los<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organo cultura y su uso en estudios de defensa antimicrobiana de host

Resumen

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

Resumen

El intestino muestra una arquitectura de cripta estructuras repetitivas que consisten en diferentes tipos de células epiteliales, lámina propia que contiene células del sistema inmune, y el estroma. Todas estas células heterogéneas contribuyen a la homeostasis intestinal y participar en la defensa del huésped antimicrobiana. Por lo tanto, la identificación de un modelo sustituto para el estudio de la respuesta inmune y la actividad antimicrobiana del intestino en un entorno in vitro es extremadamente difícil. Los estudios in vitro con líneas de células epiteliales intestinales inmortalizadas o incluso cripta primaria organoid cultura no representan la fisiología exacta del intestino normal y su microambiente. Aquí, se discute un método de tejido de colon cultivo ratón en una placa de cultivo y cómo este ex vivo sistema de cultivo de órganos se puede implementar en estudios relacionados con las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos. En experimentos representativos, se demostró que dos puntos en cultivo de órganos expresan péptidos antimicrobianos en respOnse a exógenos IL-1β y IL-18. Además, las moléculas efectoras antimicrobianos producidos por los tejidos de colon en el cultivo de órganos matan eficientemente Escherichia coli in vitro. Este enfoque, por lo tanto, puede ser utilizado para diseccionar el papel de patrones moleculares de patógenos y asociado de peligros y sus receptores celulares en la regulación de la respuesta inmune innata intestinales y las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos.

Introducción

El intestino representa un sistema dinámico que actúa como una barrera para los microorganismos comensales, lucha contra los patógenos invasores, y regula la composición microbiana ^1. Las células epiteliales intestinales, que consta de los enterocitos, células caliciformes, células de Paneth y células enteroendocrinas, son las principales poblaciones de células que proporcionan las respuestas de defensa del huésped contra microbiota intestinal. Las células caliciformes producen mucinas que crean una zona desmilitarizada en la parte superior de la capa epitelial ^2. Las células de Paneth y enterocitos producen péptidos antimicrobianos, citoquinas, y las especies de oxígeno y nitrógeno reactivos que constituyen las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos y contribuyen a la formación de la composición microbiana intestinal ^{3, 4.} Además de las células epiteliales, las células inmunes incluyendo macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, células asesinas naturales, linfocitos y inna células linfoides de TE en la lámina propia y la submucosa juegan un papel crítico en las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos intestinales por citoquinas que producen, quimiocinas, y otros mediadores de ^{5 - 7.} Con el fin de entender cómo el sistema inmune de la mucosa regula microbiota y proporciona protección contra la infección microbiana, es importante tener en cuenta la compleja interacción de las poblaciones de células heterogéneas de la tripa. Sin embargo, un modelo in vitro que abarca todas las características del intestino no está disponible. Por lo tanto, los estudios moleculares en la interacción huésped-patógeno en el intestino son muy desafiante.

En los últimos años, varios sistemas de modelos que imitan aspectos de la mucosa intestinal han sido desarrollados para la investigación de los procesos fisiopatológicos implicados en las enfermedades inflamatorias del intestino (IBD) y otros trastornos gastrointestinales ^{8 -}= "xref"> 14. líneas de células epiteliales intestinales inmortalizadas son a menudo utilizados para estudiar las respuestas específicas de células epiteliales. Sin embargo, debido a la expresión diferencial de genes y la función en las células inmortalizadas, los datos obtenidos del uso de esas células no suelen coincidir con los observados en los estudios in vivo. Cripta intestinal organoid cultura recientemente ha surgido como una herramienta potencial para la evaluación de la respuesta del epitelio intestinal a diferentes estímulos ^13. En este sistema, se permitió que las células madre de la cripta para crecer y desarrollar una estructura organoid 3D. Mientras que el sistema de cultivo organoide es muy útil para el estudio de muchos aspectos del epitelio intestinal, que no imita la compleja interacción de las células inmunes, células epiteliales y productos microbianos. El cultivo ex vivo del tejido intestinal ofrece una mejor representación de las respuestas de defensa en vivo de acogida. En este método, una parte del intestino se cultiva en una placa de cultivo celular ingenioh medios adecuados que permitan a los diferentes tipos de poblaciones de células en el intestino para ser metabólicamente activo durante al menos 48 h. Por lo tanto, un cultivo ex vivo del órgano se puede utilizar para medir la expresión de genes antimicrobianos y las respuestas de defensa del huésped del intestino a un estímulo particular.

Los investigadores han estado utilizando el sistema de cultivo de órganos ex vivo para estudiar las respuestas de defensa del huésped frente a la infección microbiana en el intestino ^{15 de - 21 años.} Recientemente hemos adoptado el sistema de cultivo de órganos para estudiar el papel de la inflamasoma en las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos en colones de ratones ^22. El inflamasoma es una plataforma molecular para la activación de la caspasa-1, que se requiere para la producción de IL-1β madura y IL-18. Hemos demostrado que la IL-1β e IL-18 inducen péptidos antimicrobianos que matan con eficacia pathobionts comensales tales como E. coli . Esta observación fue consistente con el aumento de la carga de E. coli en colones de ratones ^{inflamosoma-22} defectuosa. Este sistema, por lo tanto se puede utilizar para estudiar el papel de los receptores de reconocimiento de patrones (PRRS) y otras moléculas inmunes innatas en las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos intestinales, así como la patogénesis de los trastornos intestinales tales como la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) y el cáncer colorrectal (CRC). Hay más de 200 genes de susceptibilidad IBD, y mutaciones en muchos de estos genes están asociados con la composición microbiana alterada en el intestino. Es de gran importancia clínica para determinar el mecanismo preciso por el que los genes de susceptibilidad IBD-regulan microbiota intestinal. El objetivo general de este método es introducir un protocolo básico de ex vivo de cultivo de órganos de colon y demostrar cómo este método de cultivo se puede utilizar para estudiar las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos del intestino.

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Protocolo

Todos los experimentos aquí descritos se realizaron con ratones de 6-8 semanas de edad de tipo salvaje macho (C57BL6 / J) mantenido en una instalación libre de patógenos específicos (SPF) en el Centro de Recursos Animales (ARC), de UT Southwestern Medical Center. Todos los estudios fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del IACUC y los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Recogida y preparación del colon

1. La eutanasia a los ratones con asfixia de CO ₂ seguido por dislocación cervical.
2. Pulverizar ratones con 70% de etanol y el pin extremidades para fijar una placa de mantenimiento de la cara dorsal del ratón sobre la tabla.
3. El uso de tijeras y pinzas de disección pre-esterilizados, hacer una incisión de línea media en el peritoneo del abdomen. Abrir el abdomen por plegado el peritoneo con fórceps.
4. Retire el intestino desde el wi cavidad abdominalº pinzas de disección y tijeras. Separar el colon desde el intestino delgado mediante el corte en la parte inferior del ciego y el otro extremo en el recto.
5. Coloque el colon en una placa petri estéril que contenía PBS enfriado en hielo. Enjuague el contenido de la luz del colon con PBS enfriado con hielo utilizando una jeringa de 20 ml que sostiene una aguja G 20 o una aguja de sonda oral hasta que la materia fecal dentro de la luz del colon es eliminado por completo.
6. Cortar el colon con tijeras longitudinalmente. Lavar el colon agitando vigorosamente en PBS enfriado con hielo en una placa de Petri estéril.
7. Cortar el tejido del colon en trozos de aproximadamente 1 cm de longitud utilizando un bisturí o tijeras estériles.
8. Anotar el peso de las piezas de colon.
   NOTA: Todos los pasos de la sección 1 se pueden realizar ya sea dentro o fuera de una cabina de seguridad biológica. Una vez que los dos puntos están listos para la cultura, todos los pasos se deben realizar dentro de una cabina de seguridad biológica para mantener la esterilidad.

2. Colon Orguna cultura

1. Coloque un filtro de células (100 micras) en una placa de cultivo de 6 pocillos. Transferencia de todas las piezas de colon obtenidos de un ratón en el filtro de células.
2. Añadir 5 ml de medio DMEM / F12 que contenía 5% de FBS, penicilina-estreptomicina (1x), y gentamicina (20 mg / ml). Cubra completamente las piezas de colon con los medios de comunicación.
3. Incubar durante 2 horas a 37 ° C en una incubadora con 5% de _CO2 y 95% de aire.
4. Levante el filtro de células y aspirar los medios de comunicación.
5. Coloque el filtro de células de nuevo en el pozo y añadir 5 ml de medio fresco sin ningún antibiótico. Levante el filtro de células y aspirar los medios de comunicación.
6. Repita el paso anterior de lavado (Paso 2.5) dos veces más (3x total) para eliminar todos los antibióticos residuales.
7. La transferencia de las piezas de colon de un solo filtro de células en un solo pocillo de una placa de cultivo celular estéril de 12 pocillos.
8. Añadir medio DMEM / F12 que contenía 5% de FBS (sin antibióticos). Ajuste el volumen del medio con el Weight de las piezas de colon, por ejemplo, 1 ml de medio para 100 mg de tejido. Incubar durante 12 horas a 37 ° C en una incubadora inyección de 5% de _CO2 y 95% de aire.
9. Recoger el sobrenadante del cultivo en un tubo estéril de 1,5 ml.
10. Centrifugar a 12.000 xga 4 ° C durante 5 min. Separar el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml para su uso en las bacterias matar ensayo y / u otros ensayos inmunológicos. El sobrenadante se puede almacenar a -80 ° C hasta el ensayo.
11. Recoger las piezas de colon en un tubo para aislamiento de ARN.

3. Ensayo de E. coli Killing

1. Inocular E. coli en ml Luria-Bertani (LB) caldo de 5 en un tubo de 15 ml y se incuba a 37 ° C con agitación a 200 rpm durante la noche. Mantenga la tapa del tubo de cultivo ligeramente suelto.
2. Centrifugar el tubo de cultivo bacteriano a 1200 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento bacteriano en PBS 5 ml de hielo-frío.
3. Transferencia de 1 ml de la BACTsuspensión erial en una cubeta y OD medida a 600 nm. Utilice PBS como blanco.
4. Calcular la unidad formadora de colonias (ufc) utilizando una curva estándar predeterminada. Aquí, se supone que 1 DO = 2 x 10 ⁹ ufc / ml (aproximadamente).
5. Diluir la suspensión bacteriana para hacer la suspensión de acciones 1 x 10 ⁵ ufc / mL.
6. Transferir el sobrenadante de cultivo de órganos de colon (500 l / pocillo) recogidos en la Sección 2.10 en pocillos duplicados de una placa de cultivo celular de 24 pocillos.
7. Añadir 10 l de cultivo de E. coli (1.000 ufc) en un pocillo que contiene 500 l de órganos de colon sobrenadante del cultivo. Deje el otro bien sin ninguna inoculación E. coli para confirmar que el sobrenadante de cultivo de órganos de colon no contiene ninguna contaminación.
8. Incubar el mismo número de bacterias (1.000 ufc) en el medio de cultivo (DMEM / F12 más 5% FBS) sin antibióticos como un control.
9. Incubar a 37 ° C durante 1 h.
10. Colocar 50 l de cada muestra de gota-wiSE en placas de agar MacConkey. Se incuban las placas de agar MacConkey a 37 ° C durante la noche.
11. Contar el número de colonias y calcular el ufc / ml.

4. El efecto de los factores extrínsecos e intrínsecos de colon antimicrobianos Las respuestas de defensa del huésped

NOTA: El ensayo de destrucción antimicrobiana como se describe aquí se pueden adoptar para examinar el efecto de los patrones de patógenos asociados moleculares (PAMPs) y citoquinas sobre la actividad bactericida de sobrenadante de cultivo de órganos. Un ejemplo de tal experimento usando IL-1β y IL-18 se describe a continuación.

1. Suma dos puntos de los ratones como se describe en la Sección 1.
2. Coloque los dos puntos sobre una toalla de papel estéril. Cortar los dos puntos longitudinalmente en tres partes con unas tijeras (Figura 2).
3. Lavar cada parte del colon en PBS frío como se describe en la Sección 1.
4. Corta cada parte del colon en trozos pequeños y se pesa asépticamente. La transferencia de las piezas de cada partede los dos puntos en tres tamices de células separadas (100 M) colocados en tres pocillos de una placa de cultivo celular de 6 pocillos (Figura 2).
5. Añadir 2 ml de DMEM medio / F12 que contenía 5% de FBS, penicilina-estreptomicina (1x), y gentamicina (20 mg / ml).
6. Incubar durante 2 horas a 37 ° C en una incubadora inyección de 5% de _CO2 y 95% de aire.
7. Lavar las piezas de colon como se describe en 2,4-2,6. La transferencia de las piezas de colon de un solo filtro de células en un solo pocillo de una placa de cultivo celular estéril de 12 pocillos. Los tres pocillos que contienen tres partes del colon de un solo ratón deben ser designados como no tratada, IL-1β, IL-18 y (figura 2).
8. Añadir medio DMEM / F12 que contenía 5% de FBS (sin antibióticos). Ajustar el volumen del medio con el peso de las piezas de colon, por ejemplo, 1 ml de medio para 100 mg de tejido.
9. Estimular el cultivo de órganos de colon con IL-1β (20 ng / ml) o IL-18 (20 ng / ml) durante 12 h. El colon sin tratar cultivo de órgano sirve como control.
10. Después de 12 h de incubación a 37 ° C en una incubadora inyección de 5% de _CO2 y 95% de aire, recoger el sobrenadante del cultivo en un tubo estéril de 1,5 ml.
11. Transferir 500 l del sobrenadante del cultivo en pocillos duplicados de una placa de 24 pocillos.
12. Inocular E. coli (1.000 ufc) en el órgano de colon sobrenadante de cultivo como se describe en la Sección 3. Para cada condición, inocular E. coli en un solo pozo. El otro pocillo que contiene sobrenadante del cultivo mismo órgano sin E. coli servirá como control para la contaminación bacteriana.
13. Incubar la misma cantidad de bacterias en medios de cultivo sin antibióticos como un control.
14. Incubar a 37 ° C durante 1 h.
15. Colocar 50 l de cada muestra gota a gota sobre placas de agar MacConkey. Se incuban las placas de agar MacConkey durante la noche a 37 ° C.
16. Contar el número de colonias y calcular el ufc / ml (Figura 4).

e_title "> 5. La medición de la expresión de genes antimicrobianos

1. Después de la incubación durante la noche (12 h) de cultivo de órganos del colon como se describe en las secciones 2 y 4, lavar las piezas de colon con 2 ml de PBS enfriado con hielo (2x).
2. Reunir las piezas de colon en un tubo con tapón de rosca libre de 2 ml de RNasa / DNasa. Colocar los tubos en hielo.
3. Añadir 1 ml de reactivo Trizol comercial y de lisis perlas de matriz en el tubo.
4. Lyse el tejido utilizando un homogeneizador de tejidos automatizada.
5. Recoger el lisado de tejido en un nuevo tubo de microcentrífuga.
6. Aislar el ARN utilizando el protocolo estándar.
7. Medir la concentración de ARN.
8. Diluir RNA apropiadamente con agua desionizada y el uso de 500 ng de ARN para sintetizar cDNA.
9. Utilice el ADNc para análisis en tiempo real de RT-PCR de genes dirigidos antimicrobianos, citocinas, quimiocinas y otros genes de interés.

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Resultados

Una imagen representativa de dos puntos en cultivo de órganos se muestra en la Figura 1. Las piezas de colon en la cultura siguen siendo metabólicamente y fisiológicamente activo. Responden de manera eficiente a los estímulos exógenos añadidos al medio de cultivo. Un flujo de trabajo esquemática de la preparación del tejido del colon para el cultivo ex vivo y la estimulación con estímulos exógenos, por ejemplo, IL-1β y IL-18, se muestra en l...

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Discusión

Las células epiteliales intestinales son muy sensibles en cuanto a sus necesidades de crecimiento y por lo tanto difíciles de cultivar. Las células epiteliales aisladas por tratamiento con EDTA no sobreviven en medios de cultivo celular convencionales, tales como DMEM ^8. Por lo tanto, huésped-patógeno estudios de interacción utilizando cripta aislado o células epiteliales primarias son muy difíciles. Recientemente, Sato et al. se describe un sistema de cultivo organoid cripta, que es muy ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/ F12	Life Technologies	12634-010
Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride	Sigma	5634
FBS, heat inactivated	Sigma	F4135
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15070063
Gentamicin solution	Sigma	G1272
Mouse IL-1b recombinan	Reprokine	RKP10749
Mouse IL-18 recombinant	Reprokine	RKP70380
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Difco Luria-Bertani Broth	BD Bioscience	244620
BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar	Fisher Scientific	DF0075-17-1
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific		Uded to measure RNA concentration
UV/Vis Spectrophotometer	BECKMAN	DU 530	Used to determine E. coli count
iScript RT Supermix, 100 rxns	Bio-Rad	1708841
iTaq Univer SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725125
Lysing Matrix S (1/8"), 2 ml Tube	MP Biomedicals	116925500	Used to homgenize colon organ for RNA isolation
FastPrep-24 5G System	Bio-Rad	116005500
100 mm x 15 mm Petri Dish	Falcon	5687
Plate 6 well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile	Cellstar	5085
100 μm cell strainer	Falcon	5698
Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific
Sorvall ST40R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific
Forma Scientific orbital shaker	Thermo Fisher Scientific