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  • Discusión
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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se describe el protocolo para una plataforma novela polarización de la concentración de iones (ICP) que puede detener la propagación de la zona de ICP, independientemente de las condiciones de funcionamiento. Esta capacidad única de la plataforma se encuentra en el uso de la fusión de agotamiento de iones y el enriquecimiento, que son dos polaridades del fenómeno ICP.

Resumen

El fenómeno de polarización de la concentración de iones (ICP) es uno de los métodos más prevalecientes que preconcentrado de muestras biológicas de baja abundancia. El ICP induce una región no invasiva para biomoléculas cargadas (es decir, la zona de agotamiento de iones), y los objetivos se puede preconcentrado en esta región límite. A pesar de los altos rendimientos de preconcentración con ICP, es difícil encontrar las condiciones de operación de zonas no propagar el agotamiento de iones. Para superar esta ventana estrecha operativo, recientemente hemos desarrollado una nueva plataforma para la preconcentración espaciotemporalmente fijo. A diferencia de los métodos anteriores que sólo utilizan el agotamiento de iones, esta plataforma también usa la polaridad opuesta de la ICP (es decir, el enriquecimiento de iones) para detener la propagación de la zona de agotamiento de iones. Al confrontar la zona de enriquecimiento con la zona de agotamiento, las dos zonas se funden y se detienen. En este trabajo se describe un protocolo experimental detallado para construir este platf ICP espaciotemporalmente definidoORM y caracterizar la dinámica de preconcentración de la nueva plataforma comparándolas con las del dispositivo convencional. los perfiles de concentración de iones cualitativos y respuestas en tiempo actual capturar con éxito las diferentes dinámicas entre el PCI y el PCI fusionada autónomo. En contraste con la convencional que puede fijar la ubicación de preconcentración de sólo ~ 5 V, la nueva plataforma puede producir un tapón condensado diana en una ubicación específica en la amplia gamas de condiciones de operación: Voltaje de (0,5 a 100 V), la fuerza iónica (1-100 mM) y pH (3.7 a 10.3).

Introducción

Ion polarización de la concentración (ICP) se refiere a un fenómeno que se produce durante el enriquecimiento de iones y el agotamiento iónico en una membrana de permeabilidad selectiva, lo que resulta en una caída de potencial adicional con gradientes de concentración de iones 1, 2. Este gradiente de concentración es lineal, y se hace más pronunciada como un voltaje más alto se aplica (régimen óhmico) hasta que la concentración de iones en la membrana se acerca (régimen limitante) cero. En esta condición de difusión limitada, el gradiente (y el correspondiente flujo de iones) ha sido conocido por ser maximizada / 1 saturada. Más allá de este entendimiento convencional, cuando la tensión (o corriente) se incrementa aún más, se observa una corriente overlimiting, con zonas de agotamiento planas y gradientes de concentración muy agudos en el límite de la zona 1, 3. La zona plana tiene una concentración de iones muy baja, pero la conducción superficie, electro-osmoti flujo c (EOF), y / o inestabilidad electro-osmótico promueven el flujo de iones y inducen una overlimiting actual 3, 4, 5. Curiosamente, la zona de agotamiento plana sirve como una barrera electrostática, que filtra 6, 7, 8, 9 y / o preconcentrados dirige a 10, 11. Dado que no hay una cantidad insuficiente de iones para detectar las cargas superficiales de las partículas cargadas (por electroneutralidad satisfactorio), las partículas no pueden pasar a través de esta zona de agotamiento y por lo tanto se alinean en su límite. Este efecto no lineal ICP es un fenómeno genérico en diversos tipos de membranas 10, 11, 12, 13,> 14 y geometrías 6, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21; esto es por qué los investigadores han sido capaces de desarrollar diversos tipos de filtración 6, 7, 8, 9 y preconcentración 10, 11 dispositivos utilizando el ICP no lineal.

Incluso con tan alta flexibilidad y robustez, que sigue siendo un desafío práctico para aclarar las condiciones de funcionamiento de los dispositivos PCI no lineales. El régimen no lineal de la ICP elimina rápidamente cationes a través de una membrana de intercambio catiónico, lo que provoca el desplazamiento de aniones se mueven hacia el ánodo. Como unEn consecuencia, la zona de agotamiento plana se propaga rápidamente, lo que es una reminiscencia de la propagación de choque 22. Mani et al. denominado a esta dinámica la desionización (o agotamiento) 23 golpes. Para preconcentrar objetivos a una posición de detección designado, la prevención de la expansión de la zona de agotamiento de iones es necesario, por ejemplo, mediante la aplicación de EOF o flujo impulsado por presión contra la expansión zona 24. Zangle et al. 22 aclaró los criterios para la propagación de ICP en un modelo unidimensional, y depende en gran medida la movilidad electroforética 17, la fuerza iónica 18, pH 25, y así sucesivamente. Esto indica que las condiciones de funcionamiento adecuadas serán alterados de acuerdo con las condiciones de la muestra.

A continuación, presentamos el diseño detallado y los protocolos experimentales para una plataforma novedosa que ICP concentrados previos objetivos dentro de un spatiotemporalmente posición 26 definida. La expansión de la zona de agotamiento de iones es bloqueado por la zona de enriquecimiento de iones, dejando un tapón de preconcentración estacionaria en una posición asignada, independientemente del tiempo de funcionamiento, el voltaje aplicado, la fuerza iónica y pH. Este protocolo de vídeo detallada pretende mostrar el método más simple para integrar membranas de intercambio catiónico en los dispositivos de microfluidos y para demostrar el rendimiento de preconcentración de la nueva plataforma de ICP en comparación con la convencional.

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Protocolo

1. La fabricación de intercambio de cationes chips de microfluidos de membrana-integrado

  1. Preparación de maestros de silicio
    1. Diseño dos tipos de maestros de silicio: uno para el patrón de una resina de intercambio catiónico y el otro para la construcción de un microcanal con polidimetilsiloxano (PDMS).
      NOTA: La geometría detalle se describirá en los pasos 1.3.1 y 1.4.1.
    2. Fabricar los maestros de silicio usando fotolitografía ya sea convencional o profunda grabado iónico reactivo 27.
    3. Silaniza los maestros de silicio micropatterned con triclorosilano (~ 30 l) en un frasco de vacío durante 30 minutos.
      PRECAUCIÓN: El triclorosilano es un líquido pirofórico que es inflamable y tiene una toxicidad aguda (inhalación, ingestión oral).
  2. Preparación de moldes de PDMS
    1. Mezclar una base de elastómero de silicona con un agente de curado en una relación de 10: 1 y colocar la taza con este no curado PDMS(30 a 40 ml para la replicación de microestructuras sobre una oblea de 4-en silicio) en un frasco de vacío durante 30 min para eliminar las burbujas.
      Nota: La base de silicona contiene oligómeros de siloxano que terminan con grupos vinilo y un catalizador basado en platino. El agente de curado contiene oligómeros que tienen tres enlaces silicio-hidruro 28 reticulación.
    2. Verter el PDMS sin curar en los amos de silicio, eliminar las burbujas con un soplador, y curar el PDMS a 80 ° C durante 2 h en un horno de convección.
    3. Separar los PDMS curado de los maestros de silicio y adecuadamente forma a los PDMS con un cuchillo (formas cuadradas, como se muestra en la figura 2a-b, iv).
  3. Patrón de las membranas de intercambio de cationes
    1. Cortar la mitad del molde de PDMS perpendicularmente a los dos microcanales paralelos y perforar agujeros en los extremos de los canales de PDMS con un punzón de biopsia de 2.0 mm.
      NOTA: El molde de PDMS para el patrón de la membrana selectiva de cationes tiene dos parmicrocanales parale- (anchura: 100 m; altura: 50 m; entre canales distancia: 100 m; Figura 1a). La forma original del molde puede ser imaginado por el reflejo del molde en rodajas a lo largo de la línea de corte. Se recomiendan microcanales en forma de L para la perforación de los dos orificios sin superponerse.
    2. Limpiar un portaobjetos de vidrio y el molde de PDMS con cinta adhesiva y un soplador y poner el molde sobre el portaobjetos de vidrio para crear unión reversible entre ellos.
    3. De acuerdo con la técnica de microflujo patrón 29, la liberación de ~ 10 l de una resina de intercambio catiónico en el extremo abierto del canal que fue cortada en el paso 1.3.1 (Figura 1b). Coloque el cabezal de la jeringa en los agujeros perforados y tire del émbolo (flechas negras en la figura 1b); una presión negativa suave tirará de la resina de intercambio catiónico, y la resina llenará los dos canales.
      NOTA: Se recomienda que la altura del microcanal es mayor que 1581; m, porque la alta viscosidad de la resina requiere alta presión para llenar los canales. Por otro lado, es mejor que la altura no sea superior a 100 micras, debido a que la membrana selectiva de iones modelado será más grueso que 1 m; una membrana tal grueso puede crear un hueco entre la membrana y el canal de PDMS 13.
    4. Separar el molde de PDMS sin tocar la resina modelada y colocar el portaobjetos de vidrio en el calentador a 95 ° C durante 5 min para evaporar el disolvente en la resina.
      NOTA: El espesor de la membrana con dibujos es por lo general menos de <1 m. El molde se separa suavemente con la articulación del molde para el lado abierto (línea de puntos y la flecha en la figura 1b). Lo mejor es separar el molde de menos de 1 min después de llenar la resina. Si el molde se separa unos minutos más tarde, las membranas más gruesas pueden ser obtenidos, pero tendrían una forma cóncava debido al efecto capilar.
    5. Despegue la innecesariaparte de la membrana modelada con una hoja de afeitar, haciendo dos alineaciones patrones separados (Figura 1c).
      NOTA: El material de intercambio catiónico utilizado aquí ha perfluorado grupos, es decir, el patrón no está fuertemente unido al vidrio. Por lo tanto, el método de perfilado simple puede quitar fácilmente la parte innecesaria de la membrana.
  4. Integración del microcanal y el sustrato de membrana con dibujos
    1. Haga dos agujeros en los extremos de microcanales y otros dos agujeros donde se ubicarán los patrones de membrana después de la unión del canal de PDMS al sustrato de membrana fabricada con estampado en el paso 1.3.
      Nota: El microcanal PDMS tiene un canal (anchura: 50 a 100 micras; altura: 10 m), pero está unido a los extremos del canal vecino (Figura 1d).
    2. Unir el microcanal PDMS al sustrato de membrana con estampado inmediatamente después del tratamiento con plasma de oxígeno durante 40 s a 100 W y 50 mTorr.
      NOTA: Colocar la membrana modelado perpendicularmente en el centro del microcanal.

2. ICP preconcentración

  1. Preparación para el experimento
    1. Preparar varias soluciones de ensayo, incluyendo KCl mM 1-100, NaCl 1 mM (pH ~ 7), la mezcla de NaCl 1 mM y 0,2 mM HCl (pH ~ 3,7), la mezcla de NaCl 1 mM y 0,2 mM NaOH (pH ~ 10.3), y 1x solución salina tamponada con fosfato.
    2. Añadir un colorante fluorescente con carga negativa (~ 1,55 M) a las soluciones de ensayo.
      NOTA: La concentración del colorante añadido debe ser mucho menor que la de los iones de sal (<10 micras), de modo que los colorantes cargados no contribuyen a una corriente eléctrica 30, 31.
    3. Cargar la solución de muestra en un depósito de la canal y aplicar presión negativa al otro depósito para llenar el canal con la solución. Conectar los dos depósitos hidrodinámicamente por releasing una gran gota para eliminar el gradiente de presión a lo largo del canal (Figura 2a).
    4. Llenar los dos depósitos, que están conectados a los patrones de intercambio de cationes, con soluciones tampón (1 M de KCl o NaCl 1 M) utilizando una jeringa o una pipeta para compensar el efecto de ICP en los depósitos.
    5. Coloque los cables en los embalses, a través de las dos membranas estampadas (ánodo en el depósito izquierdo y el cátodo a la derecha), y conectarlos con una unidad de medida de origen (Figura 2a).
  2. Visualización del fenómeno PCI y PCI preconcentración
    1. Cargar el aparato de ICP en un microscopio de epifluorescencia invertida. Aplicar una tensión (0,5100 V) y medir la respuesta de corriente con una unidad de medida de origen.
    2. Capturar imágenes fluorescentes con una cámara de dispositivo de carga acoplada y analizar la intensidad de fluorescencia utilizando software de imagen 32.

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Resultados

Las etapas de fabricación esquemáticas de un preconcentrador microfluidos membrana integrado se muestran en la Figura 1. Una descripción detallada de la fabricación se da en el Protocolo. Los diseños y las imágenes del dispositivo de la preconcentrador espaciotemporalmente definido 26 se contrastan con los de un convencional preconcentrador 11 (Figura 2). El fenómeno de la PIC en el preconcentrador e...

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Discusión

Hemos descrito el protocolo de fabricación y el rendimiento de un preconcentrador espaciotemporalmente definido en una gama de la tensión aplicada (0,5 a 100 V), la fuerza iónica (1-100 mM) y pH (03/07 a 10/03), el logro de un 10.000 veces preconcentración de colorantes y proteínas dentro de 10 min. Como al igual que los dispositivos PCI anteriores, el rendimiento de preconcentración se hace mejor en un voltaje más alto y al menor fuerza iónica. Un parámetro adicional que podemos considerar aquí es la distanci...

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Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

This work was supported by the internal fund of the Korea Institute of Science and Technology (2E26180) and by the Next Generation Biomedical Device Platform program, funded by the National Research Foundation of Korea (NRF-2015M3A9E202888).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Sylgard 184 Silicone Elastomer kitDow Corning
TrichlorosilaneSigma Aldrich175552Highly toxic
Nafion perfluorinated resin, 20 wt%Sigma Aldrich527122
Sodium chlorideSigma Aldrich71394
Potassium chlorideSigma Aldrich60121
Alexa Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl esterInvitrogenA20000
Isothiocyanate-conjugated albuminSigma AldrichA9771
Phosphate buffer saline, 1xWengeneLB004-02
Tween 20Sigma AldrichP1379
Epifluorescence microscopeOlympusIX-71
Charged-coupled device cameraHamamtsu Co.ImageEM X2
Source measurement unitKeithley Instruments2635A
Covance-MPFemto Science

Referencias

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