Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

Resumen

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Resumen

La purificación de activo proteína-proteína y complejos de proteína-ácido nucleico es crucial para la caracterización de las actividades enzimáticas y de novo identificación de nuevas subunidades y modificaciones post-traduccionales. sistemas bacterianos permiten la expresión y purificación de una amplia variedad de polipéptidos individuales y complejos de proteínas. Sin embargo, este sistema no permite la purificación de subunidades de proteínas que contienen modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, la fosforilación y la acetilación), y la identificación de nuevas subunidades reguladoras que sólo están presentes / expresadas en el sistema eucariota. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de una novela, robusto y eficiente método de purificación por afinidad en tándem (TAP) usando estreptomicina y proteínas bandera de etiquetado que facilita la purificación de complejos de proteínas con proteínas de forma transitoria o estable expresado etiquetadas con epítopo de las células eucariotas. Este protocolo se puede aplicar a caracterizar protein funcionalidad compleja, para descubrir las modificaciones posteriores a la traducción en subunidades complejos, e identificar nuevos componentes complejos de regulación mediante espectrometría de masas. En particular, este método TAP se puede aplicar para estudiar complejos de proteínas formadas por componentes eucariotas o patógenos (virales y bacterianas), produciendo de este modo una amplia gama de oportunidades experimentales aguas abajo. Proponemos que los investigadores que trabajan con complejos de proteínas podrían utilizar este enfoque de muchas maneras diferentes.

Introducción

Interacciones proteína-proteína (IBP) son fundamentales para la regulación precisa de los procesos biológicos ^1, y más estudios sobre estos IBP puede informar acerca de su función ^2. Varios enfoques se han ideado para el estudio y caracterización de los IBP, así como para la identificación de novo de nuevos componentes de la proteína de regulación. En 1989, Stanley Fields y sus colegas informaron de la levadura de dos híbridos (Y2H) de ensayo ^3. Este enfoque permite la identificación imparcial y exhaustiva de interactores (presas) para una proteína de interés definida (cebo) en Saccharomyces cerevisiae. Además de su notable utilidad para el descubrimiento de los IBP, el ensayo Y2H se puede utilizar para la caracterización de pares de proteínas en células de levadura, la definición de dominios que interactúan mínimas, y la identificación de mutaciones que suprimen tales interacciones. Modificando el ensayo Y2H, IBP también puede estudiarse en células de mamíferoclass = "xref"> 4. Las variaciones del ensayo de Y2H (por ejemplo, sistema de levadura de tres híbridos) también se pueden aplicar para estudiar la proteína-ARN y las interacciones ligando orgánico de proteínas pequeñas en las células.

Otra herramienta usada comúnmente para estudiar los IBP en un sistema homólogo es la co-inmunoprecipitación (co-IP) de ensayo ^5. Mediante el uso de un anticuerpo para inmunoprecipitar una proteína de interés, el ensayo de co-IP permite a los investigadores monitorizar los IBP en las células para diferentes condiciones ambientales y situaciones experimentales. El uso de proteínas etiquetadas con epítopo (por ejemplo, FLAG, Myc, STREP, y HA, entre otros) en la purificación por afinidad (AP) métodos ha facilitado el aislamiento de proteínas a partir de mezclas complejas de proteínas de varios ensayos de aguas abajo, incluyendo transferencia de Western, tinción de plata , y análisis enzimático. Sin embargo, ninguno de estos enfoques anteriores permiten el aislamiento de grandes cantidades de complejos de proteínas para una caracterización adicional incluyendo in vitro unassays, descubrimiento de subunidades reguladoras por espectrometría de masas, y la identificación de las modificaciones post-traduccionales. Una versión mejorada del método de AP se llama Tandem AP (TAP), que es una técnica de purificación para el estudio de los IBP mediante la creación de una proteína de fusión con dos epítopos que se purifica a través de dos puntos de acceso posteriores ^{6, 7.} En este artículo, se presenta una variación del método de TAP complejos de proteínas de purificación en el que dos subunidades etiquetados con diferentes epítopos y después se purificó a través de dos puntos de acceso secuencial (STREP AP seguido de FLAG IP). En primer lugar, proporcionar una visión minimalista de TAP (Figura 1) y, a continuación una descripción detallada de todos los pasos experimentales (Figura 2), por lo que los investigadores puedan aplicarlas a su complejo de proteína de interés.

Para demostrar la aplicabilidad del método TAP, elegimos un bien caracterizado ciclina-CDK complejo (denominado PTEFB quinasa), que se compone de la ciclina T1 subunidad reguladora (CycT1) y una quinasa (CDK9), y está implicado en la regulación de la transcripción por la ARN polimerasa II (Pol II) ^{8, 9, 10.} P-TEFb fosforila el dominio C-terminal de Pol II y sus asociados factores de elongación negativos, lo que alivia la pausa de la transcripción en el promotor y de ese modo facilita la elongación de la transcripción ^{11, 12, 13.} Con esta interacción conocida en mente, Strep-etiquetados CycT1 y CDK9 marcado con FLAG fueron sobreexpresado en células HEK293T. Un experimento recíproco TAP se realizó con CDK9 Strep-etiquetados y la bandera de etiquetado CycT1 para validar además que la interacción de proteínas es independiente de los epítopos utilizados. Las células se recogieron y se lisaron 48 h después de la transfección. El lisado soluble se purificó por TAP (STREP AP seguido por FLAGIP). Entrada y proteínas purificadas se analizaron por Western blot y tinción de plata (Figura 3).

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Protocolo

1. Las células Plating

1. Un día antes de la transfección, la placa de 3,5 x 10 ⁶ células HEK293T en 10 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v / v) de suero bovino fetal (FBS) y 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml de solución madre) por placa de 100 mm. Plate 3 - 5 100 mm platos por experimento / condición para asegurar una recuperación suficiente proteína.
   NOTA: El número de placas tiene que ser determinada para cada experimento / condición, que se basará en los niveles de expresión y la solubilidad del complejo de proteína de interés. Alternativamente, si se necesita la purificación a gran escala, las líneas celulares pueden ser adaptadas para crecer en suspensión en matraces de agitación ^2, pero este método no funcionará para transfecciones transitorias.

2. Inducir la transfección de células o líneas celulares estables

1. Al día siguiente, comprobar las células bajo el microscopio. Las células deben ser de 70 - 80% de confluencia antes de proceeding.
2. Transfectar las células con una mezcla total de 7 g de ADN plásmido y 21 l de reactivo de transfección por plato 100 mm. Células transfectar con un vector que expresa GFP (Tabla 1) como control para la eficiencia de transfección.
   NOTA: Si se utiliza una línea celular estable similares HEK293-T-REx o que induce la expresión de dos o más complejos de subunidades en respuesta a la doxiciclina ^{14, 15,} el inductor tendrá que ser añadido a las células y se incubaron durante 48 hr. Del mismo modo, una línea celular estable que induce la expresión de GFP después de la adición del inductor también se requiere para fines de validación. Continúe en el paso 2.7.
3. Preparar la mezcla de transfección por placa de 100 mm. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mezclar 500 l de DMEM sin suplementos con 7 g de ADN de plásmido total (correspondiente a dos o más plásmidos). En un tubo de microcentrífuga separado, mezclar 500 l de DMEM sin suplementos with 21 l de reactivo de transfección. Repita este procedimiento para cada reacción de transfección.
4. Pipetear la solución del reactivo de transfección en la solución de ADN del plásmido (no se mezclan soluciones en el orden inverso). Mezclar pipeteando al menos 4 veces.
5. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 a 15 min, pero no más de 15 min.
6. Inclinar la placa para crear un depósito de medio y cuidadosamente pipetear la mezcla de transfección gota a gota sobre el lado interior de la placa sin perturbar las células. Devolver el plato a su posición plana original y girar suavemente para distribuir la mezcla.
7. Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora de cultivo de células humidificado con 5% de CO ₂ (esta condición se denomina en adelante como "incubadora de cultivo de tejidos"). Reemplazar los medios de comunicación 5 horas después de la transfección (opcional).

3. La transfección de cheques o la eficiencia de inducción

1. A las 24 h después de la transfección, visualizar las células bajo una gripeorescent microscopio para comprobar la eficiencia de transfección (o la inducción del control HEK293T-Rex línea celular estable que expresa GFP). Se incuba durante otras 24 horas.

4. STREP Purificación por Afinidad (STREP AP)

1. Recoger las células
   1. A las 48 horas después de la transfección, saque la tarjeta y añadir 8 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x frío (PBS). Pipetear arriba y abajo para separar las células de la placa.
   2. Recoger y transferir la suspensión de células en un tubo de 15 ml y centrifugar las células hacia abajo a 800 xg durante 4 minutos a 4 ° C.
   3. Eliminar el sobrenadante de PBS. Repetir el giro hacia abajo (800 xg durante 1 min a 4 ° C) para eliminar cualquier PBS residual. Almacenar el sedimento celular a -80 ° C para su uso futuro o seguir el procedimiento siguiente para continuar la purificación de proteínas.
2. Lisar las células
   1. Volver a suspender los sedimentos celulares utilizando 5 x el volumen de sedimento celular (~ 250 l por placa) de tampón de lisis pasiva(PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, 1,5 mM MgCl ₂ mM, DTT 1, proteasa tableta de cóctel inhibidor, 5% v / v de glicerol, y 1,0% NP-40) y transferir la suspensión celular a una 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
   2. Brevemente vórtex con la suspensión y inclinar la cabeza durante 30 minutos a 4 ° C.
   3. Centrifugar la suspensión de células a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
   4. La transferencia de los lisados ​​solubles en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y desechar los sedimentos celulares. Ahorra un 10% del volumen final del lisado soluble como "Input STREP AP." Almacenar a 4 ° C.
3. Equilibrar las cuentas STREP
   NOTA: Los granos Uso STREP para la primera etapa AP! Complejos tira hacia abajo con los granos STREP recuperan significativamente más proteína que los derribado con perlas de bandera.
   1. Sacar (n × 40 l) n + l de la suspensión de cuentas STREP 50% (n = número de muestras) y centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C.
      NOTA: Use-m de anchoconsejos outhed a perlas de pipeta.
   2. Eliminar el sobrenadante y añadir 500 l de PLB a las perlas. Inclinar la cabeza la mezcla de los granos durante 5 min a 4 ° C. Centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C.
      1. Repita para un total de 3 lavados. Resuspender las perlas en PLB a un volumen final de n × 40 l.
   3. Añadir 40 l de 50% de suspensión STREP de cuentas para cada muestra de lisado celular y inclinar la cabeza durante 2 horas a 4 ° C.
4. STREP AP
   1. Centrifugar la solución a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C.
   2. Eliminar el sobrenadante y almacenar como "STREP AP de flujo continuo (FT)" a 4 ° C.
   3. Añadir 500 l de STREP AP tampón de lavado I (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 250 mM, 1,5 mM MgCl ₂ mM, DTT 1, 5% de glicerol y 0,2% NP-40) a las perlas. Inclinar la cabeza la mezcla de perlas durante 5 min a 4 ° C y se centrifuga a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante.
      1. Repita para un total de 4 lavados.
         NOTA: Antes del cuarto lavado, transferir la solución de perlas a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a reducir el fondo de proteínas. Este paso es esencial.
   4. Añadir 500 l de tampón de lavado II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, y EDTA 1 mM) y equilibrar las cuentas por inversión de los tubos. Centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
   5. Eluir la proteína de interés con 50 l de STREP Tampón de Elución (Tris-HCl 100 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, y destiobiotina 2,5 mM). Vortex a 800 rpm durante 15 min a 4 ° C.
   6. Centrifugar las perlas a 1.500 xg durante 1 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante. Esta fracción corresponde a la muestra "STREP AP elución".
   7. Guardar la fracción perlas a 4 ° C para una segunda elución, lo que podría producir hasta la mitad de la cantidad de proteína obtenida con la primera elución. Alícuota de 10% de la STREP AP elución para la tinción de plata y / o el Western Blot^16.
5. Equilibrar las cuentas BANDERA
   1. Sacar (nx 16 l) n + l de solución de perlas de FLAG (n = número de muestras) y centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C.
      NOTA: Utilice consejos de boca ancha a perlas de pipeta.
   2. Eliminar el sobrenadante y añadir 500 l de tampón de lavado FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, y 0,1% NP-40) a las perlas. Centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repita para un total de 3 lavados.
   3. Resuspender las perlas en tampón de lavado FLAG a un volumen final de 16 l nx.
   4. Añadir 16 l de la suspensión de la BANDERA de talón al resto de elución STREP AP y alojamiento inclinar la cabeza a 4 ° C.

5. BANDERA IP

1. Centrifugar la suspensión perlas FLAG a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C. Guardar el sobrenadante y tienda como la "bandera IP de flujo continuo" (FT) a 4 ° C.
2. Añadir 50081; l de tampón de lavado FLAG a la solución. Inclinar la cabeza durante 5 min a 4 ° C y se centrifuga a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repita para un total de 4 lavados y eliminar el sobrenadante después de cada lavado.
   NOTA: Antes de que el cuarto lavado, transferir la solución de proteína-cuentas a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para reducir el fondo. Este paso es esencial.
3. Eliminar el sobrenadante del centrifugado final y añadir 30 l de tampón de lavado que contiene FLAG 200 ng / l de péptido FLAG en las perlas. Vórtice a 800 rpm durante 2 horas a 4 ° C.
4. Centrifugar la suspensión a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C. Se recoge el sobrenadante y se almacena a 4 ° C como la "bandera IP elución."
   NOTA: Las muestras de elución se pueden confirmar por tinción de plata y / o de transferencia de Western usando protocolos estándar ^16, y están listos para más ensayos de proteínas. Al configurar una transferencia de western, ejecutar todas las siguientes muestras: (1) PEIF AP de entrada, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutien, (4) BANDERA IP FT, y (5) BANDERA IP elución. Los volúmenes cargados tendrán que ser determinado para cada experimento. Todas las muestras recogidas y los granos se pueden almacenar a 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo y a -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo. Muestras TAP podrían ser analizados mediante espectrometría de masas para verificar la identidad de sus componentes, para identificar nuevos modificaciones post-traduccionales (PTMs), y / o para descubrir cualquier interacción nueva proteína con el complejo purificado ^{2, 17.} Para este propósito, después de ejecutar una mancha de gel de Coomassie o plata, las bandas pueden ser extirpados del gel utilizando un escalpelo limpio. Varios excelentes críticas que discuten métodos de espectrometría de masas se han publicado ^{18, 19.}

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Resultados

En este artículo, se demuestra la aplicabilidad del método TAP para el bien caracterizado CycT1-CDK9 compleja (también conocido como P-TEFb quinasa).

Los plásmidos que codifican la ciclina T1-STREP (CycT1: S) y CDK9-FLAG (CDK9: F), o CDK9-STREP (CDK9: S) y Ciclina T1-FLAG (CycT1: F) (Tabla 1), se transfectaron en células HEK293T . Los controles negativos incluyeron transfecciones con un vector vacío y la...

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Discusión

El protocolo descrito aquí para la expresión y el aislamiento de los complejos de proteínas a partir de células eucariotas no se limita a la caracterización bioquímica de tales conjuntos moleculares, pero también puede ser utilizado para la identificación de nuevos interactores y modificaciones posteriores a la traducción que podría regular su función. La utilización de etiquetas de afinidad no se limita a lo que se menciona en este protocolo; pero nuestra experiencia sugiere que el uso de STREP como el prim...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH3002.2FS
Fetal bovine serum	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH30071
Penicillin/Streptomycin	MP Biomedicals	MP091670049
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836153001
STREP-Tactin Superflow	IBA Lifesciences	2-1208-010
STREP-tag elution buffer	IBA Lifesciences	2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	F2426
Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve	Corning	430167
Protein Lo-Bind Eppendorf	Eppendorf	022431081
Digital Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-370
48 hole micro tube foam rack	Fisher Scientific	02-215-386
Labquake shaker rotisserie	Thermo	415110