Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas

Resumen

Aquí, se muestra cómo analizar enrutamiento dendríticas de las neuronas medulares de Drosophila en columnas y capas. El flujo de trabajo incluye una visualización dual técnica de imagen para mejorar la calidad de imagen y herramientas computacionales para el seguimiento, el registro de los cenadores dendríticas en la matriz de la columna de referencia y para el análisis de las estructuras dendríticas en el espacio 3D.

Resumen

En muchas regiones del sistema nervioso central, tales como los lóbulos ópticos de la mosca y la corteza de los vertebrados, los circuitos sinápticos se organizan en capas y columnas para facilitar el cableado del cerebro durante el desarrollo y tratamiento de la información en los animales desarrollados. las neuronas postsinápticas dendritas elaboradas en los patrones específicos de tipo en capas específicas que hacen sinapsis con las terminales presinápticas apropiadas. El neurópila mosca médula se compone de 10 capas y alrededor de 750 columnas; cada columna está inervado por las dendritas de más de 38 tipos de neuronas medulares, que responden a las terminales axonales de unos 7 tipos de aferentes de una manera específica del tipo. Este informe detalla los procedimientos para analizar la imagen y dendritas de las neuronas medulares. El flujo de trabajo incluye tres secciones: (i) la sección de formación de imágenes de doble vista combina dos pilas de imágenes confocal recogidos en las orientaciones ortogonales una imagen en 3D de alta resolución de las dendritas en; (Ii) la dendrita rastreo y registro de huellas sección dendríticascenadores en 3D y los registros de huellas dendríticas en la matriz de la columna de referencia; (Iii) la sección de análisis dendríticas analiza los patrones dendríticas con respecto a las columnas y capas, incluyendo la terminación y la proyección plana dirección de capa específica de cenadores dendríticas, y calcula las estimaciones de ramificación y de terminación de frecuencias dendríticas. Los protocolos utilizan plugins personalizados construidos en la MIPAV de código abierto (Procesamiento de Imágenes Médicas, análisis y visualización) cajas de herramientas personalizadas de la plataforma y en el idioma de laboratorio matriz. En conjunto, estos protocolos proporcionan un flujo de trabajo completo para analizar el enrutamiento dendríticas de Drosophila neuronas médula en capas y columnas, para identificar tipos de células, y para determinar defectos en los mutantes.

Introducción

Durante el desarrollo, las neuronas dendritas elaboradas en los patrones complejos ramificados, pero estereotipados para formar sinapsis con sus socios presináptica. patrones de ramificación dendríticas se correlacionan con la identidad y las funciones neuronales. Las ubicaciones de los cenadores dendríticas determinan el tipo de entradas presinápticos que reciben, mientras que la ramificación dendrítica de complejidad y de campo tamaños gobiernan el número de entrada. Por lo tanto, las propiedades morfológicas dendríticas son elementos indispensables para la conectividad sináptica y la computación neuronal. En muchas regiones del cerebro complejos, tales como los lóbulos ópticos de la mosca y la retina de los vertebrados, los circuitos sinápticos están organizados en columnas y capas para facilitar el procesamiento de información ^{1, 2.} En una organización tan columna y capa, las neuronas presinápticas de un axones distintos proyectos modalidad para terminar en una capa específica (denominada orientación-capa específica) y para formar una matriz bidimensional ordenada (la called mapa topográfico), mientras que las neuronas postsinápticas se extienden dendritas de tamaños apropiados en capas específicas para recibir aportes presinápticas de los tipos y números correctos. Si bien la orientación axonal a las capas y columnas ha sido bien estudiado ^{3, 4,} se sabe mucho menos acerca de cómo dendritas se encaminan a capas específicas y ampliar adecuadamente dimensionados campos receptivos para formar conexiones sinápticas con los socios correctos presináptica ^5. La dificultad de formación de imágenes y la cuantificación de la orientación dendrítica de capas y columnas ha dificultado el estudio del desarrollo dendrítico en las estructuras cerebrales columnares y laminados.

Drosophila neuronas médula son un modelo ideal para el estudio de enrutamiento dendríticas y ensamblaje de circuitos en las columnas y capas. El neurópila mosca médula está organizada como una celosía en 3D de 10 capas y aproximadamente 750 columnas. Cada columna está inervado por un conjunto de fibras aferentes, incluyendo photoreceptors R7 / R8 y neuronas de la lámina L1 - L5, cuyos terminales axonal formar mapas topográficos de una manera específica de la capa ^6. Alrededor de 38 tipos de neuronas medulares están presentes en cada columna de médula y dendritas elaboradas en capas específicas y con tamaños de los campos apropiados para recibir las aportaciones de estos aferentes ^7. Los circuitos sinápticos en la médula se han reconstruido a nivel microscópico de electrones; por lo tanto, las asociaciones sinápticas están bien establecidos ^{7, 8.} Además, herramientas genéticas para el etiquetado de diferentes tipos de neuronas médula están disponibles ^{9, 10, 11.} Mediante el examen de tres tipos de transmedulla (TM), las neuronas (TM2, TM9 y TM20), hemos identificado previamente dos atributos de tipo celular específico dendríticas: (i) las neuronas se proyectan Tm dendritas, ya sea en la dirección anterior o posterior (proy planadirección reflexión), dependiendo de los tipos de células y (ii) dendritas de las neuronas médula terminar en capas médula específicos de una forma de células de tipo específico (terminación de capa específica) ^12. Planar dirección de proyección y la terminación de capa específica son suficientes para diferenciar estos tres tipos de neuronas Tm, mientras que las mutaciones que alteran las respuestas de Tm a capa y columnas señales afectan a distintos aspectos de estos atributos.

A continuación, presentamos un flujo de trabajo completo para el examen de los patrones dendríticas de las neuronas medulares de Drosophila en columnas y capas (Figura 1). En primer lugar, se muestra un método de imagen de doble vista, que utiliza software personalizado para combinar dos imagen confocal pilas para generar imágenes isotrópicas de alta calidad. Este método requiere solamente la microscopía confocal convencional para generar imágenes de alta calidad que permitan el rastreo fiable de ramas dendríticas, sin recurrir a la super-resolución microscopía, como unas STED (emisión estimulada agotamiento) o iluminación estructural. En segundo lugar, se presenta un método para el seguimiento de los cenadores dendríticas y para el registro de las huellas resultantes de neuritas a una matriz columna de referencia. En tercer lugar, se muestran los métodos computacionales para la extracción de información en la dirección de proyección planar y la terminación de la capa específica de dendritas, así como para derivar estimaciones de ramificación y de terminación de frecuencias dendríticas. Juntos, estos métodos permiten la caracterización de patrones dendríticas en 3D, la clasificación de los tipos de células sobre la base de morfologías dendríticas, y la identificación de posibles defectos en los mutantes.

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Protocolo

Nota: El protocolo contiene tres secciones: de doble punto de vista de imagen (secciones 1 - 3), el rastreo y registro dendríticas (secciones 4 - 6), y el análisis dendríticas (secciones 7 - 9) (Figura 1). Los códigos y archivos de ejemplo se proporcionan en la Tabla de Materiales / Equipos.

1. Adquisición de doble imagen

NOTA: Este paso está diseñado para adquirir dos pilas de imágenes de la neurona de interés en dos orientaciones ortogonal (horizontal y frontal).

1. Prepare cerebros de moscas que contienen escasamente etiquetados neuronas médula (~ 10 células / lóbulo cerebro) con un marcador GFP membrana (mCD8GFP), como se describió anteriormente ^12. Teñir el cerebro con conejo anti-GFP (por dendritas de las neuronas médula) y el ratón mAb24B10 (por axones fotorreceptoras), anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios fluorescentes (Alexa 488 anti-conejo y Alexa 568 anticuerpos anti-ratón), como se describió previamente13. Despeja el cerebro en el 70% de glicerol en PBS 1x.
2. Para montar el cerebro en la orientación horizontal (Figuras 2A, B), transferir el cerebro de la mosca de glicerol-limpiado con una caída de 20 l de medio de montaje antidesvanecimiento en el centro de una diapositiva.
3. Coloque pequeñas manchas de barro en las 4 esquinas del cubreobjetos para evitar el cubreobjetos de aplastar la muestra del cerebro durante el montaje.
   NOTA: Las manchas de arcilla proporcionan una amortiguación para evitar el cubreobjetos de la molienda de la muestra. Cada parche de arcilla debe ser de aproximadamente 1 mm de diámetro.
4. Bajo un microscopio de disección, la posición de los cerebros en la posición ventral arriba y colocar el cubreobjetos en la parte superior para asegurar el cerebro. Utilice la superficie dorsal convexa del cerebro como un punto de referencia para identificar la orientación de la muestra de cerebro (Figura 2A).
5. Obtener la primera pila de imágenes (visión horizontal) con un microscopio confocal. Utilice una lente de objetivo de alta NA (como un NA de glicerol o de inmersión en aceite 63X 1,3 objectivo lente) y 2,5 veces el zoom digital (el tamaño de píxel es 0,105 m por píxel; número de promedio es 2). Adquirir más de 180 secciones ópticas (512 x 512 píxeles) para cubrir el bulbo raquídeo neurópila con un tamaño de paso de 0,2 micras.
6. Volver a montar el cerebro como se describe en los pasos 1.3 - 1.4, pero el cerebro alinear en la posición antero-up (vista frontal).
7. Adquirir la segunda pila de imágenes (vista frontal) de la misma neurona, como se describe en el paso 1.5.
   NOTA: Encontrar la misma neurona puede ser difícil cuando hay numerosas neuronas marcadas en el lóbulo óptico. Para identificar las mismas neuronas de ambas orientaciones, podrían ser necesarias de menor magnificación pilas de imágenes desde ambos puntos de vista (por ejemplo, utilizar un zoom de 0,7 y un tamaño de paso de 0,45 micras para adquirir pilas de imágenes de baja resolución). Si la imagen de más de 512 x 512, la imagen debe ser recortada a 512 x 512 antes de la combinación de imagen y el tamaño de píxel debe tener a 0.105 m por píxel, mientras que la formación de imágenes del campo grande. Pérdida de la señales un problema potencial para el tejido profundo. Si la señal es débil, la imagen de la media ventral del cerebro. Para reducir photobleaching durante la exploración, utilizar una fuente de láser lo más bajo posible. Utilice el indicador de alcance para comprobar si hay una sobreexposición antes de adquirir pilas de imágenes. Si es posible, utilice un microscopio confocal equipado con detectores de GaAsP.
8. Identificar y registrar la ubicación de la neurona de interés con respecto a la neurópila médula (derecha / izquierda [R / L] y dorsal / ventral [D / V]). Compruebe si la muestra se movió durante la adquisición de imágenes mediante el examen de la pila de imágenes.
   NOTA: movimiento de la muestra es a menudo debido a un montaje inadecuado. Si se produce movimiento de la muestra, la pila de imagen no se puede utilizar para el registro y debe desecharse. Vuelva a montar la muestra y adquirir pilas de imágenes de la misma neurona.

Deconvolución 2. Imagen

NOTA: El paso de deconvolución utiliza la imagen del software de deconvolución para restaurar las imágenes adquiridas que se degradan difuminandoy el ruido. Si bien este paso es opcional, se mejora significativamente la calidad de imagen. Se recomienda el uso de pilas de imágenes deconvolved para el registro de imagen y combinación en la sección 3.

1. Iniciar el programa de deconvolución en el modo interactivo. Cargar la pila de imagen (en formato de LSM o microscópica específica) seleccionando Menú: Archivo / Abrir (o Ctrl-O) en la ventana principal.
2. Haga clic para seleccionar la imagen de pila cargada y elegir Menú: Operaciones para abrir la ventana de operación imagen. Usar el algoritmo predeterminado clásico estimación de máxima verosimilitud (CMLE).
3. En la ventana de operación de imagen, haga clic en la pestaña "Parámetros". Introduzca los parámetros adecuados para el medio de inmersión de la lente, medio de inclusión y apertura numérica (por ejemplo, aceite, glicerina, etc.) (Por ejemplo, aceite de inmersión, etc.) (NA; aquí, se utilizó 1,3). Compruebe los parámetros restantes para asegurarse de que reflejen correctamente las condiciones de formación de imágenes. Haga clic en la pestaña "Configurar todas verificado" a la aletaAlize los ajustes de los parámetros.
4. En la ventana de operación de imagen, haga clic en la pestaña "Operación". Asignar un destino de salida (por ejemplo, c). Introduzca un número adecuado de "señal / ruido por canal" (por ejemplo, "12 12 12 12" es un buen punto de partida, mientras que la configuración por defecto es "20 20 20 20"). Utilizar la configuración por defecto para los parámetros restantes.
5. Haga clic en la pestaña "Ejecutar comando" para comenzar a deconvoluting la pila de imágenes; este proceso podría tomar hasta decenas de minutos en completarse, dependiendo del ordenador.
6. En la ventana principal, haga clic y seleccione la imagen de pila deconvolved. Elija Menú: Guardar como para guardar la imagen deconvolved en el formato de archivo de imagen ICS (.ics y .ids).
   NOTA: Cada pila de imágenes tiene dos archivos: el archivo ics contiene la información del encabezado y el archivo de las identificaciones contiene la información de la imagen en bruto.
   1. Cambiar el nombre de los archivos de imagen Pila de acuerdo con la orientación de imágenes (por ejemplo, el nombre de la horizontal-s vista de la imagentachuelas H.ids y H.ics y el frontal-vista de la imagen pila F.ids y F.ics).

3.-vista dual Combinación de imágenes

Nota: Este paso combina dos imagen apila para generar imágenes de alta resolución en 3D utilizando el software de MIPAV.

1. Generación de matrices para la combinación de imágenes.
   1. Iniciar el programa MIPAV. Cargar las pilas de imágenes H y F eligiendo Menú: Archivo / Abrir imagen (A) del disco (o Ctrl-f) /H.ids y F.ids; la ventana mostrará dos imágenes.
   2. Seleccione la imagen de H haciendo clic en la imagen y seleccione del menú: Utilidades / conversión / RGB / grises; la ventana mostrará GrayG, GrayB, y las imágenes GrayR.
   3. Cerrar GrayR y GrayB, sólo el mantenimiento de GrayG en la ventana.
   4. Seleccione la imagen F clicando en la imagen y selecciona Menú: Utilidades / conversión / RGB / Grises. La ventana mostrará GrayG1, GrayB1, y las imágenes GrayR1.
   5. Cerrar GrayR1 y GrayB1 y mantener sólo GrayG1 en la ventana. En este paso, solamente GrAYG y GrayG1 están en la ventana.
   6. Seleccione la GrayG (resaltar), elija Menú: Algoritmos / registro / inscripción automática de la imagen optimizada; el cuadro de diálogo "optimizado registro de la imagen 3D automático" pop-up.
      1. En las opciones de entrada, cambiar los "grados de libertad" de forma predeterminada "Afín-12" a "específico rescale-9". En clave de -105 a 105 en el "rango de muestreo" Ángulo de rotación "rotaciones" (por defecto: -30 a 30 grados), 10 en el "incremento de ángulo Grueso" (por defecto: 15 grados), y 3 en el "Fine ángulo de incremento "(por defecto: 6 grados).
   7. Haga clic en Aceptar; La primera matriz "GrayG_To_GrayG1.mtx" se genera y se guarda en la carpeta de imágenes. Cierre todas las ventanas de imagen y proceder al siguiente paso; este paso se tardará al menos 15 min.
   8. Cargar las pilas de imágenes H y F eligiendo Menú: Archivo / Abrir imagen (A) del disco (o Ctrl-f) /H.ids y F.ids, como en el paso 3.1.1.
   9. Seleccione la imagen de H haciendo clic en la imagen y seleccione del menú: Utilidades / conversión / RGB / gris; la "> RGB-Gray" cuadro de diálogo se abrirá. Haga clic en Aceptar; la ventana mostrará imágenes "HGray". Mantenga HGray y cerrar la imagen H.
   10. Repita el paso 3.1.9 para la imagen F; las imágenes "FGray" aparecerá en la ventana. Mantenga FGray y cerrar la imagen F; Sólo HGray y FGray serán dejados en la ventana.
   11. Seleccione la imagen HGray (resaltar) y vaya al menú: Herramientas Algoritmos / transformación / Transform. El cuadro de diálogo "Transformar / Remuestrear la imagen" pop-up. Haga clic en la pestaña "Volver a muestrear" y cambiar el tamaño de volver a muestrear a "HGray" a "FGray". A continuación, haga clic en la pestaña "Transform" y la carga "GrayG_To_GrayG1.mtx" mediante la selección de la "matriz Leer de archivo." Haga clic en Aceptar; la ventana mostrará la imagen HGray_transform. Cerrar la imagen HGray por lo que sólo HGray_transform y FGray se dejan en la ventana.
   12. Seleccione la opción "HGray_transform & #34; imagen (resaltar) y vaya a Menú: Algoritmos / registro / inscripción automática de la imagen optimizada. El cuadro de diálogo "optimizado registro de la imagen 3D automático" pop-up. En "Las rotaciones," llave en -5 a 5 en el "rango de muestreo ángulo de rotación" (por defecto: -30 a 30 grados), 3 en el "incremento de ángulo Grueso" (por defecto: 15 grados), y 1 en el "Fine ángulo de incremento "(por defecto: 6 grados). Haga clic en Aceptar.
       NOTA: La Matriz afín (HGray_transform_To_FGray.mtx) se genera y se guarda en la carpeta de imágenes y la imagen "HGray_Transform_register" se mostrará en la ventana. Este paso se llevará al menos 40 min.
   13. Cerrar la imagen "HGray_transform"; Sólo "HGray_Transform_register" y "FGray" se debe dejar en la ventana.
   14. Seleccione la opción "HGray_Transform_register" imagen (resaltar) y vaya a Menú: Algoritmos / Registro / B-spline automático del registro de 2D / 3D. La "B-spline automática Registroen 3D intensidad "cuadro de diálogo aparecerá. Seleccione" Least Squares "en la función de coste (el valor por defecto es la relación de correlación).
       1. Haga clic en "Realizar el registro de dos pasos". En la sección Paso 1, clave en 2 en "Desnivel Bajada Minimizar tamaño Paso (unidades de muestreo)" (el valor por defecto es 1) e introduzca 10 en el "máximo número de iteraciones:" (el valor predeterminado es 10). En la sección Paso 2, clave en 1 en "Desnivel Bajada Minimizar tamaño Paso (unidades de muestreo)" (el valor predeterminado es 0,5) e introduzca 2 en el "máximo número de iteraciones:" (el valor predeterminado es 10).
          NOTA: La matriz NTV, "HGray_transform_register.nlt", se guardará en la carpeta de imágenes y la imagen "HGray_transform_register_registered" se mostrará en la ventana. Este paso se tardará al menos 5 min.
   15. Cierre todas las imágenes en la ventana.
2. La generación de la imagen de referencia para la combinación de imágenes.
   NOTA: Este paso está destinado a genercomió una imagen horizontal registrada para la combinación.
   1. Cargar imagen F y H pilas seleccionando el menú: Archivo / Abrir imagen (A) del disco (o Ctrl-f) /H.ids y F.ids; dos imágenes van a aparecer en la ventana.
   2. Seleccione la imagen de H (resaltar) y vaya al menú: Herramientas Algoritmos / transformación / Transformación; el cuadro de diálogo "Transformar / Remuestrear la imagen" pop-up. Haga clic en la pestaña "Volver a muestrear" y cambiar el nuevo muestreo de un tamaño de "H" a "F" A continuación, haga clic en la pestaña "Transform" y la carga "GrayG_To_GrayG1.mtx" seleccionando la opción "Leer matriz a partir de archivos." Haga clic en Aceptar; la imagen H_transform aparecerá en la ventana. Cerrar la imagen H pero mantener H_transform y F en la ventana.
   3. Seleccione la opción "H_transform" imagen (resaltar) y vaya al menú: Herramientas Algoritmos / transformación / Transformación; el cuadro de diálogo "Transformar / Remuestrear la imagen" pop-up. Haga clic en la pestaña "Volver a muestrear" y cambiar el nuevo muestreo de un tamaño de "H_transform" a "F. & #34; A continuación, haga clic en la pestaña "Transform" y la carga "HGray_transform_To_FGray.mtx" seleccionando la opción "Leer matriz a partir de archivos." Haga clic en Aceptar; la imagen "H_transform_transform" aparecerá en la ventana. Cerrar la imagen H_transform; en este punto, sólo se H_transform_transform y F se pueden dejar en la ventana.
   4. Seleccione la opción "H_transform_transform" imagen (resaltar) y vaya al menú: Herramientas Algoritmos / transformación / Transformación no lineal; la caja "no lineal B-spline Transformación" de diálogo se abrirá. A continuación, la carga "HGray_transform_register.nlt" y haga clic en OK; la imagen "H_transform_transform_registered" aparecerá en la ventana. Guarda la imagen como un archivo ICS. Cierre todas las imágenes en la ventana.
3. La combinación de pilas de imágenes
   NOTA: Este paso es combinar dos pilas de imágenes adquiridas en orientaciones ortogonales (horizontales y frontales) en una pila de alta resolución.
   1. Ir al Menú: Complementos / Genérico / Drosophila Retina Registrationl; el cuadro de diálogo "Drosophila Retina v2.9 Registro" se abrirá. Subir "H.ics" a la imagen de H, "H_transform_transform_registered" desde el paso 3.2.4 de la imagen ", F.ics" a la imagen F, "GrayG_To_GrayG1.mtx" desde el paso 3.1.7 Transformación en 1-verde-H Registrado (opcional ), "HGray_transform_To_FGray.mtx" de paso 3.1.12 en la Transformación 2-afines, y "HGray_transform_register.nlt" de paso 3.1.14 Transformación en 3-no lineal (opcional).
      1. Seleccionar sqrt (Intensidad-H x Intensidad-F) y n rescale en "Cambiar la escala de H F." Mantenga las opciones por defecto para los parámetros restantes. Haga clic en Aceptar; este paso se llevará a unos 3 minutos.
         NOTA: Después del procesamiento, se generará 3 series de imágenes: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (la imagen recombinada final), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS (canal verde de H, F, y la imagen recombinada final), y redChannelsImage- Rxreg-Ry-Rcomp.ids (canal rojo for H, F, y la imagen recombinada final); todos los archivos de salida se puede cambiar el tamaño de 512 x 512 x 512.
   2. Abiertos "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" bajo el software de visualización de imágenes. Guarde la pila de imágenes en el formato IMS y cambiar el nombre del archivo; este archivo de imagen recombinado será utilizado para el seguimiento de las neuritas y el registro.

4. Asignación de neuritas de referencias y envíos Point

NOTA: Este paso es neuritas (4.1) rastrear y asignar los puntos de referencia para el registro (4.2) utilizando el software de visualización de imágenes.

1. rastreo de neuritas
   1. Iniciar el software de visualización de imágenes. Abra el archivo de imagen recombinado. Ir al Menú: Editar / Show de ajuste de visualización y apague el canal fotorreceptor (rojo).
   2. Visualizar la imagen en el modo de "Supera". Encienda "estéreo" y utilizar el modo "Quad Buffer" para visualizar imágenes en 3D si el ordenador está equipped con un sistema stereograph.
   3. Ir al Menú: Supera / Filamentos añadir nuevos filamentos. Haga clic en el "Saltar la creación automática, edite manualmente" ficha.
   4. Haga clic en la pestaña "Draw" y seleccione "AutoDepth."
   5. Seleccionar "Ajustes", consulte la sección "Línea", y la clave en un número de píxeles apropiado para una mejor visualización (una línea de 4 píxeles se utiliza en este protocolo). Comprobar los "dendritas", "Punto de Inicio" y "puntos de ramificación". Ajuste "calidad de procesamiento" al 100%.
   6. Seleccione la pestaña "Draw" y comenzar a remontar neuritas. Comenzar con el axón y luego pasar a las dendritas (Figura 2D). El axón y dendritas de las neuronas transmedulla son fáciles de diferenciar.
      NOTA: Una neurona Tm se extiende su axón desde el cuerpo celular y proyecta todo el camino a la mayor centro de procesamiento visual, la lobula. El sistema definirá automáticamente el primer filamento siempre que un axón y los filamentos cortos restantes comodendritas. Mantener el punto de partida al comienzo del filamento (axón) durante el trazado y asegúrese de que las neuritas trazadas están conectados. Examinar los puntos de ramificación y el punto de inicio. Si las dendritas no están conectados, un nuevo punto de inicio se define en el filamento no conectado.
   7. Después de trazar, volver a "Configuración" y desactive la casilla "punto de partida" y "Punto de ramificación," y vaya al menú: Supera / exportación Seleccionar objetos ../. Guarde el filamento como un archivo inventor (* .iv).
2. La asignación de puntos de referencia
   1. Seleccione "Mostrar Pantalla de ajuste" y girar en ambos canales de imagen. En este ejemplo, el canal 1 es la tinción de los fotorreceptores y el canal 2 es la neurona TM20 (GFP).
   2. Ir al Menú: Supera / medición. Seleccione la pestaña "Editar" y marca "Canal específica:" (seleccionar el canal fotorreceptor [rojo]).
   3. Asignar puntos de referencia para la capa superior. Ir al Menú: / Supera / Medición PoiNTS para crear nuevos puntos de medición. Marcar el inicio de la capa M1 como una capa superior. El orden de los puntos es el siguiente: ecuatorial, ecuatorial-anterior, anterior, anterior-ventral, ventral, posterior-ventral, posterior, posterior-ecuatorial, y el centro (Figura 3F); definir el fotorreceptor centro que la asociada con los procesos más dendríticas.
   4. Asignar las capas R8 y R7 como en el paso 4.2.3 (Figura 3G). Tres puntos de medición individuales deben ser creados en los pasos 4.2.3 y 4.2.4.
   5. Exportar las coordenadas de los puntos para cada capa. Haga clic en la pestaña "Estadísticas", seleccione "detallada", "Valores específicos", y "Posición"; y haga clic en "Estadísticas de exportación de ficha Pantalla a archivo." Guardar como "Valores separados por comas" (* .csv).
   6. Abrir los tres archivos CSV (desde los pasos 4.2.3 - 4.2.4) y combinar las coordenadas de los 27 puntos de referencia en un nuevo archivo csv por copiar y pegar (THPara e es superior, R8, y R7). Ver los Materiales / Tabla Equipo y seguir el formato del archivo de ejemplo.

5. cuerpo rígido y TPS no lineal de registro

NOTA: Este paso es registrar las huellas de las neuritas (en formato iv) a la matriz de la columna de referencia y para generar un archivo SWC registrada utilizando el programa MIPAV. En esta sección se requiere los siguientes archivos: la pila de recombinada (.ids) de la etapa 3.3, el archivo de punto de referencia (.csv) de la etapa 4.2, y el archivo de rastreo de filamentos de neuritas (.iv) desde el paso 4.1.

1. Ir al Menú: Complementos / Genérico / DrosophilaStandardColumnRegistration. La ventana "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1" pop-up.
2. Cargar los archivos de imagen (.ids), el archivo de puntos de referencia (.csv) y el archivo de filamento (.iv).
3. Seleccione 9 puntos por capa.
4. Seleccione la posición de la neurona con imagen (LV / RD o RV / LD).
5. Seleccione "rígido Registroy TPS en "y" Registro rígido "para no lineal y el registro de cuerpo rígido, respectivamente.
6. Verificación "Crear archivo SWC" para generar los archivos de salida siguiente: un archivo de rastreo de neuritas registrada en formato SWC (ver Materiales Específicos / Equipo para la definición), un archivo IV registrada (.iv), las coordenadas del neuritas estandarizada (.txt), coordenadas transformadas (.txt), y la imagen combinada (.ids).
7. Cambie el nombre del archivo SWC. Aplicar la abreviatura de la ubicación para el final del nombre de archivo (paso 1.7). Por ejemplo, utilice "Tm20_3_RV.swc" para TM20 neurona # 3, en la mitad ventral de la médula derecha.

6. Normalización de configuración Haga ventral

NOTA: Este paso es convertir los restos de neuritas (en formato SWC) a la configuración estándar de RV (derecha-ventral) utilizando la secuencia de comandos personalizada "RV_standardization.m." En este caso, el guión fue escrito en el lenguaje de laboratorio matriz. losnombres de los archivos SWC de entrada deben estar en el siguiente formato: "NeuronName _ _ Número .swc de configuración" (por ejemplo, Tm20_3_LV.swc).

1. Abra la secuencia de comandos "RV_standardization.m".
2. Editar los siguientes parámetros en la sección "La entrada del usuario":
   1. Escriba los nombres de las neuronas sin numeración (por ejemplo, TM2, TM20, etc.) en "neuron_names."
      NOTA: El valor por defecto en "file_end_in" es "* _ SWC,.", Que busca archivos con nombres que contienen ( "*" es un comodín número de caracteres) "* ​​_ SWC.". El valor por defecto de "swc_file_end_out" es "_f.swc", que se sumarán "_f" al final del nombre de archivo después de la normalización.
   2. Especificar el directorio donde los archivos SWC están en "directory_in". Especificar el directorio donde los archivos normalizados irán en "directory_swcout".
3. Ejecutar el script.
4. Opcional: Uso Vaa3D ¹⁴ para visualizar los archivos SWC y validar la conversión.

7. Calcular ramificación dendrítica y que termina Frecuencias

NOTA: Este paso se utiliza de cuerpo rígido registrado archivos SWC para calcular los estimadores de Kaplan-Meier de la probabilidad de que un segmento dendrítico alcanzará una longitud determinada sin necesidad de terminar. Este script utiliza dos funciones: Dendritic_Tree_Toolbox extractDendriticSegmentLengthDistribution y estimateDendriticSegmentLengthProbability.

1. Abra la secuencia de comandos "Branch_term_P.m".
2. Editar los siguientes parámetros en la sección "La entrada del usuario":
   1. Especifique la ruta de los archivos SWC de cuerpo rígido registrados en "pathToSWCFiles" (por ejemplo, / Rigid_Registered_swc /). Especificar la ruta que llevará a cabo la salida de gráficos en "pathToOutput." Especifique el nombre de las neuronas o tipos neuronales en "neuron_names" (por ejemplo, TM2, Tm20, etc.).
3. Ejecutar el script; las salidas son la curva de estimación de Kaplan-Meier de las ramificaciones dendríticas y terminación.
   NOTA: Opcional: Aplicar el método de ajuste de la función de extraer de la estimadores de Kaplan-Meier la probabilidad local que el segmento dendrítico se bifurcará o terminar.

8. representar gráficamente la distribución de Terminación-capa específica de los cenadores dendríticas

NOTA: Este paso representa gráficamente la distribución de terminales dendríticas en diferentes capas de la médula como un gráfico de barras. Esto se puede aplicar a una neurona, un grupo de neuronas, o grupos de neuronas. La secuencia de comandos utiliza la función de extractDistributionAlongAxis Dendritic_Tree_Toolbox.

1. Abra la secuencia de comandos "Layer_term.m".
2. Editar los siguientes parámetros en la sección "La entrada del usuario":
   1. Especifique el directorio que contiene los archivos SWC no lineales registrada en "pathToSWCFiles" (por ejemplo, / Non_linear_Registered_swc /). Especifique el directorio de salida de gráficos en "pathToOutput." Especifique el nombre de las neuronas o tipos neuronales en "neuron_names" (por ejemplo, TM2, TM20, etc.).
3. Ejecutar el script tutorial. La salida es un histograma de la proporción de nodos terminales en capas médula específicos.

9. Trazar la proyección dirección plana de dendritas

NOTA: Este paso representa los planos direcciones de proyección de las dendritas como un gráfico polar. La secuencia de comandos utiliza la función de extractAngularDistribution Dendritic_Tree_Toolbox.

1. Abra la secuencia de comandos "Planar_proj.m."
2. Editar los siguientes parámetros en la sección "La entrada del usuario".
   1. Especifique el directorio que contiene el no lineal archivos SWC registrados en "pathToSWCFiles" (por ejemplo, / Non_linear_Registered_swc /). Especificar el directorio para la salida gráfica en "pathToOutput." Especifique el nombre delas neuronas o tipos neuronales en "neuron_names" (por ejemplo, TM2, TM20, etc.).
3. Ejecutar el script; la salida es un diagrama polar de direcciones de proyección planas.

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Resultados

Uso de la vista de doble procedimiento de imagen que se presenta aquí, un cerebro de la mosca que contiene neuronas TM20 escasamente etiquetados fue fotografiada en dos direcciones ortogonales. Antes de la formación de imágenes, el cerebro se tiñeron con anticuerpos primarios y secundarios adecuados para la visualización de GFP y fotorreceptoras axones membrana anclada. Para formación de imágenes, el cerebro se montó primero en la orientación horizontal (Figura 2A, B).

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Discusión

Aquí, se muestra cómo reproducir y analizar los árboles dendríticos de neuronas medulares de Drosophila. En la primera sección, de doble punto de vista de imagen, se describe la deconvolución y la combinación de dos pilas de imágenes en una pila de imágenes de alta resolución. La segunda sección, el trazado de las dendritas y el registro, se describe el rastreo y registro de las dendritas de las neuronas medulares en la matriz de la columna de referencia. En la tercera sección, el análisis dendrít...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	version 16.05	for image deconvolution (https://svi.nl).  commercial software
MIPAV		version 7.3.0	for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class			freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class			freeware
Imaris	Bitplane		for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software
Vaa3D			for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab	Mathworks	R2014b	for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software
Matlab toolbox: TREES1.14		v1.14	for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name	Company	Catalog number	Comments
Sample files
SWC file definition			http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
The codes and sample files for image combination and registration			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Reference point example			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2
Name	Company	Catalog number	Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later			3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)
Optional: Quadro4000  (or above) graphic card	Nvidia		for stereographic visualization of dendrites.
Optional: NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name	Company	Catalog number	Comments
Reagents for imaging
24B10 antibody	The Developmental Studies Hybridoma Bank	24B10
GFP Tag Antibody	Thermofisher Scientific	G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Mounting Clay	Fisher	S04179
70% glycerol in 1x PBS
Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm	Zeiss	474030-9000-000