Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

Resumen

Combinado precursor de marcaje isotópico y etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia proteómica cuantitativa que mejora las capacidades de multiplexación de muestra de las etiquetas isobáricas. Este protocolo describe la aplicación de cPILOT a los tejidos de los controles de modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de un Alzheimer.

Resumen

Existe una creciente demanda para analizar muchas muestras biológicas para la comprensión de la enfermedad y el descubrimiento de biomarcadores. estrategias proteómica cuantitativa que permiten la medición simultánea de múltiples muestras se han generalizado y reducir en gran medida los costes y los tiempos experimentales. Nuestro laboratorio ha desarrollado una técnica llamada precursor combinado marcaje isotópico y etiquetado isobárico (cPILOT), que mejora la muestra de multiplexación de marcaje isotópico tradicional o enfoques de etiquetado isobáricas. cPILOT Global se puede aplicar a las muestras procedentes de células, tejidos, fluidos corporales, o organismos completos y proporciona información sobre la abundancia relativa de proteínas a través de diferentes condiciones de la muestra. cPILOT funciona por 1) usando condiciones de tampón de pH bajo para selectivamente péptido dimethylate N-terminales y 2) usando condiciones de tampón de pH alto para etiquetar aminas primarias de residuos de lisina con reactivos isobáricas comercialmente disponibles (véase la Tabla de Materiales / Reactivos). El grado demultiplexación muestra disponible depende del número de etiquetas precursores utilizados y el reactivo de marcado isobárica. A continuación, presentamos un análisis de 12-plex usando luz y dimetilación pesado combinado con seis plex reactivos isobáricas para analizar 12 muestras de tejidos de ratón en un solo análisis. multiplexación mejorada es útil para reducir el tiempo y el coste experimental y lo más importante, lo que permite la comparación a través de muchas condiciones de la muestra (réplicas biológicas, estadio de la enfermedad, los tratamientos con fármacos, genotipos, o longitudinales puntos de tiempo) con sesgo menos experimental y error. En este trabajo, el enfoque cPILOT global se utiliza para analizar el cerebro, el corazón, el hígado y los tejidos biológicos a través de repeticiones de los controles modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de Alzheimer. Global cPILOT se puede aplicar para estudiar otros procesos biológicos y adaptado para aumentar la multiplexación muestra a mayor de 20 muestras.

Introducción

Proteómica menudo implica el análisis de muchas muestras utilizadas para comprender mejor los procesos de enfermedad, la cinética enzimática, modificaciones post-traduccionales, de respuesta a los estímulos ambientales, de la respuesta a los tratamientos terapéuticos, el descubrimiento de biomarcadores, o mecanismos de drogas. Los métodos cuantitativos se pueden emplear para medir diferencias relativas en los niveles de proteína a través de las muestras y puede ser libre de etiqueta o implicar marcaje isotópico (metabólica, química o enzimática). métodos de marcaje de isótopos estables han crecido en popularidad debido a que permiten muchas muestras a ser analizadas simultáneamente y son adecuados para muestras de diferentes células, tejidos, fluidos corporales, u organismos enteros. Los métodos ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7} aumentar el rendimiento experimental, el etiquetado de isótoposal tiempo que reduce el tiempo de adquisición, los costos, y el error experimental. Estos métodos utilizan los espectros de masas precursor para medir la abundancia relativa de las proteínas de picos de péptidos. En contraste, los reactivos de marcado isobáricas ^{8, 9, 10} generan iones informadores que se detectan ya sea en MS / MS o MS ^{3 11} espectros y estos picos se utilizan para informar sobre la abundancia relativa de las proteínas.

El estado de la técnica actual en la multiplexación proteómica es o bien un 10-plex ¹² o 12-plex análisis etiqueta isobárica ^13. Multiplexación muestra mejorada (es decir,> 10 muestras) métodos han sido desarrollados por nuestro laboratorio para los tejidos ^{14, 15, 16, 17,} y por otros para el análisis de células ¹⁸ sup>, ^{19, 20, 21} tejidos, o péptidos dirigidos ^22. Hemos desarrollado una técnica de multiplexación mejorado denominado precursor de marcaje isotópico combinado con etiquetado isobárico (cPILOT). CPILOT Global es útil para obtener información acerca de las concentraciones relativas de todas las proteínas a través de diferentes condiciones de la muestra (≥12) ^14. La Figura 1 muestra un flujo de trabajo general cPILOT. Trípticos o Lys-C péptidos se etiquetan de forma selectiva en el extremo N-terminal con dimetilación usando bajo pH ² y en los residuos de lisina con 6-plex reactivos usando pH alto. Esta estrategia se duplica el número de muestras que se pueden analizar con reactivos isobáricas que ayuda a reducir los costos experimentales y, además, reduce pasos y el tiempo de experimentación.

cPILOT es flexible ya que hemos desarrollado otros métodos para estudiar la modificación oxidativa después de la traducciónficaciones, incluyendo proteínas 3-nitrotirosina modificado ¹⁴ y de cisteína que contiene péptidos con S-nitrosilación (oxcyscPILOT) ^23. También hemos desarrollado un aminoácido enfoque selectivo, cPILOT cisteína (cyscPILOT) ^17. MS ³ adquisición con una parte superior de iones de ¹¹ o selectiva-y ₁ -ion método ¹⁵ puede ayudar a reducir la interferencia de iones reportero y mejorar la precisión cuantitativa de cPILOT. El uso de MS ³ en el método de adquisición requiere un instrumento de alta resolución con un analizador de masas orbitrap aunque de baja resolución instrumentos trampa de iones también pueden trabajar ^24.

Anteriormente, cPILOT se ha utilizado para estudiar las proteínas hepáticas ¹⁶ de modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer. A continuación, describimos cómo realizar análisis global cPILOT utilizando el cerebro, el corazón y el hígado homogeneizado para estudiar el papel de la peripheria en la enfermedad de Alzheimer. Este experimento incorpora replicación biológica. Debido a la versatilidad de cPILOT, los usuarios interesados ​​pueden utilizar la técnica para estudiar otros tejidos para una serie de problemas y sistemas biológicos.

Protocolo

Ética declaración: Los ratones fueron adquiridos de una institución independiente de investigación biomédica, sin ánimo de lucro y alojados en la División de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad de Pittsburgh. Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Pittsburgh.

1. extracción de proteínas y la generación de péptidos de Química-etiquetado

1. Extracto de proteína a partir de tejido, células, o fluidos corporales.
   1. Homogeneizar 60-90 mg de tejido (por ejemplo cerebro, el corazón y el hígado) en solución salina tampón fosfato (1x PBS) con urea 8 M (500 l) usando un homogeneizador mecánico. Los inhibidores de proteasa o fosfatasa pueden ser añadidos a la memoria intermedia si es necesario. En este proyecto, que no estaban acostumbrados. Usa los siguientes parámetros para el homogeneizador: la lisis de perlas de una matriz, 4 m / s, 20 s. tejido del corazón puede requerir hasta 9 ciclos de homogeneización.
      NOTA: proteasa o inhibidor de la fosfatasa s puede añadirse a la memoria intermedia si es necesario. No se utilizaron en este estudio.
      1. Eliminar homogeneizado de tejido desde el tubo de lisis y transferir a un tubo de microcentrífuga. Enjuague lisis de tubos con 100-500 l de PBS con 8 M urea y combinar la solución de enjuague con homogeneizado de tejido.
   2. Centrifugar los tejidos homogeneizados (9447 xg, 4 ° C, 15 min) y recoger el sobrenadante.
2. Determinar la concentración de proteína usando un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) según las instrucciones del fabricante.
   NOTA: La dilución adicional con tampón puede ser necesario si la concentración de proteína es demasiado alto. Las concentraciones resultantes para las muestras de estos tejidos estaban en entre 6-13 g / l.
   1. Opcional: Añadir un estándar de control de calidad interno (por ejemplo, caseína alfa bovina u otra proteína exógena) con el estándar g relación de 1: 100 g de muestra de proteína.

jove_title "> 2. La digestión de la muestra

1. Añadir 100 g (100 x 10 ^-6 g) de proteína de cada muestra a etiquetados individualmente tubos de microcentrífuga. El volumen es dependiente de la concentración de proteína (véase el paso 1.2).
2. Añadir ditiotreitol (DTT) (40: 1 reactivo a la muestra relación mol) a cada muestra. Incubar a 37 ° C durante 2 h. El cálculo para la relación molar está basada en la masa de la proteína de la albúmina de suero bovino (BSA), que es 66,5 x 10 ³ g / mol.
3. Añadir yodoacetamida (IAM) (80: 1 reactivo a la muestra relación mol) a cada muestra. Incubar en hielo en la oscuridad durante 2 h. Esta reacción se lleva a cabo en hielo durante 2 h para evitar reacciones secundarias.
4. Añadir L-cisteína (40: 1 reactivo a la muestra relación mol) a cada muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
5. Añadir tampón Tris 20 mM con 10 mM CaCl ₂ (pH 8,2) para diluir la urea a una concentración final de 2 M.
6. Añadir L-1-tosilamido-2 feniletil clorometil cetona (TPCK) tratado con tripsina (50: 1 de sustrato a la enzima relación mol) a cada muestra y se incuba a 37 ° C durante 24 h.
7. Se detuvo la digestión de la proteína por el flash de congelación de la muestra en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C hasta su posterior procesamiento.

La desalación 3. Muestra

1. Re-acidificar las muestras mediante la adición de ácido fórmico (FA). Añadir suficiente FA para obtener una concentración final de 0,1%. Si las muestras son inicialmente a -80 ° C, descongelar las muestras en hielo antes de volver a la acidificación.
2. De-sal los péptidos utilizando C ₁₈ hidrófilo lipófilo equilibrada (HLB) cartuchos de 10 mg como se ha descrito previamente ^16.
3. Secar las muestras por centrifugación al vacío (5 Torr, 45 ° C, 77 xg) hasta un volumen de ~ 10 l.

4. dimetilación Etiquetado (N-terminales)

1. Reconstituir péptidos en ácido acético al 1% (0,25 g /? L) disuelto en cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o agua de calidad de nano-puro. Retirar un 50 μ; Porción g a un nuevo tubo de microcentrífuga (1,5 ml) y almacenar el resto a -80 ° C.
2. Añadir 8 l de 60 mM (4%) CH ₂ O (37% p / v) o 60 mM (4%) ¹³ CD ₂ O (20% p / v) a las muestras para el etiquetado con luz o dimetilación pesada, respectivamente . Típicamente, 4 l de reactivo se añade por cada 25 g de péptidos (Pasos 4.2, 4.3, 4.6).
3. Añadir 8 l de 24 mM _NaBH3CN o 24 mM BDAN ₃ CN a las muestras marcadas con luz o dimetilación pesada, respectivamente.
4. Vortex y agitar en un agitador de tubo para ~ 10 min a temperatura ambiente.
5. Se inactiva las reacciones mediante la adición de 16 l de 1% de amoniaco (~ / v 28-30% v) durante 5 min. Típicamente, 8 l de reactivo se añaden por 25 g de péptidos.
6. (V / 98% v). Re-acidificar las mezclas de reacción mediante la adición de 8 l de 5% FA
7. Combinar la luz y péptidos dimetilados pesados (Figura 1) para generar un total de seis muestras. Ver Tabla 1 para una descripción de etiquetado de la muestra y la puesta en común utilizada para este estudio.
8. Realizar desalado de la muestra de acuerdo a los pasos 3.2 y 3.3.

5. isobárico Tagging (residuos de Lys)

1. Reconstituir 100 g de péptidos dimetilados (1 g / l) en 100 mM de bicarbonato de amonio tri-acetato de tampón (TEAB) (pH ~ 8,5).
2. Preparar los reactivos isobáricas como se indica en el protocolo del fabricante (véase la Tabla de Materiales / Reactivos).
3. Añadir reactivos isobáricas solubilizadas (41 L) a péptidos y de vórtice durante ~ 10 s. Agitar las muestras en un agitador de tubo de microcentrífuga durante ~ 1 h. Se inactiva la reacción con 8 hidroxilamina l (10% w / v) e incubar las muestras durante 15 min a temperatura ambiente.
4. Reunir las seis muestras marcadas en una sola mezcla y desalt (pasos 3.1 a 3.3) o se almacena a -80 ° C hasta su uso posterior.
   NOTA: Para mejorar la cobertura proteoma y profundidad, se sugiere una estrategia de separación multidimensionaltales de intercambio catiónico como fuerte (SCX).

6. intercambio catiónico fuerte

1. Realizar SCX según el protocolo del fabricante (ver Tabla de Materiales).
   1. Preparar ~ 1 ml de las soluciones de formiato de amonio (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, y 500 mM) con 10% de acetonitrilo (ACN), 0,1% FA (pH 3).
   2. Retire la tapa roja de la parte superior de la punta de pipeta y toque la punta de pipeta con el embalaje de suspensión para asegurar que el material de embalaje es hacia la parte inferior de la punta de pipeta.
      NOTA: Crítica: No tire la punta de la pipeta hasta el final del protocolo.
   3. Coloque el adaptador de centrífuga en la parte superior de un tubo de microcentrífuga (2 ml) y asegurar la punta de la pipeta en el interior.
   4. Añadir 150! L de tampón de reconstitución SCX para puntas de pipeta.
   5. Centrifugar las puntas de pipeta para 6 min a temperatura ambiente (4000 xg). Repita este paso dos veces más y desechar los residuos.
   6. Disolver el peptides en 150 l de tampón de reconstitución SCX. Asegúrese de que el pH es 3.
   7. Añadir péptidos a las puntas de pipeta, se centrifuga (véase 6.1.5), y mantener el eluyente.
   8. Transferir el filtro y la pipeta a un nuevo tubo de microcentrífuga (2 ml) y añadir 150 l de solución de formiato de amonio 20 mM. Centrifugar durante 6 min a temperatura ambiente (4000 xg) y mantener el eluyente.
   9. Repita el paso 6.1.8 un adicional de siete veces, utilizando concentraciones sucesivas (es decir, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM y 500 mM) de formiato de amonio.
2. Transferencia de las ocho fracciones de SCX a tubos de microcentrífuga (1,5 ml) y concentrar a ellos mediante evaporación centrífuga (véase el paso 3.3).

7. Cromatografía de líquidos-espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS) y MS ³

1. Reconstituir los péptidos en agua masa grado espectrometría con 0,1% FA, filtrar y colocar en un vial de auto-muestreador. péptidos de filtro como SSOWS:
   1. Añadir péptidos reconstituidas a un tubo de microcentrífuga que contiene un filtro de 0,65 m (ver Tabla de Materiales).
   2. péptidos Centrifugar a 12.000 xg durante 1 min. Retirar filtro, desechar, y añadir péptidos filtrados en un vial de auto-muestreador.
2. Preparar las memorias intermedias de la fase móvil de la siguiente manera: 3% (v / v) de ACN con 0,1% de FA (A) y 100% de ACN con 0,1% de FA (B).
3. Inyectar 6 l de cada muestra de fracción en una columna SCX trampa empaquetada a 2 cm con el material de C ₁₈ (5! M, 200 Å de tamaño de poro).
   NOTA: la limpieza de la muestra en la trampa es el siguiente: 3 min, 0% de B; 3 l / min usando un sistema de cromatografía líquida 2D (ver Tabla de Materiales).
4. Ejecutar el método de separación analítica. Utilice una columna 75 m ID x 13,2 cm láser-tip tirado sílice fundida capilar lleno de C ₁₈ de material (5! M, 100 Å). El gradiente es: 0-5 min, 10% B; 5-40 min, 10-15% de B; 40-90 min, 15-25% de B; 90-115 min, 25-30% de B; 115-130 min, 30-60% de B; 130-135 min, 60-80% de B; 135-145 min, 80% B, 145-150 min, 80-10% de B; 150-180 min, 10% B; 300 nL / min, 180 min.
5. Ejecutar la adquisición de datos para el espectrómetro de masas, mientras que el método de separación analítica se está ejecutando.
   NOTA: Los parámetros para la exploración encuesta EM son los siguientes: 400-1,600 m / z, 60000 resolución, control automático de ganancia (AGC) Objetivo 1 x 10 ⁶ iones, tiempo de inyección máxima de 500 ms. Parámetros para CID-MS / MS son los siguientes: Top 1-7 o la adquisición dependiente de datos Top 8-14 (DDA), 3 m / anchura z aislamiento, 500 de señal mínimo, 35% energía de colisión normalizada (NCE), 0,25 activación q , 10 ms de tiempo de activación, 3 x 10 ⁴ AGC, 50 ms de tiempo de inyección máxima. Parámetros para HCD-MS ³ son los siguientes: 200 de señal mínimo, 4 m / z anchura aislamiento, 60% NCE, tiempo de 0,1 activación, 3 x 10 ⁵ AGC, 250 ms de TI, 300-1,300 m / z rango de selección MS / MS , excluir ion primario no-fragmentada.
6. realizar cada análisis por duplicado tanto para la parte superior 1-7 y superior 8-14 carreras.
   NOTA: Para las muestras se ejecutan en un modelo más nuevo de un instrumento que contiene una orbitrap o un espectrómetro de masas trihíbrido, los parámetros de DDA pueden variar y pueden ser optimizados para incluir más MS / MS y MS ³ exploraciones. Además, para los instrumentos trihíbrido, selección precursor síncrona (SPS) -MS deben emplearse ^3.

8. Análisis de Datos ¹⁶

1. Buscar en los archivos RAW usando software de análisis de proteína frente a una base de datos adecuada, tal como un ratón Uniprot.
   NOTA: Es importante crear dos flujos de trabajo para cada archivo RAW con el fin de buscar la luz y péptidos dimetilados pesados.
2. Busca los archivos RAW utilizando los siguientes parámetros: la tripsina con dos divisiones perdidas, rango de masas péptido 300-6,000 Da, 15 ppm padre tolerancia de masa, 1 Da tolerancia fragmentación. modificaciones estáticas: dimetilación de luz (28,031, péptido N-terminal) o hdimetilación eavy (36.076 Da, péptido N-terminal), Carbamidomethyl (57.021 Da, C).
   NOTA: A veces el pico dimethylated pesado es ~ 7 Da (35.069 Da, péptido N-terminal) es desde el pico de la luz dimetilada y por lo tanto se debe incorporar en el flujo de trabajo búsqueda de péptidos dimetilados pesados. modificaciones dinámicas: oxidación (15.995 Da, M), etiqueta isobárica 6-plex (229.163 Da, K). Incluyen una búsqueda de base de datos de señuelo para producir tasas de falso descubrimiento (por ejemplo 1 y 5%) y un nodo de cuantificación para buscar las intensidades de iones informadores de etiquetas isobáricas.
3. Estadística
   1. Exportación de datos en un programa de hoja de cálculo electrónica el fin de normalizar los valores de iones reportero proteína. Para cada proteína, dividir cualquiera de los ratios de iones informadores mediana o intensidades de iones informadores prima por la relación de la mediana de la norma interna o intensidades de iones reportero primas del patrón interno, respectivamente. Utilice el software estadístico apropiado, tal como un programa de hoja de cálculo electrónica, PersEUS, o R para determinar cambios significativos entre condiciones de la muestra.

Resultados

cPILOT utiliza la química basado en amina a químicamente péptidos de la etiqueta en el extremo N-terminal y los residuos de lisina y mejora las capacidades de multiplexado de la muestra. La Figura 2 muestra los datos de MS representante que se obtiene a partir de un análisis cPILOT 12-plex de cerebro, el corazón y los tejidos del hígado de los controles de modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de un Alzheimer. Como se muestra en la Tabla 1,

Discusión

cPILOT permite la medición simultánea de más de 12 muestras únicas. A fin de garantizar el etiquetado exitosa tanto en el N-terminal y lisina residuos de péptidos, es imperativo para que el pH correcto para cada conjunto de reacciones y para llevar a cabo la reacción dimetilación primero para el etiquetado del péptido. dimetilación selectiva en el extremo N-terminal se realiza por tener un pH a ~ 2,5 (± 0,2). Esto se consigue mediante la explotación de las diferencias de los valores de pKa de los grupos amino...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water - MS Grade	Fisher Scientific	W6-4	4 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS Grade	Fisher Scientific	A955-4	4 L quantity is not necessary
Acetic Acid	J.T. Baker	9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)	Sigma Aldrich	320145-500ML
Ammonium formate	Acros Organics	208-753-9
Formic Acid	Fluka Analytical	94318-250ML-F
BCA protein assay kit	Pierce Thermo Fisher Scientific	23227
Urea	Biorad	161-0731
Tris	Biorad	161-0716
Dithiothreiotol (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Iodoacetamide (IAM)	Acros Organics	144-48-9
L-Cysteine	Sigma Aldrich, Chemistry	168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich, Life Science	T1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O	Sigma Aldrich, Life Science	F8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C	Sigma Aldrich, Chemistry	596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%	Sigma Aldrich	156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP	Sigma Aldrich, Chemistry	190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit	Protea BioSciences	SP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer	Sigma Aldrich, Life Science	T7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg)	Thermo Fisher Scientific	90061
Hydroxylamine hydrochloride	Sigma Aldrich, Chemistry	255580-100G
Standard vortex mixer	Fisher Scientific	2215365	any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges	Waters	186000383	These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model	Sigma Aldrich	57265	A 12 port model is also sufficient
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamber	Thermo Scientific	2825/2826	Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)	MP Biomedicals	116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler	Sciex	-	This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer	Thermo Scientific	-	This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer)	Thermo Scientific	IQLAAEGABSFAKJMAUH
Analytical balance	Mettler Toledo	AL54
Stir plate	VWR	12365-382	Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable)	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-183	Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 buffer	Fisher Scientific	06-664-261	Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer	Fisher Scientific	06-664-260	Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	05-408-129	Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	04-408-120	Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units	EMD Millipore	UFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 units	Thermo Scientific	69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å)	Bruker	PM5/61100/000	This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å)	Bruker	PM5/61200/000	This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient