparan para la secuenciación como es.
11. Analizar el tAgitación de las muestras utilizando un chip de bioanalizador y 1 μl de cada muestra.
    NOTA: El análisis de los frotis se realizará como antes; Sin embargo, el ADNc debería detectarse ahora en un intervalo de tamaño de 0,2-1 Kb ( Figura 3 ). Los frotis por debajo de este punto probablemente representan la degradación de las muestras, mientras que los frotis más grandes sugieren una marcación incompleta.

11. Agrupación de muestras (10 min)

1. Obtenga concentraciones de muestras de marcado con el fluorómetro de alta sensibilidad de antes y determine la concentración en nM.
   NOTA: Este cálculo se puede calcular con el uso de una herramienta de conversión de Internet y se basa en la longitud promedio del fragmento del rastro del bioanalizador. Para determinar la longitud promedio del fragmento, observe la traza de cada muestra individualmente y determine el tamaño del fragmento de ADN promedio. Esto también se puede calcular cuando se examina la huella del bioanalizador, resaltando el rango del frotis y examinandoE molaridad calculada por el programa.
2. Combine muestras de tal manera que el grupo contenga la misma concentración de cada muestra. No diluya las muestras; La piscina debe ser tan diluida como la muestra de menor concentración y, idealmente, tener una concentración total de al menos 15 nM.
3. Almacenar las muestras agrupadas a -20 ° C antes de la secuenciación; Se sugiere que las muestras se sometan a secuenciación dentro de una semana de agrupación. Realice una secuenciación de 100 pares de pares con una plataforma HiSeq.

Resultados

Los tipos de células se clasifican fácilmente después de la inyección de tinte

La Figura 1 muestra un ejemplo de un GFP + RGC antes y después del relleno del trazador fluorescente. Esta célula se identificó en base a su expresión de GFP en la línea transgénica ( Figura 1A ]. Se formó un sello hermético con un electrodo de punta fina de vidrio tirado sobre el soma de esta célula. Con ...

Discusión

Nuestro protocolo demuestra, a través de una guía rápida y fácil de usar, un método para preparar células individuales de las clases morfológicas identificadas para la secuenciación de alta calidad, con poco daño a la muestra. En el presente manuscrito, las células ganglionares retinianas intrinsecamente fotosensibles se caracterizan morfológicamente, se aíslan y se preparan para RNA-Seq. Las tensiones celulares pueden ocurrir durante el manejo de la retina; Por esta razón, sustituimos cada pieza de tejido ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ames' Medium	Sigma Aldrich	A1420-10X1L
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S8875
K-gluconate	Spectrum Chemical	PO178
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758
Alexa Fluor 594 Hydrazide	Invitrogen	A10442
Collagenase	Worthington Biochemical	LS005273
Hyaluronidase	Worthington Biochemical	LS002592
Petri dish (35 mm diameter)	Thermo Fisher Scientific	153066
Ophthalmologic scissors	Fine Science Tools	15000-00
#5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
Microplate Shaker	Fisher Scientific	13-687-708
Glass Micropipette	Sutter	BF120-69-10
Micropipette Puller	Sutter		P-1000 horizontal pipette puller
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-823-2F
Flexible tubing	Fisher Scientific	14-171
TCL lysis buffer	Qiagen	1031576	Lysis Buffer 1
β-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
RNase-free Water	Qiagen	129112
0.2 mL PCR tubes	Eppendorf	30124359
Ethyl Alcohol, Pure	Sigma Aldrich	E7023	Ethanol
Analog Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365	Vortex
Mini Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	05-090-100
Agencourt RNAClean XP Beads	Beckman Coulter	A63987	RNA magnetic beads
MagnaBlot II Magnetic Separator	Promega	V8351	Magnetic stand
1.5 mL MCT Graduated Tubes	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit	Clontech	634888	Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification
10x Lysis Buffer			Lysis Buffer 2
5x Ultra Low First-strand Buffer			Buffer 1
3' SMART-Seq CDS Primer II A			Primer II
SMART-Seq v4 Oligonucleotide			Oligonucleotide
SMARTScribe Rverse Transcriptase			Reverse Transcriptase (RT)
2x SeqAmp PCR Buffer			PCR Buffer
PCR Primer II A			PCR Primer
SeqAmp DNA Polymerase			DNA Polymerase
Mastercycler pro S	Eppendorf	950030020	Thermocycler
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881	DNA magnetic beads
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA
HS Bioanalyzer Chips & Reagents	Agilent Technologies	5067-4626
Qubit HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For the calculation of sample concentrations
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents for Tagmentation and Index Coupling
TD Buffer			Buffer 2
ATM			Tagmentation Mix
NT Buffer			Tagmentation Neutralizing Buffer
NPM			PCR Master Mix
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001	Indices for Tagmentation
N501			White 1
N502			White 2
N701			Orange 1
N702			Orange 2
HiSeq 2500	Illumina	SY-401-2501	For completing sequencing of samples