La cuantificación absoluta de Aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; En el LCR utilizando un procedimiento de medición de referencia de espectrometría de masas

Resumen

A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ_1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

Resumen

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (Aβ) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.

An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled Aβ peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF Aβ_1-42 between 150-4,000 pg/mL.

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la forma más común de demencia y afecta a unos 35 millones de personas en todo el mundo ^1. Los signos neuropatológicos característicos de la enfermedad se cree ampliamente que se encuentran en el núcleo de patogénesis de la EA son los ovillos neurofibrilares intracelulares de proteína Tau hiperfosforilada y ² placas extracelulares que consisten en agregados de beta-amiloide (Aß) péptidos ^3. En línea con esto, la evaluación de la patología de la placa in vivo mediante biomarcadores recientemente se ha incluido en los criterios diagnósticos de investigación para ⁴ dC. Para las mediciones de LCR de _1-42, varios inmunoensayos están disponibles y se utilizan en muchos laboratorios clínicos ^5. La concentración de _1-42 en CSF es de aproximadamente 50% menor en los pacientes de AD que en los ancianos cognitivamente normales, lo que refleja la deposición del péptido en las placas en el brain ^{6, 7.}

Estos biomarcadores se analizan utilizando principalmente inmunoensayos (por ejemplo, técnicas basadas en anticuerpos), pero estos ensayos pueden estar influenciadas por los efectos de matriz ^8. El uso de inmunoensayos en diferentes plataformas tecnológicas y la falta de estandarización de ensayo ^{9, 10} hace que la introducción de las concentraciones globales de corte difíciles ^{11, 12.} Un PGR analítico validado permitiría la calibración uniforme de diferentes plataformas de ensayo, lo ideal sería que resulta en una mejor comparabilidad entre las plataformas de análisis y un mejor control de los factores que contribuyen a la variabilidad general de medición.

La cuantificación absoluta de _1-42 usando el método LC-MS / MS desarrollado supera muchos de los problemas asociados con la tecn basada en anticuerposiques. El método, que aparece como un PGR por el Comité Conjunto para la Trazabilidad en Medicina de Laboratorio (JCTLM base de datos de identificación del número C11RMP9), se utiliza para determinar la concentración absoluta de _1-42 en un material de referencia certificado (CRM) para armonizar CSF Aß ₁ mediciones de _-42 a través de técnicas y plataformas analíticas. El flujo de trabajo descrito debe ser de relevancia para el desarrollo de métodos de referencia candidato para péptidos y proteínas dentro de otras áreas de la medicina.

Protocolo

NOTA: Este protocolo requiere alícuotas de al menos 50 l, con una concentración de 50 mg / ml para cada péptido Aß, como material de partida. Los péptidos Aß se deben disolver en 20% de acetonitrilo (ACN) y solución concentrada de amoníaco 4% en agua desionizada (v / v) y se almacenaron a 80 ° C.

Precaución: Véase la Tabla 1 para información de seguridad.

1. Preparación de las soluciones

1. Preparar 100 ml de 20% de ACN y 4% de solución de amoníaco concentrado en agua desionizada (v / v) diluyendo 20 ml de ACN y 4 ml de amoniaco concentrado (~ 25%) en agua desionizada. Ajustar el volumen final a 100 ml con agua desionizada. Hacer todos los días frescos.
2. Preparar 50 ml de 5 M de guanidina-clorhidrato mediante la disolución de 26,08 g de hidrocloruro de guanidina en agua desionizada hasta un volumen final de 50 mL. Almacenar a 20 ° C y hacer mensual fresco.
3. Preparar 200 ml de ácido fosfórico al 4% en agua desionizada (v /v) diluyendo 9,4 ml de ácido concentrado fosfórico (~ 85%) en agua desionizada. Ajustar el volumen final a 200 ml con agua desionizada. Almacenar en el refrigerador y hacer semanal fresca.
4. Preparar 50 ml de 75% de ACN y solución concentrada de amoniaco al 10% (v / v) en agua desionizada mediante la dilución de 37,5 ml de ACN y 5 ml de amoniaco concentrado (~ 25%) en agua desionizada. Ajustar el volumen final a 50 ml con agua desionizada. Hacer todos los días frescos.
5. Descongelar al menos 2,5 ml de CSF humano para los calibradores, obtenidos a partir de muestras sobrantes sin identificación de análisis clínicos de rutina.
6. Preparar CSF artificial que contiene Na 150 mM, K 3.0, Ca 1,4 mM, Mg 0,8 mM, 1,0 mM P, y Cl 155 mM en agua desionizada y añadir albúmina de suero bovino a una concentración final de 4 mg / mL. Sólo se necesita 1 ml por cada análisis, pero preparar un gran volumen, que alícuota, y almacenar para uso futuro.

2. Preparación de los calibradores

1. Preparar 0,5 ml de 4 mg / ml ¹5 NAβ _1-42 mediante la adición de 40 l de 50 mg / ml ¹⁵ NAβ ₁₄₂ a la 0,46 ml de 20% de ACN y el 4% de amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.
2. Preparar 2 ml de 100 ng / mL ¹⁵ NAβ _1-42 mediante la adición de 50 l de la 4 mg / ml ¹⁵ NAβ _{142 a 1,95} ml de 20% de ACN y 4% de amoniaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.
3. Preparar seis soluciones de calibrador (AF) mediante la mezcla de los volúmenes de cada solución se indica en la Tabla 2. Use 0.5, 1.5 y 2 tubos de microcentrífuga ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.
4. Preparar los calibradores finales (por duplicado) en 0,5 ml tubos de microcentrífuga mediante la adición de las soluciones de calibración correspondientes y CSF humano de acuerdo con la Tabla 3. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.

3. Preparación de la Norma Interna

1. Preparar 2 ml de 0,8 mg / ml _1-42 ¹³ CAβ mediante la adición de 32 l de 50 mg / ml ¹³ CAβ _{142 a 1,968} ml de 20% de ACN y el 4% de amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.
2. Preparar 5 ml de 16 ng / ml ¹³ CAβ _1-42 mediante la adición de 0,1 ml de 0,8 mg / ml a 4,9 ml de 20% de ACN y el 4% de amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 5 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.

4. Preparación de la muestra Factor de respuesta

NOTA: El factor de respuesta de determinación (RF) se realiza para determinar la concentración del péptido marcado utilizado para la calibración ⁽¹⁵ NAβ _1-42). Esto requiere que la concentración del péptido nativo _1-42 se ha determinado utilizando el análisis de aminoácidos (AAA). Por lo tanto, el volumen y la concentración de alícuotas nativas de péptidos Aß _1-42necesita para cumplir los requisitos de la AAA.

1. Preparar 0,5 ml de 4 mg / ml nativa (sin etiqueta) ^_1-42 mediante la adición de 40 l de 50 mg / ml de Aß _1-42 nativa a 0,46 ml de 20% de ACN y el 4% de amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.
2. Preparar a 2 ml de 40 ng / ml de mezcla de nativos y ¹⁵ NAβ _1-42 mediante la adición de 20 l de 4 mg / ml de Aß _1-42 nativa y 20 l de 4μg / ml ¹⁵ NAβ _1-42 a 1,96 ml de 20% ACN y 4% amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.
3. Añadir 20 l de la mezcla de 40 ng / ml a 0,38 ml de CSF artificial en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Preparar duplicados y mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.

Preparación 5. Muestra

NOTA: Descongelar las muestras a medir a temperatura ambiente sobre un rodillo.

1. Añadir 0,18 ml de cada calibrador, factor de respuesta, y la muestra desconocida (incluyendo el control de calidad [CC] muestras, si se usa) a un 1 ml de proteína placa de 96 pozos profundos, de acuerdo con la Figura 1 (suponiendo un plato lleno se utiliza). Asegúrese de añadir las muestras en, o cerca de, la parte inferior de los pozos.
2. Añadir 20 l de patrón interno a cada pocillo (es decir, los calibradores, los factores de respuesta, los círculos de calidad, y las incógnitas); es crucial para liberar la gota en el lado del pozo cerca de la superficie de la muestra sin sumergir la punta de pipeta.
3. Añadir 0,2 ml de 5 M de guanidina-clorhidrato a cada pocillo.
4. Colocar la placa de muestra en un agitador de microplacas y mezclar las muestras durante 45 minutos a 1100 rpm. La frecuencia óptima puede variar dependiendo de la instrumentación. Ajuste la frecuencia y la amplitud de la mezcladora de manera que las soluciones se mezclan a fondo y no hay gotas de estándar interno o CSF ​​se dejan sin mezclar en el lado de los pocillos.
5. Añadir 0,2 ml de ácido fosfórico al 4%a cada pocillo. Vortex mezclar brevemente.

6. Extracción en Fase Sólida

NOTA: En todos los de lavado, carga y etapas de elución, aplicar el vacío más bajo posible después de la adición de la solución y aumentar gradualmente a medida que sea necesario para cargar o eluir la solución. Desactivar el vacío entre cada carga y etapa de elución.

1. Ponga una bandeja de depósito para los residuos bajo un modo mixto, la placa de intercambio catiónico, extracción en fase sólida de 96 pocillos (SPE) en la cámara de colector de placa de extracción.
2. Acondicionar el sorbente SPE mediante la adición de 0,2 ml de metanol a cada pocillo.
3. Equilibrar el sorbente mediante la adición de 0,2 ml de ácido fosfórico al 4% a cada pocillo.
4. Transferencia de todas las muestras (aproximadamente 0,62 ml en cada pocillo) de la placa de pozo profundo a la placa de SPE. Usar una pipeta de ocho canales cuando se transfieren las muestras de la placa de pozo profundo a la placa de SPE; que no es crucial para transferir los volúmenes enteros o iguales de todas las muestras, ya que las muestras contienen un pasanteal estándar que compensar las variaciones.
5. Lavar el sorbente después de que las muestras han pasado a través mediante la adición de 0,2 ml de ácido fosfórico al 4% a cada pocillo.
6. Después de que el disolvente de lavado se eluyó de la absorbente, vuelva a colocar la bandeja de depósito con una placa de recogida o tubos.
7. Eluir la muestra del sorbente mediante la adición de dos veces 50 l de 75% ACN / 10% de amoniaco concentrado, y se tenga en cuenta que esta solución requiere un vacío muy bajo para pasar a través del sorbente. Recuerde que debe desactivar el vacío entre cada adición.
   1. OPCIONAL: Sellar la placa de recogida o tubos y congelar a -80 ° C. Retire el sello de la placa de recogida o tubos antes de proceder con el paso 6.8.2.
   2. Seque los eluatos mediante el uso de centrifugación al vacío (sin aplicación de calor); esto puede tomar de una a varias horas, dependiendo de la centrífuga de vacío.
   3. Sellar los recipientes y congelar a -80 ° C.

7. Líquido chromatografía

1. Preparar la fase móvil A (5% de ACN y 0,3% de amoníaco concentrado en agua desionizada [v / v]), B (4% de agua desionizada y 0,1% de amoníaco concentrado en ACN [v / v]), y el lavado de la aguja (50% de ACN y 4% de amoniaco concentrado en agua desionizada [v / v]).
   1. Por 500 ml de fase móvil A, se añaden 25 ml de ACN y 1,5 ml de amoníaco concentrado al agua desionizada. Ajustar el volumen final a 500 ml con agua desionizada.
   2. Por 500 ml de fase móvil B, añadir 500 l de amoníaco concentrado y 25 ml de agua desionizada a ACN. Ajustar el volumen final de 500 ml con ACN.
   3. Preparar 250 ml de lavado de la aguja mediante la adición de 120 ml de ACN y 10 ml de amoníaco concentrado a agua desionizada. Ajustar el volumen final a 250 ml con agua desionizada.
   4. Ponga la fases A y B y móvil de lavado aguja botellas abiertas en un baño de ultrasonidos durante 20 min antes de su uso con el sistema LC
2. Disolver cada muestra con 25 l de 20% de ACN y 4% concentraciónTed solución de amoniaco y colocarlos en un agitador durante 20 min. Centrifugar las muestras abajo y colocarlos en el inyector automático (mantenga a 7 ° C).
3. Inyectar 20 l de muestra en una columna monolítica 1 x 250 mm ² poliestireno-divinilbenceno (de fase inversa) mantenida a 50 ° C.
   1. Utilice el gradiente LC se muestra en la Tabla 4 con una velocidad de flujo de 0,3 mL / min. Desviar los dos primeros y los últimos cinco minutos a los residuos (post-columna) mediante una válvula de desvío para reducir la contaminación del espectrómetro de masas.

8. Análisis de espectrometría de masas

NOTA: Estos parámetros se utilizan para un espectrómetro de masas híbrido cuadrupolo-Orbitrap equipado con fuente de ionización por electrospray Aheated.

1. Establecer los parámetros de la fuente de iones de acuerdo con la Tabla 5.
2. Coloque el instrumento MS para aislar las 4+ estados de carga de Aß _1-42 nativa (1,129.48 masaratio [m / z] a carga), ¹⁵ NAβ _1-42 (1,143.00 m / z), y ¹³ CAβ _1-42 (1,179.50 m / z) en el analizador de masas cuadrupolar con una anchura de aislamiento de 2,5 m / z.
3. Fragmentar los péptidos aislados en la celda de colisión con una energía de colisión normalizada (NCE) de 17,0. Esto podría ser necesario ajustar para cada instrumento, incluso del mismo tipo (y especialmente si se utiliza otro tipo de instrumentos, como un triple cuadrupolo MS).
4. Registrar los espectros fragmento con una resolución de 17.500, con un objetivo de control automático de ganancia de 2 x 10 ⁵ cargos y un tiempo de inyección máxima de 250 ms.

9. Proceso de Datos

1. Utilizar la suma de los iones de productos (con una tolerancia de masa de ± 250 unidades de masa mili [MMU]) en la Tabla 6 para calcular las áreas cromatográficos para cada péptido. Tenga en cuenta que los tipos de iones y los números se muestran sólo para Aß nativa _{iones 1-42 de productos, ya que son los mismos para ambos ¹⁵ y ¹³ NAβ 1-42 CAβ 1-42.}
2. Determinar el factor de respuesta promedio de las dos muestras de factor de respuesta dividiendo el área bajo la curva (pico cromatográfico) de ¹⁵ NAβ _1-42 con el área bajo la curva de nativo _1-42.
3. Ajustar la concentración de la ¹⁵ NAβ _1-42 utilizada para la calibración mediante la multiplicación con el factor de respuesta calculado en el paso 9.2.
4. Construir una curva de calibrado poniendo las relaciones de área del ¹⁵ al ¹³ de NAβ _{1-42 1-42} CAβ de los dos juegos de calibradores frente a la concentración.
5. Calcular la pendiente y la intersección de la curva de calibración mediante regresión lineal.
6. Calcular la proporción de área de Aß nativo _1-42 al estándar interno ⁽¹³ CAβ _1-42) para ONUmuestras conocidas.
7. Extrapolar la concentración de muestras desconocidas a partir de la curva de calibración utilizando la pendiente y la intersección obtenido en el paso 9.5.

Resultados

La configuración de la placa en la Figura 1 se utiliza para un plato lleno de muestras. Si se van a analizar un menor número de muestras desconocidas, el segundo calibrador, conjuntos de RF, y de control de calidad debe ser colocado después de la primera mitad de las muestras desconocidas.

Como se ve en la Figura 2, los calibradores se encuentran cerca de la línea de regresión, con bajas ...

Discusión

Para el método descrito, en vez de usar una matriz sustituta, se utilizó el enfoque sustituto analito ^{13, 14, 15, 16,} que permite la calibración en CSF humano. El enfoque analito sustituto implica dos estándares marcados isotópicamente diferentes. Un ⁽¹⁵ NAβ ₁₄₂₎ se utiliza para generar la curva de calibración en CSF humano, mientras que otro ⁽¹³ CAβ

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	022431102
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL	Eppendorf	0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96	Eppendorf	951032905
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom	Micronic	MPW32071BC3	Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates.
Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes	Micronic	MP53026	Caps for Micronic tubes.
Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded	Micronic	MPW51015BC3	Holder for Micronic tubes.
Biohit Optifit tips 1.2 mL	Sartorius	791210	Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well.
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate	Waters	186001830BA
Waters Plate manifold reservoir tray	Waters	WAT058942
Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates	Waters	186001831
Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L	Fisher Scientific	A/0627/17X
ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur	Merck Millipore	1005731000
Guanidine Hydrochloride, 500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler.
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm)	Dionex	066640
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated	Sigma-Aldrich	B6917
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA	rPeptide	A-1002-2
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1102-2
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1106-2
Microplate shakers, TiMix 2	Edmund Bühler	6110 000