El escalado de Engineered injertos vasculares Usando 3D Impreso guías y el método de anillo de apilamiento

Resumen

vasos sanguíneos de ingeniería escalables mejorarían aplicabilidad clínica. El uso de guías fácilmente considerables 3D-impreso, anillos de músculo liso vascular se crearon y se apilan en una forma tubular, formando un injerto vascular. Los injertos pueden ser de un tamaño para cubrir la gama de dimensiones de las arterias coronarias humanas, simplemente cambiando el tamaño de la guía de 3D-impreso.

Resumen

La enfermedad coronaria sigue siendo la principal causa de muerte, que afecta a millones de estadounidenses. Con la falta de injertos vasculares autólogos disponibles, los injertos de ingeniería ofrecen un gran potencial para el tratamiento del paciente. Sin embargo, los injertos vasculares de ingeniería generalmente no son fácilmente escalable, lo que requiere la fabricación de moldes personalizados o tubos de polímero con el fin de personalizar a diferentes tamaños, lo que constituye una práctica que consume tiempo y costoso. arterias humanas varían en diámetro de lumen de aproximadamente 2,0 a 38 mm y espesor de pared de alrededor de 0,5 a 2,5 mm. Hemos creado un método, denominado el "Método de apilado Anillo", en el que los anillos de tamaño variable de tejido del tipo celular deseado, demostraron aquí con las células del músculo liso vascular (SMC), se pueden crear utilizando guías de postes centrales para controlar la luz de diámetro y capas exteriores que dictan espesor de la pared del vaso. Estos anillos de tejido entonces se apilan para crear una construcción tubular, imitando la forma natural de un vaso sanguíneo. La longitud del recipiente puede be adapta simplemente apilar el número de timbres necesarios para constituir la longitud necesaria. Con nuestra técnica, los tejidos de formas tubulares, similar a un vaso sanguíneo, pueden fabricarse fácilmente en una variedad de dimensiones y longitudes para satisfacer las necesidades de la clínica y el paciente.

Introducción

En el tratamiento de la enfermedad arterial coronaria (CAD), los propios vasos sanguíneos de un paciente se cosechan como material de injerto para la cirugía de bypass. Sin embargo, a menudo, los pacientes con enfermedades no tienen vasos viables para donar a sí mismos, y en los casos en que lo hacen, la zona donante causa considerables daños adicionales y tiene un grave riesgo para la infección. ¹ injertos vasculares de ingeniería podrían llenar esta necesidad. La escalabilidad es de suma importancia para los buques de ingeniería con el fin de satisfacer la amplia gama de requisitos de tamaño de recipiente de los pacientes. Sin embargo, los métodos actuales para los buques de ingeniería no son fácilmente escalables, y por lo general requieren de nueva fabricación de moldes complejos o estructuras de polímeros. La mayoría diseñados injertos o bien utilizan un andamio tubular de polímero que se siembra con fibroblastos vasculares, músculo liso, o células endoteliales; o rodar una lámina de células alrededor de un mandril para crear un tubo de tejido. Dos injertos vasculares artificiales en los ensayos clínicos se basan en una decellularizeplataforma de polímero ECM d. ^{2, 3, 4} injertos de polímeros disponibles para su uso en la reparación vascular ya se sabe que tienen problemas con la permeabilidad, lo que podría surgir como un problema importante con la aplicación a largo plazo de un injerto con una presencia sostenida de polímero. Moldes tubulares se han utilizado para fabricar completamente vasos celulares, ^{5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13} que los procedimientos requerirían diseño adicional y la fabricación de herramientas para moldes personalizados con el fin de producir los vasos en una variedad de tamaños .

El método descrito en la presente memoria abarca una nueva técnica para la creación vascular ingeniería fácilmente escalableinjertos utilizando insertos impresos en 3D personalizables y placas de cultivo tradicionales. ¹⁴ Las células se sembraron en placas con inserciones de un poste central y la carcasa exterior. Los controles a posteriori diámetro de la luz y permite que la monocapa de células que se auto-ensamblan en un anillo de tejido. El exterior de espesor controles de concha del anillo, y por lo tanto el espesor de pared del recipiente final. anillos de tejido terminadas se apilan para formar un tubo, injerto vascular. La ventaja de este método, denominado "Método de apilado Ring," es que cualquier tipo de célula adherente se puede sembrar en la configuración de placas y anillos de tejido o tubos de cualquier tamaño necesario para la aplicación deseada puede ser generada por una simple modificación de los insertos de guía. Técnicas comparativas en el tejido de ingeniería que crea los anillos de tejido siguen siendo difíciles de escala, ^{15, 16} que requiere refabricación de moldes para cada tamaño deseado. Además, los injertos vasculares hechas usando este método se pueden producird en 2-3 semanas, varias semanas más rápido en comparación con otros buques de ingeniería. ⁶ Para la clínica, esta discrepancia de tiempo puede hacer una diferencia significativa en el tratamiento de un paciente deterioro.

Protocolo

1. Preparación de cultivo celular

1. Utilizar las células del músculo liso aórticas humanas adquiridos comercialmente.
2. Mantener las células en medio de crecimiento de células musculares lisas compuestas de 88,6% 231 medios de comunicación, 0,1% cada uno de insulina recombinante humana (rH-insulina), factor de crecimiento de fibroblastos humano recombinante (rH-FGF), factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (rH-FGF), y ácido ascórbico; y 5% cada uno de suero bovino fetal (FBS) y L-glutamina; y 1% de antibiótico / antimicótico.
   NOTA: Cada factor de crecimiento, FBS y L-glutamina se compran como un kit de crecimiento de los medios vascular.
3. Cambio de medio cada 48 horas hasta que las células son aproximadamente el 90% de confluencia y listo para la siembra de tejido.
4. almacenar células en una incubadora de entre los cambios medios para la expansión.

2. Preparación de 3D Printed Insertos y costumbre de silicona moldeada placas

1. Utilice una impresora 3D comercial (por ejemplo, Replicador Mini) para la impresión en 3D los insertos de placas.
   1. utilice opes fuente de software de diseño 3D como Blender para crear los modelos 3D de las carcasas externas y mensajes impresos.
   2. Exportar archivo del controlador del modelo a través de un formato STL lo que permite la portabilidad de software de la impresora 3D.
   3. Producir mensajes impresos y capas exteriores utilizando poli filamento (ácido láctico) (PLA) cargado en la impresora 3D.
   4. Después de la impresión, lleve a cabo a 30 minutos en remojo en una solución de etanol al 70% -100% para esterilizar cada inserto.
2. Preparar un agente de curado 01:10 basar mezcla de polímero de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) de polímero de silicona y permitir que la mezcla se desgasifica a temperatura ambiente durante 10 min.
   1. Definir tamaños Placa de Petri utilizados tan pequeño (35 mm), intermedio (60 mm) y grandes (100 mm).
   2. Añadir 2 ml, 4 ml y 6 ml de silicona sin curar a cada placa pequeño, medio y grande, respectivamente, y crear una capa fina a través de toda la parte inferior de la placa de Petri.
   3. Crear puestos para la pequeña placa mediante el vertido de PDMS en una100 mm de placa a una altura de 7 mm y dejarla curar sobre una placa caliente a 60 ° C durante aproximadamente 2-3 horas. A continuación, utilice un punzón de biopsia 5 mm para perforar mensajes cilíndricos. Use una pequeña cantidad de PDMS sin curar para asegurar cada PDMS cilindro y al centro de cada placa pequeña.
   4. Para las placas intermedias y grandes, antes de completar el curado de los PDMS en la parte inferior de la placa, coloque los mensajes impresos 3D 10 mm y 20 mm de diámetro centralmente en cada uno de placas intermedias y grandes, respectivamente. Para las planchas, además, colocar una capa exterior impresa en 3D sobre 66,7 mm de diámetro equidistancia del poste.
      1. Deje que cada plato se cure al aire libre sobre una placa caliente a 60 ° C durante aproximadamente 2-3 horas, lo que permite 18 horas para la desgasificación del polímero. Fijar componentes impresos a la placa en la región apropiada y la orientación como se ve en la Figura 1.
   5. Añadir una solución de 70% de etanol con agua destilada 30% durante 30 minutos en el interior de todas las plates para la esterilización y luego cubrir cada placa.
   6. aspirar cuidadosamente el etanol a partir de cada placa y dejar secar al aire.
   7. Colocar en cada plato en una cabina de seguridad biológica (BSC) al lado de su tapa, boca arriba. Exponer las placas y tapas a la luz UV bajo el BSC durante 30 minutos para completar la esterilización. La técnica estéril se realiza con cada paso después de la exposición UV.

3. Preparación de hidrogel de fibrina, la siembra con células musculares lisas y mantenimiento de placas

1. Mezcle una solución de gel de fibrina que contiene medio de cultivo + 0,01% TGF-β1 en las cantidades de 0,5 ml, 1,1 ml y 1,81 ml de tamaños pequeños, intermedios y grandes placas, respectivamente.
   1. Añadir 40 l, 88,4 l y 145 l de trombina, de un stock de 100 U / ml, a los medios de comunicación de cada placa pequeño, medio y grande, respectivamente. Hacer girar suavemente cada placa con la mano para asegurarse de que la trombina se mezcla uniformemente dentro de los medios de comunicación.
   2. A continuación, añadir 1601; L, 354 ly 580 l de fibrinógeno, a partir de un stock de 20 mg / ml, gota a gota circularmente a la mezcla de trombina medios de comunicación para cada plato pequeño, medio y grande, respectivamente. Hacer girar suavemente con la mano para asegurar la mezcla y distribución del hidrogel en una capa uniforme.
   3. Permitir hidrogel para curar durante 10-15 minutos a temperatura ambiente.
2. Trypsinize células del músculo liso se expandieron en placas de cultivo celular de 150 mm y centrífuga de acuerdo con protocolos estándar. El sedimento resultante se debe resuspendió en 3 ml de medio de diferenciación que consta de 98% - 231 medios de comunicación, 1% de FBS y 1% de antibiótico / antimicótico.
   1. Mezclar vigorosamente las células mediante la valoración de arriba abajo con una pipeta de 2 ml para romper los agregados celulares. Contar las células con un hemocitómetro y crear una suspensión celular de 2 x 10 ⁶ células / ml, 1,0 x 10 ⁷ células / ml y 1,4 x 10 ⁷ células / ml para las placas pequeñas, medianas y grandes, respectivamente.
   2. Añadir 1 ml de cada suspensión de células intOA correspondiente 50 ml cónico etiquetado pequeño, medio y grande. Configurar una cónica 50 ml adicionales de esta manera para cada anillo de tejido adicional deseado.
   3. Añadir medio de diferenciación a cada cónica para obtener volúmenes de siembra final de 2 ml, 4 ml y 5 ml para cada recipiente pequeño, medio y grande, respectivamente. Entonces, pipetear cuidadosamente la solución de células gota a gota en la parte superior del hidrogel preparado en cada placa correspondiente.
   4. Colocar las placas en la incubadora a 37 ° C y 5% de _CO2.
3. Cambio de medio de diferenciación cada 48-72 horas para cada plato. En el caso de la placa más grande, cambiar los medios inicialmente después de 24 horas, a continuación, cambiar cada 48-24 horas para compensar la gran densidad de la siembra de células.
   1. Después de 2-4 días como los anillos se han contraído completamente hacia dentro de la entrada, añadir 10 l, 20 ly 35 l de TGF-β1 a cada anillo pequeño, medio y grande, respectivamente. Después de la exposición a TGF-β; 1 durante al menos 24 horas, los anillos están listos para ser manipulados.

4. Montaje de vasculares construyen y mantenimiento

1. Antes de la fabricación de la construcción vascular final, un recipiente especializado se crea para sostener el recipiente completado.
   1. Para la pequeña embarcación, crear una placa de altura de apilamiento anillo cortando una sección de 2 pulgadas de la parte superior de un tubo cónico de 50 ml de policarbonato, y luego PDMS pegar el borde del corte en una placa de 35 mm. Utilice la tapa cónica como la tapa de la placa.
   2. Para el anillo de altura recipiente intermedio y grande apilar placas, cortar un tubo de policarbonato de diámetro 1,75 pulgadas en secciones de 2,5 pulgadas a lo largo para servir como las paredes de la placa de altura. Para las partes inferiores de la placa de altura, cortar una lámina de policarbonato de 0,125 pulgadas de espesor en piezas de círculo de diámetro de 2 pulgadas. El uso de cemento solvente acrílico, obligar a la sección de tubo de policarbonato a la pieza de corte circular. Utilice la tapa de una placa de Petri de 60 mm como la tapa de la placa de altura.
   3. 3D ppuestos de Rint 5, 10 y 20 mm de diámetro y 50 mm de longitud.
   4. Añadir 10 ml de silicona sin curar a cada recipiente. Antes de la curación completa de los PDMS, colocar centralmente cada puesto creado en el paso 4.1.3 en cada recipiente pequeño, intermedio, y grande.
   5. Deje curar en un conjunto de placa caliente a 60 ° C durante 2-3 horas.
   6. Esterilizar con una solución de 70% de etanol con agua destilada 30% durante 30 minutos.
   7. aspirar cuidadosamente el etanol a partir de cada recipiente y se deja secar al aire en el BSC. A continuación, colocar los contenedores en la campana con cada placa colocada al lado de su tapa, boca arriba. Exponga los envases a la luz UV bajo el BSC durante 30 minutos para su posterior esterilización. Utilice una técnica estéril a cada paso después de la exposición UV.
2. Con unas pinzas muy finas, quitar con cuidado cada anillo hidrogel músculo liso firmemente enrollado de su puesto y transferir a su correspondiente contenedor más grande con los postes altos.
   1. Use un par defórceps en cada mano y levantar un lado del anillo del poste, y luego el otro. Tenga cuidado para proteger y mantener el lumen.
   2. Realizar la transferencia con este método de dos manos, introduciendo primero un lado y luego al otro lado del anillo en el poste alto. Usando movimientos suaves y graduales, y trabajando circunferencialmente, empujar lentamente el anillo hacia abajo en el poste alto. Posteriormente apilar los anillos de tejido hasta que se haya obtenido la eslora del buque se desea, con cada anillo de la adición de aproximadamente 1-2 mm de longitud a la construcción completado.
3. Con la pila de anillo colocado en los postes altos impresas en 3D, gire la placa de modo que el mensaje es en paralelo con la superficie de trabajo.
   1. Usando una micropipeta, añadir 40, 80 y 160 l de trombina a una concentración de 100 U / ml suavemente a la superficie exterior de cada recipiente pequeño, medio y grande, respectivamente. Mientras que la adición de la trombina, gire lentamente la placa para asegurar una cobertura uniforme de todas las superficies de la construcción.Esta será la base para la cola de fibrina utilizada para asegurar la construcción de pila de anillo en los primeros días después de la construcción.
   2. A continuación, añadir 40, 80 y 160 l de fibrinógeno a una concentración de 20 mg / ml a cada construcción pequeño, intermedio, y grande, respectivamente, usando una micropipeta mientras gira el constructo rápidamente. La trombina y fibrinógeno establecen rápidamente en un gel firme una vez mezclada. Debido al tiempo de curado corto, aplicar el fibrinógeno como de forma rápida y uniformemente como sea posible.
4. Añadir 20 ml de medio de diferenciación a cada recipiente que contiene el constructo. Coloque los vasos en una incubadora a 37 ° hasta que se necesite. Cambio de medio cada 3-5 días.

Resultados

Se ha demostrado aquí es la fabricación de 3 tamaños diferentes de ingeniería vascular del injerto (Figura 1), lo que demuestra que el Método de apilado Anillo (RSM) es escalable. Para demostrar la aplicabilidad, los 3 tamaños de los buques diferentes elegidos correlato a tamaño real vehículo humano de la arteria descendente anterior izquierda (pequeño; diámetro de la luz = 4 mm) ^17, la aorta descendente (intermedio; diámetro de la luz ...

Discusión

El Método de apilado Anillo presenta múltiples ventajas sobre las técnicas de construcción de tejido de ingeniería vasculares actuales. La RSM puede ser adaptado para crear vasos humanos de cualquier tamaño simplemente la personalización de las dimensiones de correos y la capa externa. Nuestro método permite el desarrollo de los vasos de ingeniería libre de polímero compuesto solamente de las células humanas y rápida degradación material de soporte que se encuentra en proceso de cicatrización de la herida ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Aortic Smooth Muscle Cells	ATCC	PCS-100-012	vascular smooth muscle cells
Medium 231	Gibco (Life Technologies	M-231-500	media specific to vascular smooth muscle cells
Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PSC-100-042	growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability
Replicator Mini 3D printer	MakerBot	N/A	3D printer
Poly(lactic acid) 3D ink (PLA)	MakerBot	N/A	3D printer filament
Poly(dimethlysiloxane) (PDMS)	Ellworth Adhesives	3097358-1004	polymer for gluing plate parts
Fibrinogen	Hyclone Labratories, Inc.	SH30256.01	fibrin gel component
Thrombin	Sigma Life Sciences	F3879-5G	fibrin gel component
Tranforming Growth Factor-Beta 1	PeproTech	100-21	growth factor for stimulating collagen production
Hemocytometer	Hausser Scientific Co.	3200	for cell counting
Polycarbonate tubing	US Plastics	PCTUB1.750X1.625	material for making tall, ring stacking plates
Polycarbonate sheet	Home Depot	409497	material for making tall, ring stacking plates
Adhesive polymer solvent	SCIGRIP	10799	material for making tall, ring stacking plates
Instron 5940	Instron	N/A	tensile testing machine
U-Stretch	Cell Scale	N/A	tensile testing machine
Smooth Muscle Actin	MA5-11547	Thermo Fisher	antibody
Tropomyosin	MA5-11783	Thermo Fisher	antibody