Perfilado Redox Celular Utilizando Microscopía de Alto Contenido

Resumen

Este trabajo presenta un flujo de trabajo de microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles de ROS intracelular, así como el potencial de membrana mitocondrial y la morfología -conocidas conjuntamente como morfofonción mitocondrial- en células adherentes vivas utilizando las moléculas reportero fluorescentes permeantes a las células 5- 6) - clorometil - 2 ', 7' - diclorodihidrofluoresceína, éster acetilico (CM - H _ { ₂ } DCFDA) y éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM).

Resumen

Las especies de oxígeno reactivo (ROS) regulan los procesos celulares esenciales incluyendo la expresión génica, la migración, la diferenciación y la proliferación. Sin embargo, los niveles excesivos de ROS inducen un estado de estrés oxidativo, que se acompaña de daño oxidativo irreversible al ADN, lípidos y proteínas. Por lo tanto, la cuantificación de ROS proporciona un proxy directo para la condición de salud celular. Dado que las mitocondrias están entre las principales fuentes celulares y objetivos de ROS, el análisis conjunto de la función mitocondrial y la producción de ROS en las mismas células es crucial para comprender mejor la interconexión en condiciones fisiopatológicas. Por lo tanto, se desarrolló una estrategia basada en la microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles intracelulares de ROS, el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ _m ) y la morfología mitocondrial. Se basa en microscopía de fluorescencia de campo ancho automatizada y análisis de imágenes de células adherentes vivas, crecidas en placas de pocillos múltiples, y staineD con las moléculas fluorescentes CM-H ₂ DCFDA (ROS) y TMRM (ΔΨm y morfología mitocondrial) permeables a las células. En contraste con la fluorimetría o la citometría de flujo, esta estrategia permite cuantificar los parámetros subcelulares a nivel de la célula individual con alta resolución espacio-temporal, tanto antes como después de la estimulación experimental. Es importante destacar que la naturaleza basada en imágenes del método permite extraer parámetros morfológicos además de intensidades de señal. El conjunto combinado de características se utiliza para el análisis exploratorio y estadístico de datos multivariados para detectar diferencias entre subpoblaciones, tipos de células y / o tratamientos. Aquí, se proporciona una descripción detallada del ensayo, junto con un ejemplo de experimento que demuestra su potencial para la discriminación inequívoca entre los estados celulares después de la perturbación química.

Introducción

La concentración de ROS intracelular se regula meticulosamente a través de una interacción dinámica entre la producción de ROS y ROS sistemas de desactivación. El desequilibrio entre los dos provoca un estado de estrés oxidativo. Entre las principales fuentes de ROS están las mitocondrias ¹ . Dado su papel en la respiración celular, son responsables de la mayor parte de las moléculas de superóxido intracelular (O ₂ ^{• -} ) ² . Esto se debe principalmente a la fuga de electrones a O ₂ en el complejo 1 de la cadena de transporte de electrones bajo condiciones de fuerte potencial negativo interno de membrana mitocondrial (Δψ _m ), es decir , hiperpolarización mitocondrial. Por otra parte, la despolarización mitocondrial también se ha correlacionado con una mayor producción de ROS apuntando a múltiples modos de acción ^{3 , 4 , 5 ,}> 6 ^{, 7 , 8} . Además, a través de modificaciones redox en las proteínas de la fisión-fusión maquinaria, ROS co-regular la morfología mitocondrial ^9. Por ejemplo, la fragmentación se correlaciona con el aumento de la producción de ROS y apoptosis [ ^{10 , 11]} , mientras que las mitocondrias filamentosas se han vinculado a la inanición de nutrientes y protección contra Mitófago ¹² . Dada la intrincada relación entre el ROS celular y la morfofunción mitocondrial, ambos deberían idealmente ser cuantificados simultáneamente en células vivas. Para ello, se desarrolló un ensayo de imagen de alto contenido basado en microscopía automatizada de campo ancho y análisis de imágenes de cultivos celulares adherentes teñidos con las sondas fluorescentes CM-H ₂ DCFDA (ROS) y TMRM (mitocondrial Δψ _m y morfología). Imágenes de alto contenido se refiere a la extracción de spAtiotemporally rico ( es decir , un gran número de características descriptivas) información sobre fenotipos celulares utilizando múltiples marcadores complementarios y análisis de imagen automatizada. Cuando se combinan con microscopía automatizada, muchas muestras pueden ser examinadas en paralelo ( es decir, de alto rendimiento), aumentando así el poder estadístico del ensayo. De hecho, un activo principal del protocolo es que permite la cuantificación simultánea de múltiples parámetros en la misma célula, y esto para un gran número de células y condiciones.

El protocolo se divide en 8 partes (descritas en detalle en el siguiente protocolo): 1) siembra de células en una placa de 96 pocillos; 2) Preparación de soluciones madre, soluciones de trabajo y tampón de formación de imágenes; 3) Montaje del microscopio; 4) Carga de las células con DCFDA CM-H ₂ y TMRM; 5) Primer ciclo de imágenes en vivo para medir los niveles basales de ROS y la morfofunción mitocondrial; 6) Segunda ronda de imágenes en vivo después de la adición de terc -butilPeróxido (TBHP) para medir los niveles de ROS inducidos; 7) Análisis automatizado de imágenes; 8) Análisis de Datos, Control de Calidad y Visualización.

El ensayo se desarrolló originalmente para fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF). Dado que estas células son grandes y planos, que son muy adecuados para la evaluación de la morfología mitocondrial en 2D imágenes widefield [ ^{13 , 14]} . Sin embargo, con modificaciones menores, este método es aplicable a otros tipos de células adherentes. Por otra parte, junto a la combinación de CM-H ₂ DCFDA y TMRM, el flujo de trabajo cumple con una variedad de pares de tintes fluorescentes con diferentes especificidades moleculares [ ^{1 , 15]} .

Protocolo

El protocolo siguiente se describe como realizado para células NHDF y con el uso de las placas de pocillos múltiples especificadas en el archivo de materiales. Consulte la Figura 1 para obtener una descripción general del flujo de trabajo.

1. Preparación de reactivos

1. Preparar el medio completo suplementando el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% v / v de suero bovino fetal (FBS) y 100 UI / ml de penicilina y 100 UI / mL de estreptomicina (PS). Para 500 ml de medio completo, añadir 50 ml de FBS y 5 ml de PS a 445 ml de DMEM.
2. Preparar HBSS-HEPES (HH) buffer de imagen mediante el complemento Hank's Balanced Salt Solution (con magnesio y calcio, pero sin rojo fenol) con 20 mM HEPES. Para 500 ml de HH, añadir 10 ml de solución madre de HEPES 1M a 490 ml de HBSS. Verificar el pH y, si es necesario, ajustar a pH 7,2.
3. Preparar 1 mM CM-H ₂ DCFDA solución madre mediante la disolución de 50 μ g de CM-H ₂ DCFDA polvo liofilizado en 86,5 &# 181; L DMSO anhidro. Mezclar en vórtex o pipetear hacia arriba y hacia abajo y preparar alícuotas de 20 μL en tubos marrones de microcentrífuga. Almacenar en la oscuridad a -20 ° C y utilizar en 1 semana. Si se almacena bajo atmósfera de N _2, la vida útil se puede aumentar hasta al menos 1 mes.
   1. Preparar solución madre TMRM 1 mM disolviendo 25 mg de TMRM en polvo en 50 ml de DMSO anhidro. Mezclar vorticialmente o pipetear hacia arriba y hacia abajo y preparar alícuotas de 10 μL en tubos marrones de microcentrífuga. Almacenar en la oscuridad a -20 ° C. Esta solución es estable durante al menos un año.
4. Preparar una alícuota fresca de stock de peróxido de tert-butilo (TBHP) (~ 7 M) para cada experimento pipeteando directamente un volumen a partir de la solución madre al 70% (placa de 10 μl / 96 pocillos). Mantenga esta alícuota a 4 ° C hasta su uso posterior.
5. Preparar la solución de trabajo de anticuerpos (AB) diluyendo dos anticuerpos secundarios (Alexa Fluor 488 burro anti-conejo y CY3 burro anti-conejo) 1.000 veces en 1x HH-buFfer

2. Configuración del Microscopio y Protocolo de Adquisición (± 15 min)

NOTA: La adquisición de la imagen se realiza con un microscopio de campo amplio equipado con una etapa automática y obturadores, y un sistema de autofoco basado en hardware usando un objetivo 20X aire Plan-corrigido (NA = 0.75) y una cámara EM-CCD. Cuando se configura el ensayo por primera vez, se usa una placa de ensayo que contiene células de control, teñidas de acuerdo con las instrucciones del protocolo, para calibrar la etapa XY y optimizar los ajustes de adquisición. Si ya se han determinado los ajustes de adquisición, la calibración puede realizarse con una placa vacía.

1. Baje el objetivo al nivel base absoluto y calibre la etapa XY siguiendo las instrucciones del software.
2. Asegúrese de que los cubos de filtro correctos estén instalados. Para visualizar CM-H ₂ DCFDA, utilice un cubo de filtro GFP estándar con un filtro de paso de excitación de 472/30 nm, un cutoff dichro de 495 nmIc y un filtro de emisión de paso de banda 520/35 nm. Para TMRM, utilice un cubo de filtro para TRITC con un filtro de excitación de paso de banda de 540/25 nm, un espejo dicroico de corte de 565 nm y un filtro de emisión de paso de banda de 605/55 nm.
3. Cree un protocolo de imagen utilizando el software de adquisición.
   1. Seleccione el tipo correcto de placa de pozo múltiple (fabricante y código) de la lista de placas disponibles en el software. Alternativamente, defina su propio formato de placa multihaz usando las dimensiones de placa y pozo.
   2. Alinee la placa del pozo de acuerdo con las instrucciones del software, p . Ej. Definiendo dos esquinas de los cuatro pozos de las esquinas exteriores. Este paso cubre la variación de la orientación de la cámara.
   3. Seleccione los pozos que necesitan ser adquiridos. Si esta opción no está disponible en el software, utilice un conjunto de ubicaciones XY definidas manualmente que correspondan a los pozos seleccionados.
   4. Optimice los ajustes de adquisición (tiempo de exposición, intensidad de la lámpara, ganancia EM) paraDos canales por separado usando la placa de prueba. Minimizar la exposición y la intensidad ya que la propia luz de excitación de fluorescencia induce ROS. Pero, asegúrese de que la relación de señal a fondo es de al menos 2 para DCFDA CM-H ₂ basal y 3 para TMRM antes del tratamiento TBHP, y que no hay saturación después del tratamiento con TBHP. Los ajustes de adquisición dependen en gran medida de la configuración de la microscopía y del tipo de célula utilizada, pero como referencia, los ajustes indicativos cuando se usa una bombilla de haluro metálico de 130 W como fuente de luz y células NHDF teñidas de acuerdo con las instrucciones del protocolo son los siguientes: H ₂ DCFDA y TMRM se utilizan un tiempo de exposición de 200 ms y un filtro ND 8, combinados con una ganancia EM de 15 (13 MHz; 14 bits) y 4 (27 MHz; 14 bits), respectivamente. Una vez optimizado para una cierta configuración y tipo de célula, este paso se puede omitir.
      NOTA: es esencial que los ajustes de adquisición se mantengan igual durante todo el proceso de formación de imágenes. Para los experimentos a gran escala, de varios dControl de calidad regular.
   5. Definir un protocolo de adquisición, consistente en una adquisición secuencial lambda (longitud de onda). Seleccione primero el canal DCFDA CM-H _{2 que se} va a adquirir, para minimizar la exposición a la luz antes de la medición.
   6. Definir un bucle de placa de pozo, para adquirir 4 imágenes no superpuestas regularmente espaciadas, situadas alrededor del centro de cada pozo de la selección de pozos usando el protocolo de adquisición definido en 2.3.4. Elija la adquisición de la imagen en meandros, es decir, primero de izquierda a derecha, desde el pozo B02 a B11, luego hacia atrás, de derecha a izquierda, desde el pozo C11 hasta C02 y así sucesivamente ( Figura 2A ). Esto ahorra tiempo comparado con la adquisición de imágenes de izquierda a derecha. Si esta opción no está disponible en el software, ajuste el conjunto personalizado de ubicaciones XY creado en 2.3.3 para asumir este patrón de generación de imágenes.
   7. Guardar las coordenadas XY de las posiciones de imagen ( por ejemplo, en un archivo xml separado), para permitir una revisión fácilNg en caso de recalibración del microscopio. Esto es especialmente importante si la lectura de este ensayo tiene que estar correlacionada con una tinción de inmunofluorescencia (IF) post-hoc para las mismas células.

3 . Sembrado de células en una placa de 96 pocillos (45 - 90 min, dependiendo del número de diferentes líneas celulares)

1. Trabajar en un entorno estéril, como un gabinete de bioseguridad clase 2 y usar guantes.
2. Descontaminar todas las superficies y materiales usando etanol al 70% v / v en agua destilada.
3. Tome un frasco de cultivo celular con un cultivo de células confluentes al 90% de la incubadora y colóquelo en el gabinete de bioseguridad.
4. Lavar las células dos veces con PBS 1x.
5. Añadir la cantidad apropiada de solución de tripsina-EDTA al 0,05% en las células, asegurándose de cubrir la superficie celular completa ( por ejemplo , 1 ml para un matraz T25) e incubar durante 2 min a 37 ° C y 5% de CO ₂ .
6. Si todas las células están separadas (verifique con un microscopio ), Añadir medio de cultivo (DMEM + FBS al 10% + penicilina-estreptomicina al 1% ± 4 mL en un matraz T25) para inactivar la solución de tripsina-EDTA.
7. Centrifugar durante 5 min a 300 xg a temperatura ambiente.
8. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en medio de cultivo. Determine la cantidad de medio para cada tipo de célula para obtener una concentración celular que sea compatible con el recuento celular. Típicamente, un matraz T25 confluente al 90% de NHDF contiene aproximadamente de 1 a 1,5 millones de células, las cuales se resuspenden en 3-4 ml de medio de cultivo.
9. Contar las células utilizando una cámara de recuento de células o contador Coulter.
10. Sembrar de 8.000 a 10.000 células en cada uno de los 60 pocillos interiores de una placa negra de 96 pocillos con un fino poliestireno o fondo de vidrio continuo (negro para evitar la dispersión y el cruce entre pozos adyacentes durante la formación de imágenes). Cuando se utilizan diferentes condiciones / tratamientos / líneas celulares, distribuir sus lugares de siembra de forma homogénea en la placa con el fin de minimizar los efectos de la placa (Los pozos exteriores, excepto los pozos B01 y A01, no se utilizan porque son más propensos a los efectos de borde.
11. Semilla de 8.000 a 10.000 células en B01. Este pozo se utilizará para el ajuste del enfoque, justo antes de la adquisición de la imagen.
12. Llene los pocillos exteriores vacíos con medio para minimizar gradientes (temperatura, humedad, etc. ) entre los pozos y el ambiente.
13. Golpee suavemente la placa tres veces antes de colocarla de nuevo en la incubadora para evitar que las células crezcan en parches.
14. Cultivo de las células durante 24 h, o hasta un grado de confluencia de aprox. 70%.
15. Guarde la información de tratamiento para el experimento en una hoja de cálculo llamada "Setup.xlsx". El archivo debe contener cuatro columnas y se utilizará para vincular tratamientos con pozos e información de imagen durante el análisis de datos. Las cuatro columnas son: "Bueno", "Número de tratamiento", "Tratamiento" y "Control" (una fila por pocillo). Cada tratamiento está acopladoCon un número de tratamiento único, que se utiliza durante la visualización de datos para determinar el orden de los tratamientos en el eje X de parcelas. La columna de control especifica el tratamiento que funciona como control para el tratamiento en la fila actual. Las ilustraciones de un diseño experimental típico y el archivo de configuración correspondiente se representan en la Figura 2 .

4. Carga de las células con DCFDA CM-H ₂ y TMRM (± 45 min)

NOTA: El manejo de las células el día del experimento puede llevarse a cabo en un ambiente estéril (gabinete de bioseguridad), pero esto no es obligatorio porque las células serán desechadas o fijadas directamente después del ensayo.

1. Calentar el tampón HH a 37 ° C.
2. Preparar una solución de trabajo de TMRM 20 μM diluyendo la solución madre 1 mM 50 veces en tampón HH (añadir 490 μl de tampón HH a 1 alícuota de 10 μl de solución madre TMRM).
3. Preparar una cargaCon 2 μM CM-H ₂ DCFDA y 100 nM TMRM. Para ello, diluir la disolución madre de CMF-H ₂ CMF de 500 mM y la solución de trabajo de TMRM 20 μM 200x en tampón HH.
   1. Típicamente, para 60 pocillos, preparar 7,5 mL de solución de carga añadiendo 15 μL de DCFDA CM-H2 y 37,5 μL de solución TMRM a 7447,5 μL de HH.
4. Deseche el medio de cultivo de las células girando la placa boca abajo en un solo movimiento de fluido.
5. Lavar suavemente las células dos veces con tampón HH usando una pipeta multicanal (100 μL / pocillo). Deseche el buffer HH entre las etapas de lavado girando la placa boca abajo en un solo movimiento de fluido.
6. Cargar las células con DCFDA CM-H ₂ y TMRM añadiendo 100 μl de la solución de carga a cada pocillo, utilizando de nuevo una pipeta multicanal. Incubar durante 25 minutos en la oscuridad, a temperatura ambiente. No se olvide bien de B01.
7. Durante estos 25 minutos, prepare soluciones de trabajo del oxidante TBHP y asegúrese de que el microscopio y el accesorio estén encendidos.
   1. Preparar solución de trabajo I: Diluir la solución madre 7M 70x a 100 mM (10 μL de stock en 690 μl de tampón HH).
   2. Preparar la solución de trabajo II: Diluir WS I 100x a 1 mM (10 μl de WS I en 990 μl de tampón HH).
   3. Preparar la solución de trabajo III: Diluir WS III 25x a 40 μM (para 60 pocillos agregar 300 μl de WS II en 7200 μl de tampón HH).
8. Después de 25 min, lavar de nuevo las células dos veces con 100 mu l de tampón HH como se describió anteriormente.
9. Añadir 100 μl de tampón HH a los 60 pocillos internos.

5. Primera Ronda de Imágenes en Vivo para Medir los Niveles Basales de ROS y la Morfofonción Mitocondrial (± 15 min)

1. Asegúrese de que el software de adquisición esté operativo y de que se cargue el protocolo de imagen.
2. Instale la placa en el microscopio, encienda el hardware baSed y utilice bien el B01 para ajustar el desplazamiento del autofoco utilizando el canal TMRM. Dado que este procedimiento induce un incremento en la intensidad de la señal de DCFDA de CM-H ₂ , este pozo se excluye del análisis de la imagen aguas abajo.
3. Ejecute el protocolo de generación de imágenes.

6. Segunda ronda de imágenes en vivo después de la adición de TBHP para medir los niveles de ROS inducidos (± 20 min)

1. Retire con cuidado la placa de 96 pocillos del microscopio.
2. Añadir 100 μl de TBHP WS III (40 μM) a cada pocillo usando una pipeta multicanal (Esto da como resultado una concentración de TBHP de 20 μM en los pocillos). Este compuesto se utiliza como un control positivo interno para la tinción CM-H ₂ DCFDA (la señal debe aumentar), así como un medio para medir los niveles de ROS inducidos.
   NOTA: H ₂ O ₂ también se puede usar en lugar de TBHP, pero este compuesto es menos estable y por lo tanto menos confiable.
3. Espere al menos 3 minutos para permitir la reacción completa de TBHP wCon CM-H _$ ₂ _$ DCFDA.
4. Durante este tiempo, añada 100 μl de solución de trabajo de anticuerpos (1 / 1.000) al pocillo A01.
5. Montar la placa de nuevo en el microscopio y comprobar el enfoque de nuevo con el pozo B01.
6. Adquirir las mismas posiciones que en la primera ronda de imágenes utilizando el mismo protocolo de imagen.
7. Exportar los conjuntos de datos adquiridos en una sola carpeta como archivos tiff individuales usando una nomenclatura estandarizada que incluye referencia a la placa, tratamiento previo o posterior al TBHP, pozo, campo y canal, separados por subrayados, por ejemplo . 'P01_Pre_B02_0001_C1' para la placa 1, tratamiento previo al TBHP, pozo B02, campo 1 y canal 1. Esta información se utilizará durante el análisis de imágenes ( por ejemplo, para seleccionar los ajustes de segmentación apropiados), así como durante el análisis de datos (para conectar datos de análisis Con los tratamientos correctos).
8. Adquirir imágenes de campo plano para ambos canales en las cuatro posiciones alrededor del centro del pozo A01 usando el protocolo de adquisición. SalvaEm como archivos tiff individuales en la misma carpeta que las otras imágenes utilizando la siguiente nomenclatura estandarizada: 'P01_FF_A01_0001_C1' para la placa 1, campo 1 y canal 1. Asegúrese de que las señales están bien dentro del rango dinámico; En caso de saturación, utilizar una concentración más baja de la solución de trabajo del anticuerpo.
9. Deseche la placa o guárdela para su posterior procesamiento.
   NOTA: En lugar de retirar la placa del microscopio y utilizar una pipeta multicanal para añadir la solución TBHP, se puede instalar una pipeta automática en la platina del microscopio y conectarse con el software de adquisición para funcionar al recibir un disparador. Esto permite agregar TBHP a cada pozo directamente después de la primera adquisición, antes de pasar al siguiente pozo. De esta manera, cuando se termina la primera ronda de imágenes, la segunda puede comenzar de inmediato y todos los pozos habrán tenido el mismo tiempo de incubación con el TBHP.

7. Procesamiento y análisis de imágenes (± 30 min porPlaca de 96 pocillos)

NOTA: Todo el procesamiento de imágenes se realiza en FIJI (http://fiji.sc), una versión empaquetada de Freeware de ImageJ. Un guión dedicado fue escrito para el análisis automatizado de ROS intracelular - y las señales mitocondriales, así como parámetros morfológicos (RedoxMetrics.ijm, disponible a petición). Los algoritmos subyacentes se describen en Sieprath et al. ¹ .

1. Asegúrese de que FIJI esté instalado y en funcionamiento.
2. Inicie FIJI e instale el conjunto de macros (Plugins -> Macros -> Install ...). Esto invocará una serie de nuevos comandos de macro, así como un conjunto de herramientas de acción para optimizar los ajustes de análisis, como se muestra en la Figura 3A .
3. Abra la interfaz de configuración para establecer la configuración del análisis haciendo clic en el botón 'S' ( Figura 3B ).
   1. Seleccione el tipo de imagen, el número de canales y el pozo que se utilizóPara la adquisición de imágenes de campo plano.
   2. Indica qué canal contiene las células (CM-H ₂ DCFDA canal) o mitocondrias (TMRM-canal) y ajustar los parámetros de preprocesamiento y segmentación para cada canal en función de la calidad de imagen ( Figura 3B ). Marque las casillas de verificación 'Fondo' y 'Contraste' para realizar la sustracción de fondo o la ecualización adaptativa limitada del histograma de contraste ¹⁶ , respectivamente. Definir un sigma para Gaussian borrosidad de las células y laplaciana mejora de las mitocondrias. Seleccione un algoritmo de umbral automático y rellene los límites de exclusión de tamaño (en píxeles). Si se elige un umbral fijo en lugar de un algoritmo de umbral automático, rellene el umbral superior.
   3. Pruebe los ajustes de segmentación en algunas imágenes seleccionadas de los conjuntos de datos adquiridos abriéndolos y haciendo clic en los botones 'C' o 'M' en el menú para la segmentación de células o mitocondrias respectivamente,Y ajuste los ajustes si es necesario. Un ejemplo de resultado se muestra en la Figura 3C .
4. Ejecute el análisis por lotes en la (s) carpeta (s) de interés haciendo clic en el botón '#' y seleccionando la carpeta con las imágenes. Por carpeta, esto producirá un nuevo directorio 'Salida', que contiene conjuntos de ROI individuales (archivos zip) y archivos de resultados (.txt) por imagen. Para ambos canales el archivo de resultados contiene intensidad y descriptores morfológicos. El archivo de resultados CM-H ₂ DCFDA (células) contiene por descriptor el valor promedio de los ROI combinados dentro de una imagen. Para el canal TMRM, el archivo de resultados contiene por descriptor el valor de cada ROI mitocondrial segmentado individualmente.
5. Después del análisis por lotes, verifique visualmente el rendimiento de la segmentación en una "pila de verificación", una hiperstack de todas las imágenes con su respectiva superposición de ROI haciendo clic en el botón 'V'. De esta manera, artefactos como el sobre-/ Undersegmentation, fuera de las imágenes de enfoque o partículas de polvo / fibras en las imágenes ya se pueden detectar rápidamente. Se puede realizar una curación adicional durante el control de calidad de datos (cfr. § 8).

8. Análisis de datos, control de calidad (QC) y visualización

El procesamiento y el análisis de los datos en bruto se realiza utilizando el software de estadística R (http://www.rproject.org - versión 3.3.2) y RStudio (http://www.rstudio.com/ - versión 1.0.44). Para obtener y visualizar rápidamente los resultados, se ha concebido una aplicación intuitiva Shiny ¹⁷ (disponible a petición) que integra y visualiza los datos en heatmaps y boxplots, y también realiza análisis estadísticos. En general, el flujo de trabajo consta de dos pasos consecutivos. En primer lugar, los datos se procesan e inspeccionan por placa de 96 pocillos para detectar puntos de datos aberrantes. En segundo lugar, los datos curados de todas las placas de un experimento dado se combinan y analizan utilizando no paramétrico multiPruebas variables ¹⁸ y un análisis de componentes principales.

1. Asegúrese de que R y RStudio están instalados y operativos.
2. Inicie RStudio.
3. Abra la aplicación brillante RedoxMetrics y ejecute la aplicación (elija ejecutarla en un navegador externo).
4. En la página "entrada", seleccione el directorio donde se encuentran los archivos de resultados de RedoxMetrics.ijm.
5. Asegúrese de que 'Setup.xlsx' (creado en el paso 3.15) también está presente dentro de este directorio.
6. Los archivos de resultados y la información de configuración se importan, reordenan y visualizan automáticamente.
   1. La página 'configuración experimental' muestra el diseño del experimento. Utilice esta página para verificación.
   2. En la página siguiente, 'results per plate' muestra los datos de cada placa por separado en un diseño de placa de múltiples pocillos con códigos de colores, así como en los boxplots con outliers marcados con el nombre del pozo y el número de imagen. Este último permite fácil inspección e ident(Valores extremadamente altos o bajos comparados con los valores medios medidos para ese tratamiento específico - ver Figura 4 para un ejemplo).
      Utilizando esta información, verifique las imágenes correspondientes a los puntos aberrantes. Si se detectan anormalidades, deben ser eliminadas del análisis. La mayoría de las anormalidades son causadas por una segmentación incorrecta cuando (parte) de la imagen está fuera de foco, o cuando partículas de polvo altamente fluorescentes alteran la segmentación adecuada. Los casos extremos ya se pueden detectar rápidamente utilizando la herramienta de pila de verificación (paso 7.5), pero se descubren más sutiles en este paso. Cuando no se encuentre ninguna razón aparente o técnica para el valor aberrante, la imagen no debe ser eliminada del análisis.
   3. Opcional: cree una nueva hoja de cálculo llamada 'Drop.xlsx' con una sola columna llamada 'Drop'. En esta columna, liste los nombres de archivo (incluyendo la extensión ".tif") de todas las imágenesQue deben eliminarse del análisis (identificadas en el paso 7.5 o el paso 8.6.2). Sube este archivo usando la página 'entrada'.
   4. La página 'resultados de todo el experimento' muestra los resultados de todas las placas combinadas. Si se ha cargado un archivo de eliminación, este archivo se utiliza para eliminar los puntos de datos especificados del análisis.
      Para cada parámetro individualmente, los datos se normalizan por placa según sus respectivos controles. A continuación, se combinan los datos de todas las placas, seguidas de las pruebas multivariadas no paramétricas del paquete nparcomp ¹⁸ . Si sólo se comparan dos tratamientos se realizan dos pruebas de muestra para el problema no paramétrico de Behrens-Fisher. Para más de 2 tratamientos, se utiliza una prueba de comparación múltiple no paramétrica basada en contraste. Los resultados se visualizan utilizando los boxplots.
   5. La página 'análisis de clúster' muestra los resultados de un análisis de componentes principales (paquetes de 'estadísticas' de PCA - R). Los datos de 5 parámetros (baSal y ROS inducido, y potencial de membrana mitocondrial, tamaño y circularidad) se combinan para discriminar los diferentes tratamientos basados ​​en un perfil redox sensible. Con este fin, se realiza un análisis de componentes principales (PCA) (paquete de stats de R core). Los resultados se visualizan usando un biplot (paquete ggbiplot - http://github.com/vqv/ggbiplot).
   6. Utilice la página "descargar datos" para descargar los marcos de datos de back-end que contienen los datos procesados ​​y reorganizados de tal manera que puedan ser reutilizados para una visualización de datos o análisis estadísticos más avanzados.
      NOTA: Los peligros típicos y las posibles soluciones se enumeran en la Tabla 1 .

Resultados

El ensayo se ha comparado utilizando varios experimentos de control, cuyos resultados se describen en Sieprath et al. ¹ . En resumen, se ha cuantificado la respuesta de fluorescencia de CM-H ₂ DCFDA y TMRM a cambios inducidos por extrano en ROS intracelular y Δψ _m respectivamente para determinar el rango dinámico. Para CM-H ₂ DCFDA, el NHDF mostró un incremento lineal en la señal de fluorescencia cuando se trató con ...

Discusión

Este artículo describe un método de microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles intracelulares de ROS y morfofonción mitocondrial en NHDF. Su desempeño se demostró con un estudio de caso sobre NHDF tratado con SQV. Los resultados apoyan la evidencia anterior de la literatura en la que se han observado niveles elevados de ROS o disfunción mitocondrial después del tratamiento con inhibidores de la proteasa del VIH de tipo 1, aunque en experimentos separados ^19...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM)	ThermoFisher Scientific	T668
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)	ThermoFisher Scientific	C6827
Dimethyl sulfoxide	Sigma)Aldrich	D8418
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded	Brooks life science systems	MGB096-1-2-LG-L
HBSS w/o Phenol Red 500 mL	Lonza	BE10-527F
DMEM high glucose with L-glutamine	Lonza	BE12-604F
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg	Lonza	BE17-516F
HEPES 1 M 500 mL	Lonza	17-737F
Trypsin-Versene (EDTA) Solution	Lonza	BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-166-152	Antibody used for acquiring flat-field image
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-546-152	Antibody used for acquiring flat-field image
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Nikon Ti eclipse widefield microscope	Nikon
Perfect Focus System (PFS)	Nikon		hardware-based autofocus system
CFI Plan Apo Lambda 20X objective	Nikon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module	Nikon		This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g
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