Preservación de los nervios de mitad de obstrucción uretral (NEMO) en femenino pequeños roedores

Resumen

modelado tradicional de obstrucción del tracto urinario parcial en roedores está plagado de mortalidad de los animales. Una lesión en la denervación de la disección alrededor de la uretra y la vejiga cuello proximal también es de gran preocupación. Hemos desarrollado y evaluado un modelo de obstrucción uretral mediados de seguro y fiable, evitando las deficiencias del modelo tradicional.

Resumen

obstrucción del tracto urinario parcial (pBOO) tiene una alta prevalencia, las causas carga significativa del paciente, y los costos de salud inmensas. El modelo animal más común para investigar la remodelación de la vejiga en pBOO son roedores hembra sometidos a una obstrucción parcial de la uretra proximal. La variabilidad en el grado de obstrucción y la mortalidad de los animales son las principales preocupaciones con obstrucción proximal. Además, la disección alrededor de la uretra y la vejiga cuello proximal pone en peligro la inervación de la vejiga.

Hemos desarrollado un modelo de obstrucción uretral mediados de preservación de nervios (NEMO) para pBOO evitando las desventajas del modelo tradicional. Nos acercamos a la uretra justo por debajo de la sínfisis del pubis, lo que evita la necesidad de laparotomía, así como para la disección en esta área; También, el esfínter uretral estriado se mantuvo intacta. Se realizó NEMO en ratas hembra Sprague-Dawley (12 obstrucciones, 6 animales sham), así como en ratones hembra C57 / BL6 (20 obstruccións, 18 animales sham). Después de dos semanas, se evaluó la función vesical, la masa de la vejiga, y la masa corporal.

No tuvimos mortalidades entre ratas hembra obstructed- o con operación simulada; como se describe para el proximal tradicional pBOO-método, atamos la sutura alrededor de la uretra proximal y un coloca temporalmente varilla de metal 0,9 mm. NEMO indujo un aumento del 85% en masa de la vejiga después de dos semanas, el volumen promedio de orina residual fue de 0,4 ml en ratas parcialmente obstruidos mientras que sólo el 0,03 ml en animales de simulación. En ratones, probamos 3 tamaños de cánulas que colocan a lo largo de la uretra al atar la sutura. Encontramos que el uso de una cánula de calibre 27 resultó en más de mortalidad de los animales 50%; la colocación de la cánula de calibre 25 no dió la respuesta deseada en el aumento de masa de la vejiga; la utilización de una cánula de calibre 26 produjo resultados favorables con la mortalidad mínima de animales (1/8) sin embargo, un aumento significativo de 2 veces en masa vejiga.

Introducción

Obstrucción de la salida de la vejiga parcial (pBOO) tiene una alta prevalencia y puede resultar en disfunción de la vejiga severa ^1; El espectro va desde malformaciones congénitas tales como válvulas de uretra posterior o hipospadias, más de estenosis uretrales adquiridos a la hiperplasia benigna de próstata. Este último afecta a más del 30% de los hombres mayores de sesenta años y ^2. Gran carga paciente y los costos de salud asociados con inmensas pBOO justifican el esfuerzo de investigación considerable puesto en el estudio de la remodelación de la vejiga en respuesta al aumento de la resistencia de salida ^3. Desde 2006 hasta 2015, más de 220 PubMed indexado artículos fueron publicados sobre el efecto de pBOO sobre la vejiga urinaria.

Aunque los modelos animales para pBOO se han ideado en varias especies de ^4, tales como la rata ^5, el conejo ^6, cerdo ^7, y mouse ^{8, 9,} podría decirse que el modelo animal más utilizado sin embargo son ratas hembras sometidos a una obstrucción parcial de la uretra proximal; el acceso a abdomen de los animales, exteriorizar de la vejiga, y la disección alrededor del cuello de la vejiga son inevitables con esta técnica tradicional de obstrucción de la uretra proximal. La variabilidad en el grado de obstrucción y la mortalidad en animales son sólo algunas de las preocupaciones asociadas con este procedimiento ^{10, 11;} demostramos que en los animales operados de forma simulada, la disección alrededor de la uretra proximal conduce a cambios fisiológicos que se correlacionan con la pérdida de fibras nerviosas en el cuello de la vejiga ^12. Este hallazgo indica que el pBOO modelo animal más utilizado, que implica el acceso a la uretra proximal en roedores hembra, conduce a una lesión de la denervación con cambios estructurales y funcionales asociados de la vejiga, lo que afectafarsa y animales obstruidos. Por lo tanto, se necesita un enfoque evitar lesiones denervación alternativo. Nuestro laboratorio desarrolló y evaluó un enfoque nervio ahorradores de obstrucción del medio-uretral (NEMO), eficaz en la inducción de cambios de obstrucción asociada esperados en la vejiga, tales como aumento de la masa de órganos y la orina residual, mientras que los animales con operación simulada fueron indistinguibles de los animales de control no operados . También, el esfínter uretral estriado se mantuvo intacta ya que se encuentra proximal al nivel de la disección. Además, la variabilidad en aumento obstrucción inducida en la masa de la vejiga fue significativamente menor que en la obstrucción tradicional uretral proximal y la mortalidad de los animales fue cero.

También se aplica con éxito NEMO en ratones hembra con una mortalidad inferior al 10% en los animales obstruidos, mientras que todos los modelos pBOO para los ratones descritos hasta la fecha se asociaron con una mortalidad alrededor de 50%. El estudio de la remodelación de la vejiga en el contexto de pBOO en ratones se beneficiará de applicabildad de todo el espectro de modificaciones transgénicas.

La disección alrededor de la uretra media en roedores hembra no induce los cambios estructurales o funcionales indeseables y de confusión en la vejiga urinaria se observa en el modelo tradicional obstrucción proximal. Sin embargo, la inducción de una obstrucción parcial a nivel de mediados de uretral todavía induce la hipertrofia de la vejiga y el aumento de la orina residual, como se espera de un modelo animal para pBOO. Es importante destacar que la realización de NEMO en ratones abre una investigación de la remodelación de la vejiga en pBOO a métodos transgénicos, que son virtualmente no disponible en los roedores más grandes.

Protocolo

El siguiente protocolo experimental fue aprobado por el comité de cuidado de los animales de la institución.

1. Nemo en ratas hembras

1. Preparación
   1. Coloque una hembra de rata Sprague-Dawley que pesaban alrededor de 200 g bajo 3% anestesia con isoflurano, pesar el animal, y afeitar y desinfectar el área prepúbico 3 veces usando un lavado quirúrgico de yodo.
   2. En una almohadilla de calefacción, extremidades traseras de cinta y la cola hacia abajo y cateterizar la vejiga con un angiocatéter de calibre 20, que también se grabó suavemente hacia abajo para evitar el deslizamiento.
2. Disección
   1. Utilice un bisturí para realizar una incisión en la piel longitudinal 8 mm de la sínfisis púbica palpable hacia el meato uretral. Levante la piel en cualquiera de los lados para facilitar el cierre de la herida más tarde.
   2. Diseccionar para identificar la uretra con stent por difusión longitudinal con tijeras finas. Coloque los ganchos de la piel auto-retención de finos para mejorar la exposiciónde la uretra.
   3. Realizar algunas suave longitudinal difusión usando tijeras curvas dorsal a la uretra para desarrollar el plano entre la uretra y la vagina. Entonces, sin rodeos pasar una sutura de seda 4-0 detrás de la uretra y preparar el doble tiro de un nudo de cirujano.
3. La obstrucción parcial de la uretra
   1. Retire el angiocatéter, coloque un 0,9 mm varilla metálica paralela a la uretra, y luego apretar el nudo alrededor de la uretra y el metal de varilla, de manera que éste todavía se desliza hacia fuera fácilmente a partir de entonces.
   2. Asegurar el nudo con 3 más tiros usando tensión suave antes de retirar la varilla. Cortar el extremos de sutura alrededor de 3 mm de largo, o 4 mm si la liberación posterior de obstrucción es parte del experimento.
4. cierre de la herida
   1. Aproximar las glándulas parauretrales utilizando una sola puntada enterrado de absorbible de sutura trenzado 4-0.
   2. Cierre la piel con una sutura de colchonero horizontal enterrada utilizando el mismo SUT absorbibleUre. Nota: Si bien puede parecer poco convencional de usar una sutura absorbible para una puntada de penetración de la piel, no nos encontramos con complicaciones tales como infecciones de la herida, y que la eliminación de la sutura puede ser evitado.
5. después de la atención
   1. Inyectar buprenorfina 0,1 mg / kg por vía subcutánea antes de colocar la rata en una jaula de recuperación.
   2. Ofrecer algunas dieta de recuperación suave durante las primeras 24 h a la rata alojados individualmente. Después de este período, los animales casa otra vez en los mismos pares como antes del procedimiento, siempre que lo están haciendo bien y pertenecen al mismo grupo de tratamiento.
   3. Compruebe las ratas diarias para tamaño de la vejiga y el bienestar general; registrar su peso al menos semanalmente.

2. Nemo en ratones hembra

1. Preparación
   1. Coloque una hembra C57BL / 6 mouse peso de alrededor de 18 g y proceder como se detalla en el paso 1.1.1.
   2. Proceder como se detalla en el paso 1.1.2, excepto utilizar un ang calibre 24iocatheter.
2. Disección
   1. Utilice un bisturí para realizar una incisión en la piel longitudinal 6 mm desde la sínfisis púbica palpable hacia el meato uretral.
   2. Diseccionar para identificar la uretra con stent por difusión longitudinal con tijeras finas. Levantar el haz neuro-vascular ejecutando ventralmente en la uretra mediante disección roma análoga.
   3. Realizar algunas suave longitudinal difusión usando tijeras curvas dorsal a la uretra para desarrollar el plano entre la uretra y la vagina. Entonces, sin rodeos pasar una sutura 5-0 trenzado no absorbible detrás de la uretra y preparar el doble tiro de un nudo de cirujano.
3. La obstrucción parcial de la uretra
   1. Conectar el angiocatéter con una jeringa de 1 ml y se inyecta 0,1 ml de solución salina normal en la vejiga.
   2. Colocar un calibre 26 de la cánula en paralelo a la uretra. apriete suavemente el nudo alrededor de la uretra y la cánula mientras que tirando hacia atrás el angiocaXX.
   3. Asegurar el nudo con 3 más tiros usando tensión suave antes de retirar la cánula.
   4. Prueba de orina que aparece en el meato a una suave presión sobre la vejiga del animal; aflojar el lazo si es incapaz de expresar la orina. De lo contrario, cortar la sutura termina aproximadamente 3 mm de largo.
4. cierre de la herida
   1. Cierre la piel con una sutura de colchonero horizontal enterrado usando una sutura absorbible 5-0 trenzado.
5. después de la atención
   1. Inyectar 0,1 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea antes de colocar el ratón en una jaula de recuperación.
   2. Ofrecer algunas dieta de recuperación suave durante las primeras 48 h al ratón alojados individualmente. Después de este período, los animales casa otra vez en los mismos grupos que antes del procedimiento, siempre que lo están haciendo bien y pertenecen al mismo grupo de tratamiento.
      NOTA: Los ratones con una palpable distendido vejiga 24 h después del procedimiento que no anule cuando se maneja están sobre-obstruido y morirán dentro de la next 1 - 2 días a menos tomada de nuevo bajo anestesia para la eliminación de la ligadura de obstrucción.
   3. Compruebe los ratones diarias de tamaño de la vejiga y el bienestar general; registrar su peso al menos semanalmente.

Resultados

Conservadora de nervios de mediana-uretral obstrucción (NEMO) en ratas hembra

Mortalidad

Se realizó una obstrucción uretral en mediados de más de 40 ratas hembras hasta el momento y no tenía mortalidades.

masa vesical

Discusión

La mortalidad de los animales es una de las principales preocupaciones de la modelo tradicional de pBOO en la uretra proximal, en 15% o más en muchos informes ^{10, 11, 13.} Nemo parece tener un mínimo de mortalidad cuando se aplica en las ratas hembras. obstrucción uretral proximal en ratones es técnicamente más difícil que en ratas y por lo tanto incluso más propensos a complicaciones. El uso de una cánu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Female rat	Charles-River Canada	Sprague Dawley Rat (Crl:SD); Strain Code: 400	about 200 g
Isoflorane vaporizer	Benson medical industries inc.	TEC III Isoflurane; product code: 53-T3ISO
Isoflorane	Fresenius Kabi Animal Health	Isoflorane; product code CP0406V2	250 mL bottle
Disposable scalpel	Ted Pella, Inc.	#15 Sterile, Stainless Steel Scalpels; catalogue number 549-9-15S
Microscopy forceps	Ted Pella, Inc.	Aesculap Microscopy Forceps, Finepoint, 115mm; product number 5443
Adson forceps	Ted Pella, Inc.	Aesculap Adson Dissection Forceps, Curved, 120mm; product number 5002-9
Curved surgical scissors	Ted Pella, Inc.	Surgical Scissors, Curved, S/S, 105mm; catalogue number 1376
0.9 mm inox metal rod	goodfellow.com	Stainless Steel - AISI 316L Wire Diameter:0.9mm; order code 911-684-65
Skin hooks - self made from inox steel	goodfellow.com	Stainless Steel - AISI 316L Wire Diameter:0.9mm; order code 911-684-65
4-0 Silk suture	esutures.com	4-0 Sofsilk black 98" strand; product number LS640
5-0 Vicry suture	esutures.com	5-0 Vicryl undyed 27" RB-1 taper; product number J213H
Needle holder	Medsupplier.com	Integra Miltex Carb-N-Sert Baumgartner Needle Holder - 5 1/2"; product code SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC
Temgesic (Buprenorphine)	first veterinary supply	Buprenex 0.3MG/ml inj amps; item #075701
1 mL syringe with 27 G needle	Fisher Scientific	BD Tuberculin Syringe, BD 309623
20 G Angiocath	Fisher Scientific	Andwin Scientific ANGIOCATH 20 GA; Catalog No. NC9561906
Recovery diet	clearh2o	DietGel 31M; 72-08-5022
C57Bl/6 female mice	Charles-River Canada	C57BL/6 Mouse (C57BL/6NCrI); Strain Code: 027	about 18 g
24 G angiocath	Fisher Scientific	Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc. IV CATH ANGIOCATH 24GX3/4IN; Catalog No. NC9814340
5-0 Ethibond	esutures.com	5-0 Ethibond green 30" RB-1 taper; product number X550H
26 G syringe needle	Sigma-Aldrich	BD Precisionglide syringe needle, Gauge 26; z192392
Normal Saline	Baxter	0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 100 mL MINI-BAG; product code 2B0043