La incubación prolongado de aguda neuronal de tejidos para la Sección de Electrofisiología y calcio de imágenes

Resumen

Una vez retirado del cuerpo, el tejido neuronal se ve afectada en gran medida por las condiciones ambientales, lo que lleva a una eventual degradación de los tejidos después de 6-8 h. Utilizando un método de incubación única, que sigue de cerca y regula el ambiente extracelular de los tejidos, la viabilidad del tejido se puede ampliar de manera significativa para> 24 h.

Resumen

Aguda preparaciones de tejidos neuronales, rodajas de cerebro y de la retina wholemount, por lo general sólo puede ser mantenido durante 6 - 8 h después de la disección. Esto limita el tiempo experimental, y aumenta el número de animales que se utilizan por estudio. Esta limitación específicamente impactos protocolos tales como imágenes de calcio que requieren pre-incubación prolongada con tintes de baño-aplicado. crecimiento bacteriano exponencial dentro de 3 - 4 h después de cortar está estrechamente correlacionada con una disminución de la salud de los tejidos. Este estudio describe un método para limitar la proliferación de bacterias en preparaciones agudas para mantener el tejido neuronal viable durante periodos prolongados de tiempo (> 24 h) sin la necesidad de antibióticos, los procedimientos estériles, o medios de cultivo de tejidos que contienen factores de crecimiento. Ciclando el fluido extracelular a través de la irradiación UV y mantener el tejido en una cámara de retención de encargo en 15 - 16 ° C, el tejido no muestra diferencias en las propiedades electrofisiológicas, o si calciognaling a través de colorantes de calcio intracelular en> 24 h postdissection. Estos métodos no sólo extender el tiempo experimental para aquellos que utilizan tejido neuronal aguda, pero se reducirá el número de animales necesarios para completar objetivos experimentales, y establecerá un estándar de oro para la incubación del tejido neuronal aguda.

Introducción

Electrofisiología y la imagen funcional (calcio, colorantes sensibles al voltaje) son dos de las técnicas experimentales más utilizados en la neurociencia. preparaciones de cortes de cerebro y de la retina wholemount, que será examinada aquí, proporcionan un medio de examinar las propiedades electrofisiológicas y conectividad sináptica y sin contaminación de anestésicos o relajantes musculares. Rodajas de cerebro y de la retina wholemount mantienen su integridad estructural, a diferencia de las culturas o los homogeneizados celulares, permitiendo el estudio de los circuitos cerebrales específicos y redes ^1. Las grabaciones de tejido aislado tienen ventajas sobre las grabaciones en vivo como los movimientos asociados con el latido del corazón y la respiración se eliminan. Por otra parte, la visualización directa permite que las clases específicas de células para ser dirigidos, y la aplicación local de herramientas farmacológicas ^{2, 3.}

patch-clamp grabaciones y Calcio tinte de carga en wholemount retina se complica por la existencia de la membrana limitante interna (ILM), que cubre la capa de células ganglionares de la retina (RGC) e impide el acceso directo a las células. Típicamente, esta membrana se raspa con una pipeta de vidrio para permitir la aplicación directa de una pipeta de parche y la formación de un sello gigaohmio en una sola célula. Además, los colorantes de calcio de baño aplicado no cruzan la ILM y, o bien deben ser inyectados debajo de esta membrana ^4, retrógradamente transportado después de la inyección en el nervio óptico ⁵ o electroporación a través del tejido ^6. Por otra parte, cuando se utiliza un modelo de roedor de la retinitis pigmentosa, el ratón rd / rd, la ILM es más gruesa y más impenetrable. Aquí, nosotros usamos una técnica para eliminar la ILM con la digestión enzimática ^7, para permitir tanto ubicua de calcio colorante de carga, y el acceso directo a las células ganglionares de la retina para recordi patch-clampNGS ^8.

grabaciones de éxito de cualquiera de las secciones de cerebro o de la retina wholemount dependen de la disección y la incubación del tejido neuronal viable. Típicamente, el tejido se extrae en la mañana del experimento y se incubó en fluido cerebroespinal artificial (ACSF) hasta que se utiliza para las grabaciones. Por lo general, el tejido sigue siendo viable durante 6 - 8 h, con una degradación significativa después de esta ventana de tiempo. Sin embargo, ambas secciones de cerebro y preparados retinae wholemount suelen producir más tejido que puede ser grabado desde dentro de este período de tiempo corto. En consecuencia, el tejido a menudo se desecha al final del día y la disección se completa de nuevo en días posteriores. Esto significa otro animal y se utiliza ~ 2 h de la configuración y la disección / tinción repetida. El siguiente protocolo describe un método para extender la vida de tejido neuronal durante más de 24 h, lo que significa un menor número de animales se utilizan, y el tiempo más experimental está disponible. Viabilidad del tejido wcomo se evaluó a través de la grabación de las propiedades electrofisiológicas y la dinámica del calcio, y estas propiedades eran indistinguibles entre <4 hy> 24 h postdissection.

Estos resultados indican que no sólo tienen una propiedad de una sola célula intacta y funcional después de una incubación prolongada, pero la actividad de la red, según la evaluación de calcio de imágenes y registros electrofisiológicos, es sin cambios> 24 h postdissection. Por otra parte, se muestra que los colorantes de calcio pueden permanecer en las células durante períodos prolongados sin causar efectos perjudiciales. La aplicación de este protocolo demuestra que la actividad funcional de las neuronas en el tejido neuronal aguda puede mantenerse durante largos períodos de tiempo, una vez que el entorno externo es altamente regulado. Además, como la viabilidad del tejido varía mucho entre laboratorios debido a diferentes protocolos de incubación, este método establece un estándar de oro para los parámetros ideales que se deben aplicar para reducir la variabilidad en la salud de neu agudaRonal tejido.

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Protocolo

El protocolo siguiente se describe la preparación de C57BL / 6 y C3H / He (retinally degenere) tejido neuronal de ratón, pero las técnicas similares puede aplicarse a otras especies. Todos los animales estaban sanos y tratarse con las condiciones normales de temperatura, humedad, 12 h ciclo luz / oscuridad, el acceso libre a comida y agua, y sin ningún tipo de estímulos de estrés previstos. Todos los experimentos fueron aprobados y realizados de acuerdo con el comité de la Universidad de Western Sydney Cuidado de Animales y Ética y de acuerdo con el uso de los animales y las directrices para el cuidado de Investigación de Animales (Autoridad # A9452, # A10396 y # A8967).

1. Preparación de la rebanada del cerebro

1. Anestesiar al animal mediante inhalación de isoflurano (5%) y decapitar usando una guillotina de roedores. Retire el cerebro rápidamente, como se describe anteriormente ⁹ y colocarlo en solución enfriada con hielo fisiológica (LCRa) que contiene (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 2 CaCl _2, 25NaHCO _3, 25 de dextrosa, y saturado con carbógeno (95% O _2/5% de mezcla de CO _2; 310 mOsm; pH 7,4).
2. Cortar rodajas de cerebro, en la región de interés, a 300 m de grosor con un microtomo vibración.
3. Transferir las rebanadas de un sistema de incubación hecha a la medida que supervisa y controla estrechamente los niveles de pH (pH 7.2 a 7.4), el flujo y la temperatura Carbógeno, como se ha descrito previamente ^{10, 11.}
4. Conjunto temperatura inicial cámara a 35 ° C durante 15 - 30 min, y luego reducir lentamente a 15 - 16 ° C como se muestra en la Figura 1C. Incubar las rebanadas en el sistema de incubación hasta que se necesite, ya sea para electrofisiología o formación de imágenes.
   NOTA: Si las rebanadas deben ser utilizados para el calcio de imágenes, siga los pasos a continuación antes tejido enfriamiento por debajo de la temperatura ambiente.

2. Retina Wholemount Preparación y limitante interna para retirar la membrana

1. Preparar wholemounts retina en régimen normal,las condiciones de iluminación de laboratorio o tenue luz roja / infrarroja.
2. La eutanasia a los animales por dislocación cervical y los ojos inmediatamente enucleate. Hacer un pequeño corte a lo largo de la ora serrata, y el lugar, ya sea en medios de Ames, o ACSF que contiene (mM): 125 NaCl, 25 de NaHCO _3, 3 KCl, 2 _CaCl2, 1 _MgCl2, 10 de glucosa, 0,5 L-glutamina, y saturar con carbógeno (95% O _2/5% de CO mezcla _2; ~ 300 mOsm; pH 7,4), a TA.
3. Retirar inmediatamente la córnea, cristalino y vítreo cortando a lo largo de la ora serrata con pequeñas tijeras y la eliminación de la lente y el vítreo con fórceps. Coloque el tejido en el sistema de incubación a RT.
   NOTA: tejido de la retina puede ser mantenido en el ojo de copa, después de la reducción lenta de la temperatura a 15-16 ° C, durante> 24 h en el sistema de incubación hasta que se necesite.
4. Para extraer la ILM, transferir el ocular de la retina que contiene a un pequeño frasco de vidrio que contiene 30 U / ml de papaína, 1 mM de L-cistina, EDTA 0,5 mM y 0,005% de DNasa en Earl's-Solución salina equilibrada (BSS) a 37 ° C durante 20 min. Aplicar el 95% _{de O2} / 5% de CO ₂ a la solución a través de la tapa, pero no hacer burbujas. Si se utiliza el tejido de animales jóvenes (<6 semanas), se diluye la solución a mitad de su fuerza.
   1. Deja de digestión enzimática, mediante la colocación del tejido en una solución de ovomucoide (10 mg / ml) y BSA (10 mg / ml) durante 10 min en BSS de Earl. tejido de lavado a fondo con LCRa antes de la transferencia al sistema de incubación y a reducir la temperatura a 15-16 ° C.
5. Mantener el tejido de la retina en el ojo taza hasta que se necesite. Para su transferencia al microscopio, aislar la retina del ojo taza y se corta en 4 piezas con una hoja de afeitar. Si se requiere toda la retina, hacer cuatro cortes pequeños en la periferia de la retina para permitir que quede plano.
   NOTA: Para los experimentos de imagen, carga con el calcio-colorantes antes de la transferencia al sistema de incubación, véase más adelante.

3. Realizar el mantenimiento del tejido en la incubadora

1. Place tejido en la cámara principal que contiene sondas para mediciones de pH y de temperatura (Figura 1A, B).
2. Hacer circular LCRa a través de una segunda cámara (cámara de UVC, construido como se ha descrito previamente ¹²⁾ aislado de la cámara principal y se expusieron a 1,1 W luz UVC (254 nm, lámpara UV 5W / 2P esterilizador) con el fin de eradiate bacterias que flotan en la solución (Figura 1A). temporización luz de control UVC a través de un temporizador programable utilizando una función aleatoria que se activa en momentos que varían entre 15 y 26 min cada 15 - 30 minutos para evitar un calentamiento excesivo de la ACSF.
3. Ajuste la velocidad de flujo en la cámara UVC a 12 ml / min, como se informó anteriormente ^12. Cubrir la cámara UVC con papel de aluminio para evitar UVC iluminación fuera de la cámara, lo que puede dañar el tejido neuronal.
   NOTA: Para obtener tejido de la retina adaptada a la oscuridad, aplicar una cubierta a medida que la cámara principal para excluir la luz.
4. Use una bomba peristáltica para Circulate la solución (LCRa) a través de las dos cámaras y un plato frío termoeléctrico Peltier refrigerador para enfriar o calentar la cámara principal a las temperaturas deseadas en el rango de 0 - 50 ° C. Para la incubación del tejido óptimo, use 15 - 16 ° C para la viabilidad a largo plazo.

4. El calcio colorante de carga

1. Seleccionar colorantes de calcio en base a la preferencia del investigador individual. Aquí utilizamos Fura-2AM, Fluo-8 o Fluo-4am. Sin embargo, este método se puede aplicar a otros colorantes, así: disolver colorantes de calcio en DMSO a una solución de copolímeros de 1 mM y 1% de bloque (por ejemplo, ácido-127 Pluronic) a un volumen final de 50 l y se somete a ultrasonidos durante 10 min.
2. Añadir solución a LCRa a una concentración final de 10 mM, copolímeros de bloque 0,01% para los cortes de cerebro, y 20 mM (retina), copolímeros de bloque 0,02% para la retina. En las retinas (papaína tratada) y las secciones de cerebro de animales jóvenes, la carga de la bañera durante 45 minutos a 37 ° C (Fura-2 AM) o a temperatura ambiente (Fluo-4 am, Fluo-8 AM).
   1. Para los animales adultos, (> 12 semanas) pipetear los colorantes (50 l) directamente en las secciones de cerebro, y mantener durante 75 min para permitir una mejor penetración del colorante en las capas profundas.
   2. Para asegurar una oxigenación adecuada de la rebanada sumergida durante la incubación colorante, preparar una cámara de carga de vidrio con una tapa cerrada (frasco circular de 2,5 cm de diámetro, 3,5 cm de altura) con tintes de calcio diluido en 2,5 ml de LCRa. Oxigenar continuamente con 95% _O2 / 5% de CO _2. No hacer burbujas.
3. Después de la carga de colorante, lavar el tejido con ACSF y traslado al sistema de incubación, reducir lentamente la temperatura a 15 - 16 ° C hasta su uso experimental.

5. Registros electrofisiológicos y de imagen

1. Coloque el tejido en una cámara de grabación sumergida bajo el microscopio, y perfundir con oxigenada LCRa a una velocidad de flujo de 4-5 ml / min, ya sea a temperatura ambiente (~ 22 ° C) o temperatura fisiológica (~ 35 ° C). Hold el tejido en su lugar mediante el uso de un encargo a '' arpa '', hecha de hilos de nylon o de oro estirados y pegados a través de una pieza en forma de U de oro o de alambre de platino.
2. Para electrofisiología:
   1. Preparar las pipetas de registro de 1,5 mm (1,19 mm de diámetro interior) de vidrio de borosilicato con un extractor de micropipeta para lograr una resistencia final 5-6 mO.
   2. Llenar la pipeta con 3-4 l de solución interna como se describe anteriormente ¹³ y visualizar células bajo infrarrojos contraste de interferencia diferencial (IR-DIC) utilizando una cámara CCD. La solución intracelular debe adaptarse cuidadosamente para cada experimento para lograr los resultados experimentales.
   3. Posición de la pipeta, mientras que el mantenimiento de una presión positiva aplicada a través de un orificio de aspiración en el soporte de la pipeta, en la membrana de una célula usando un micromanipulador. Dado que la ILM ha sido retirado de la retina, no se requiere ningún raspado membrana antes. Una vez que la pipeta está en la célula, aplicar negativo suavepresión a la pipeta para lograr un sellado gigaohmio. A continuación, la ruptura de la membrana celular con una breve cantidad de presión negativa.
   4. Hacer de células enteras grabaciones current- o de fijación de voltaje utilizando técnicas estándar, según corresponda.
3. El calcio de imágenes:
   1. Para imagen radiométrica de Fura-2, utilice un ultra-alta velocidad de conmutación de longitud de onda para proporcionar longitudes de onda de excitación de 340 nm y 380 nm. Pasar la luz emitida a partir de células individuales a través de un filtro de emisión de 510 ± 20 nm, y capturar con una alta sensibilidad, una cámara digital de alta velocidad.
   2. Para una sola longitud de onda de excitación de Fluo-4, la luz de excitación a través de un filtro de 460 - filtro de paso de banda de 490 nm y la luz emitida a través de un 515 - filtro de paso de banda de 550 nm. Para la grabación más rápida y más sensible utilizar una cámara digital de alta velocidad, por ejemplo. Adquirir imágenes según sea necesario.
   3. Medir alteraciones en la fluorescencia como una función del tiempo, ya sea en una sola longitud de onda (Fluo-4) o el uso de la relación de longitud de ondamétodo (Fura-2), como se describe anteriormente ^{8, 14.}

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Resultados

estrecha regulación de la carga bacteriana y la temperatura del LCRa durante la incubación es esencial para mantener la viabilidad del tejido neuronal. Esto puede ser optimizado a través de irradiación con luz UVC y manteniendo la temperatura de la LCRa a 15 - 16 ° C (Figura 1). Por otra parte, la ACSF Parámetros de sello (APS; Figura 1C) proporciona el experimentador con un registro de las condiciones ambientales (pH y temperatura.), Lo que ofrece...

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Discusión

Este artículo describe un método de incubación de extender la viabilidad del tejido neuronal aguda para los experimentos de formación de imágenes y electrofisiológicos, reduciendo así el número de animales necesarios para completar objetivos experimentales. Dos procesos principales gobiernan el deterioro del tejido neuronal a través del tiempo: i) el aumento de los niveles de bacterias, y el consiguiente aumento de la endotoxina bacteriana liberado, y ii) la excitotoxicidad que sigue el procedimiento de corte t...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333
N-Methyl-D-glucamine	Sigma Aldrich	M2004
D-glucose	Sigma Aldrich	G5767
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S2554
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M9272
Calcium chloride	Sigma Aldrich	223506
Papain Dissociation System	Worthington	LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance*	Life technologies	P-6867	20% solution in DMSO
Fura-2 AM	Anaspec	84017
Fluo-4 AM	Life Technologies	F23917
Fluo-8 AM	Abcam	Ab142773
Vibrating blade microtome	Leica Biosystem	VT1200 S	Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device
Antivibration table	Kinetic Systems Vibraplane	Vibraplane 9100/9200
Fixed Stage Upright Microscope	Olympus	BX51WI
Microscope Objective	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
Microscope Objective	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
CCD Camera	Andor	Ixon +
High speed wavelength switcher	Sutter instrument	Lambda DG-4
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B
Data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instrument Co	BF150-86-10
Microelectrode puller	Sutter Instrument Co	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber	Warner Instruments	RC-40LP	Low Profile Open Bath Chambers
Software	Molecular Devices	pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler	TE Technology	CP-121
Temperature Controller	TE Technology	TC-36-25 RS232