La inducción de una respuesta inflamatoria en la Primaria hepatocitos culturas de ratones

Resumen

Aquí, se muestra un enfoque enzimático para aislar hepatocitos primarios de ratones adultos, y se describe la cuantificación de una respuesta inflamatoria mediante ELISA y PCR en tiempo real.

Resumen

El hígado juega un papel decisivo en la regulación de la inflamación sistémica. En la enfermedad renal crónica, en particular, el hígado reacciona en respuesta al medio urémico, estrés oxidativo, endotoxemia y la disminución del aclaramiento de circulación de citocinas proinflamatorias mediante la producción de un gran número de reactivos de fase aguda. herramientas experimentales para el estudio de la inflamación y el papel fundamental de los hepatocitos son cruciales para comprender la regulación y la contribución de citocinas hepáticas a una respuesta de fase aguda sistémica y un escenario pro-inflamatoria prolongada, especialmente en un entorno complejo como la enfermedad renal crónica. Desde el estudio de complejos mecanismos de la inflamación in vivo sigue siendo un reto, uso intensivo de recursos y por lo general requiere el uso de animales transgénicos, hepatocitos aislados primarios proporcionan una herramienta robusta para obtener información mecanicista en la respuesta de fase aguda hepática. Dado que esta técnica in vitro cuenta con costes moderados, alta reproducibilidad y el conocimiento técnico común, hepatocitos aislados primarios también se pueden utilizar fácilmente como un criterio de selección. A continuación, describimos un método basado en enzimática para aislar hepatocitos murinos primarios, y se describe la evaluación de una respuesta inflamatoria en estas células utilizando ELISA y cuantitativa en tiempo real PCR.

Introducción

La enfermedad renal crónica (ERC) se puede definir como un estado de inflamación aguda y crónica ^1. En los pacientes con enfermedad renal crónica, los niveles séricos del factor de crecimiento de fibroblastos hormona fosfatúrica 23 (FGF23) aumentan progresivamente con el fin de mantener la homeostasis del fosfato sérico ^2. Aumento de los niveles de FGF23 en suero se asocian de forma independiente con la morbilidad y la mortalidad cardiovascular en los pacientes que inician el tratamiento de hemodiálisis ^{3, 4.} Además, varios estudios clínicos han demostrado una fuerte correlación entre los niveles de FGF23 elevadas y los niveles séricos de proteína C-reactiva (CRP), la interleucina-6 (IL-6) y factor de necrosis tumoral α (TNF) ^{5, 6.} Por otra parte, en un estudio experimental, se ha demostrado recientemente que FGF23 puede dirigirse directamente a los hepatocitos y causar una respuesta inflamatoria mediante el aumento de la PCR y la IL-6 producción en el hígado ^7. Por lo tanto, FGF23 podría actuar como un factor circulante que contribuye a la inflamación sistémica en la ERC.

A principios de los 70, los hepatocitos primarios fueron aislados y estudiados por primera vez ^8. Desde entonces las células hepáticas de cultivo primario se han utilizado ampliamente para examinar el procesamiento metabólico, la función hormonal, el metabolismo de fármacos y toxicidad, así como la inmunidad y respuestas inflamatorias ^{9, 10.} Protocolos anteriores han descrito principalmente el aislamiento enzimático de hepatocitos primarios a partir de tejido de hígado humano ^{11, 12.} Mientras que un modelo excelente, esto deja fuera la capacidad de estudiar cómo la manipulación genética afecta a los mecanismos de señalización hepática complejos, así como consecuencias funcionales sobre diferentes tipos de estímulos. En lo que sigue, se describe el aislamiento de hepatocitos primarios murinos. En particular, el efecto de varios mediadores de la respuesta de fase aguda hepática, tales como lipopolisacárido (LPS), IL-6 y FGF23 se puede analizar de una manera fácil, rápida y reproducible ^13.

En este documento, se presenta un protocolo para el aislamiento enzimático de los hepatocitos de ratones adultos, y demostramos que inductores establecidos de la inflamación, tales como LPS e IL-6, así como los mediadores inflamatorios novedosos como FGF23, pueden estimular directamente la expresión y secreción de citoquinas inflamatorias, tales como la PCR y la IL-6 en hepatocitos cultivados.

Protocolo

Todos los animales protocolos y procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad de Miami Miller School of Medicine.

1. Preparación

1. medios de perfusión hepática de precalentamiento y el hígado digerir los medios de comunicación en un baño de agua a 37 ° C.
2. Configurar una bomba de perfusión (30 ml / min). Cuidadosamente llenar previamente el sistema de tubos de la bomba con los medios de la perfusión del hígado. Evitar las burbujas de aire en el sistema y preparar el microscopio estereotáctica.
3. Escudo placas de cultivo celular utilizando el colágeno de tipo I de acuerdo con el protocolo del fabricante.

2. Recuperación de hígado

1. Anestesiar al ratón donante utilizando oxígeno / inhalación de isoflurano (isoflurano al 4% / 2 L / min de oxígeno).
   1. Mantener la anestesia mediante la reducción de isoflurano al 2-2,5% o mediante la inyección de ketamina (100 mg / kg de peso corporal por vía intraperitoneal) y xilazina (10 mg / kg de peso corporal intraperitoneally). Se prefiere la anestesia con isoflurano continua desde la ketamina disminuye la presión arterial y puede causar hepatotoxicidad.
2. Coloque el ratón anestesiado sobre una almohadilla absorbente. Fijar las extremidades del ratón con cinta adhesiva.
3. Afeitarse y desinfectar el abdomen del ratón y realizar una laparotomía ventral desde el pubis hasta el borde craneal del hígado utilizando tijeras quirúrgicas con puntas afiladas / romos. Incisión en la pared abdominal para ambos lados, caudal del diafragma.
4. Exponer a la vena cava inferior (IVC) moviendo con cuidado el intestino hacia el lado derecho. diseccionar cuidadosamente el tejido graso alrededor de la vena cava inferior utilizando hisopos de algodón estériles con punta y pinzas de punta en ángulo.
5. Incisión en el diafragma suprahepática y abrir la cavidad torácica por dos incisiones laterales utilizando tijeras quirúrgicas finas con puntas cortantes / punzantes. Se liga el IVC torácica usando la seda quirúrgica (5/0).
6. Canular la vena cava inferior infrarrenal mediante un catéter iv blindado, retire con cuidado la aguja,conectar la bomba de perfusión y empezar la perfusión del hígado. Si se realiza correctamente, el hígado debe comenzar inmediatamente a palidecer y oleaje.
7. Seccionar la vena portal que permite el drenaje adecuado de los medios de perfusión de sangre y el uso de tijeras quirúrgicas finas.
8. Perfundir el hígado con aproximadamente 30 ml de medio de perfusión del hígado, y luego cambiar a digerir el hígado medios (30 ml). Apagar la bomba de perfusión y retirar la cánula de perfusión una vez que se haya completado.
9. exponer suavemente la región central del hígado y localizar el tejido que conecta la vinculación de los lóbulos hepáticos. Coge las fibras que conectan centrales y cuidadosamente diseccionar todos los tejidos que sostienen el hígado en su lugar y retire con cuidado el hígado.
10. transferir inmediatamente el hígado en un tubo cónico de 50 ml de polipropileno que contiene 15 ml de hígado digerir medios de comunicación.
    NOTA: No hay línea de tiempo específico para este paso. Después de la perfusión, el hígado se mantiene en los medios de digerir para el transporte a una campana de cultivo celular estéril. todo spasos ubsequent deben llevarse a cabo en un ambiente estéril.

3. Aislamiento y tratamiento de las células

1. Dentro de una campana de cultivo celular, transferir el hígado a partir de la que contiene el medio de digestión 50 ml tubo cónico de polipropileno en una placa de cultivo tisular estéril.
2. El uso de pinzas estériles, arrancar suavemente los cuatro lóbulos del hígado. Si se realiza correctamente, medio digestión debería ser turbia debido a aislar los hepatocitos del hígado.
3. Utilizando una punta de pipeta estéril 25 ml, se filtra el medio de digestión turbia a través de un filtro de células de nylon 70 micras en un nuevo tubo cónico de 50 ml de polipropileno para eliminar las partículas de tejido sin digerir y los restos celulares.
4. Repita los pasos 3,2 y 3,3 con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Esto ayuda con la eliminación de cualquier hepatocitos residuales desde el hígado.
5. Centrifugar a 50 xg durante 2 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante que contiene los restos celulares exceso y suavemente las células en 25 ml 1x frío resuspenderWilliams Medio E.
6. Con una punta de pipeta estéril de 25 ml, se filtra la resuspensión a través de un nuevo 70 micras filtro de células de nylon en un tubo de 50 ml cónico de polipropileno para lograr una suspensión más limpio.
7. Repetir los pasos 3.5 y 3.6 por tres lavados adicionales utilizando frío Williams 'E Medium 1x para obtener una suspensión de células más clara.
8. Después de la etapa de lavado final, se aspira el sobrenadante para eliminar los restos celulares en exceso. Vuelva a suspender las células y el filtro en 25 ml cálida Williams Medios E 1x que contiene la descongelación de los hepatocitos primarios y suplementos chapado a través de un nuevo 70 micras filtro de células de nylon en un tubo de 50 ml cónico de polipropileno.
9. Recuento de células dentro de la suspensión de células 25 ml usando un hemocitómetro. En promedio esperar 15 - 20 millones de células por hígado adulto. Determinar la viabilidad celular mediante la tinción de azul de tripano.
10. células de la placa en 2 ml de Williams 'Medios E 1x que contiene la descongelación de los hepatocitos primarios y suplementos que platean en un ce recubierto de 6 pocillos colágenoclúster cultura ll (9 x 10 ⁵ células por pocillo).
11. Después de 4 h, cambiar el medio de Williams E 1x medios de comunicación que contiene suplementos de mantenimiento de hepatocitos primarios.
12. Después de 24 h, el suero de hambre células con medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) medios 1x para 6 h.
13. Tratar las células con PBS como vehículo, FGF23 (25 ng / ml), LPS (100 mg / ml) o IL-6 (50 ng / ml) en medio libre de suero y se incuba durante 24 h.

4. Aislamiento de ARN

1. Preparar ARN utilizando un kit de columna de centrifugación comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5. Generación de ADNc a partir de ARN aislado mediante transcripción inversa

1. Añadir 200 ng de ARN aislado de la muestra a un tubo de PCR.
2. Añadir 14 l de endonucleasa libre de _H2O para PCR tubo desde el paso 5.1.
3. Añadir 4 l de transcriptasa inversa para tubo de PCR de la etapa 5.1.
4. Vuelva a suspender contenidos suavemente para hacer la mezcla homogénea; centrifugar suavemente.
5. Coloque el tubo de PCR que contiene la mezcla en un termociclador. termociclador de gestión para la transcripción inversa: 1 ciclo de 25 ° C (5 min), 42 ° C (30 min), 85 ° C (5 min) y luego mantenga a 4 ° C. El producto final será el ADNc deseado.

6. Análisis de las células por cuantitativos PCR en tiempo real (qPCR)

1. Preparar la placa de 96 pocillos.
   1. Colocar todos los componentes de reacción en hielo qPCR: 1 l de ADNc, 0,25 M de cebador directo, 0,25 M de cebador inverso, 5 l SYBR Green, 3,5 l de agua de grado PCR en un volumen total de 10 mL. Utilizando SYBR Green, preparar la mezcla maestra para ejecutar todas las muestras por triplicado.
   2. Una vez que la mezcla principal se completa, vórtice para hacer homogénea. Alícuota de 9 l de qPCR mezcla maestra en cada pocillo de una placa de 96 WLL. Después, añadir cuidadosamente 1 l de ADNc en cada pocillo. volumen total de reacción se convertirá en 10 mL.
   3. Después de la carga es completa, sellar la placa de 96 pocillos con ópticopelícula adhesiva y brevemente centrífuga placa de 96 pocillos (50 xg durante 1 min).
2. Las muestras se ejecutan en un instrumento de PCR en tiempo real. Coloque sellada placa de 96 pocillos en el Real-Time PCR instrumento y las muestras se ejecutan como las recomendaciones del fabricante del instrumento. Ejemplos de ciclos estándar y rápidos se incluyen a continuación.
   1. Para parámetros de los ciclos estándar, utilice la siguiente: desnaturalización inicial a 94 ° C durante 120 s, y luego 40 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 60ºC durante 60 s, y luego mantenga opcionalmente a 4 ° C.
   2. Para los parámetros de ciclo rápido: utilizar el siguiente: desnaturalización inicial a 94 ° C durante 30 s, luego 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s, 58 ° C durante 15 s, y luego 72 ° C durante 10 s.
3. Consulte el manual del instrumento para orientación sobre cómo analizar los datos.

7. Análisis de los sobrenadantes celulares por ELISA

NOTA: Todos los pasos se llevan a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante.

1. Preparación de la muestra
   1. Dispensar 398 l de diluyente en tubos separados. Pipetear 2 l de la muestra de sobrenadante de células en el tubo de diluyente 398 l. Esto proporcionará un pliegue dilución de 200.
   2. Repita el paso 7.1.1 para cada muestra a analizar.
2. Procedimiento
   1. Pipetear 100 l de 200 veces muestra diluida y un estándar en los pocillos de una placa de 96 pocillos.
   2. Incubar la placa de 96 pocillos a 25 ° C durante 45 min en un agitador de microplacas a 150 rpm.
   3. Lavar los pocillos 5 veces con solución tampón de lavado 1x. Una vez que se ha completado el último lavado, eliminar la solución de lavado residual con papel absorbente.
   4. Añadir 500 l de reactivo de conjugado de HRP en cada pocillo.
   5. Repita los pasos 7.2.2 - 7.2.3.
   6. Pipetear 100 l de tetrametilbencidina (TMB) de reactivo en cada pocillo de placa de 96 pocillos.
   7. Mezclar suavemente placa de 96 pocillos a 25 ° C durante 20 min en una microplacaagitador a 150 rpm. Detener la reacción añadiendo directamente a 100 l de solución de parada a cada pocillo y mezclar suavemente. Una vez que se añade la solución de paro debe girar el color amarillo. Este informa que la solución de paro se ha mezclado correctamente.
   8. El uso de un lector de placa de microtitulación, determinar la densidad óptica a 450 nm dentro de la primera 5 min.
3. Cálculo de los resultados
   1. Calcular una tabla de valores de absorbancia promedio (A ₄₅₀₎ para cada muestra y cada estándar.
   2. Montar una curva de calibración graficando la media _A450 de cada estándar frente a su concentración estándar en ng / ml en un gráfico lineal. Permitir que el eje x para representar la concentración y el eje y para representar un ₄₅₀ valores.
   3. Utilizando el referimos a un ₄₅₀ de cada muestra diluida, determinar la concentración de la proteína deseada en ng / ml de la curva estándar.
   4. Multiplicar la concentración de la muestra por la dilución de factor. Esto permitirá que para la determinación de la concentración real de la proteína deseada en la muestra de sobrenadante de células.
   5. Trazar la mesa construida a partir de muestras en un gráfico de líneas. Si OD ₄₅₀ valores se encuentran fuera de la curva estándar, las muestras deben diluirse apropiadamente y volver a probar.
   6. Normalizar los resultados a 500.000 células.

Resultados

Histología

Imágenes de microscopía de luz representativos de células aisladas y cultivadas primarias se representan en la Figura 1A. El análisis inmunocitoquímico demuestra que los hepatocitos aislados altamente expresan albúmina (rojo), así como el factor de crecimiento de fibroblastos receptor 4 (FGFR4) (verde). Los núcleos se tiñeron con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) (azul). (Figura ...

Discusión

Aislamiento de hepatocitos primarios de ratones es una herramienta rápida, de bajo costo y fiable para estudiar las respuestas inflamatorias ex vivo. Si se realiza correctamente, los resultados pueden ser fácilmente generados y reproducen de una manera oportuna y rentable. Los siguientes puntos deben ser cuidadosamente evaluados con el fin de garantizar un éxito en el aislamiento.

La incisión quirúrgica y la canulación de la vena cava inferior se deben realizar bajo anestesia ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer	Falcon	352350
BD Insyte Autoguard	BD	381412
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
100 6-inch Cotton Tipped Applicators	Puritan	806-WC
1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2	Becton Dickinson	329420
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style	Corning	353003
6 well Cell Culture Cluster	Costar	3516
5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards)	LOOK	SP115
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Minipuls 3 Perfusion Pump	Gilson	F155007
Hemacytometer Kits, Propper	VWR	48300-474
Hemacytometer Cover Glasses, Propper	VWR	48300-470
Surgical Scissers - Sharp/Blunt	F.S.T.	14001-12
Iris Scissors-ToughCut Straight	F.S.T.	14058-11
Dumont SS-45 Forceps	F.S.T.	11203-25
Student Tissue Forceps	F.S.T.	991121-12
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetic acid solution, 2.0 N	Sigma	A8976-100ML
Isoflurane, USP 250 mL	Piramal Healthcare	66794-013-25
KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL)	VEDCO	50989-161-06
Xylazine 100 mg/mL	AnaSed Injection	139-236
Willams' Medium E (1x)	gibco	12551-032
Liver Perfusion Medium (1x)	gibco	17701-038
Liver Digest Medium (1x)	Life Technologies	17703034
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements	Life Technologies	CM3000
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements	Life Technologies	CM4000
Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4	ThermoFisher scientific	10010031
Collagen Type 1	Corning	354236
Trypan Blue Solution	VWR	45000-717