Síntesis de biocompatibles de cristal líquido de elastómero Espumas como andamios celulares para 3D espaciales Cultivos Celulares

Resumen

Este estudio presenta una metodología para preparar 3D,, andamios celulares similares a espuma biodegradables a base de la cadena lateral elastómeros de cristal líquido biocompatibles (LCE). experimentos de microscopía confocal muestran que las LCE similares a espuma permiten para la fijación celular, la proliferación y la alineación espontánea de mioblastos C2C12s.

Resumen

A continuación, presentamos una preparación paso a paso de un 3D, andamio celular biodegradable, similar a la espuma. Estos andamios se prepararon mediante reticulación bloque en estrella co-polímeros que ofrecen unidades de colesterol como grupos colgantes de la cadena lateral, lo que resulta en esméctica-A (SMA) elastómeros de cristal líquido (LCE). andamios de tipo espuma, preparados utilizando plantillas de metal, disponen de microcanales interconectados, lo que permite adaptarse como andamios de cultivo de células 3D. Las propiedades combinadas de la estructura regular de la espuma metálica y del resultado elastómero en un andamio celular 3D que promueve la proliferación celular no sólo mayor en comparación con las películas convencionales porosos con plantilla, sino también una mejor gestión de transporte de masa (es decir, nutrientes, gases, residuos , etc.). La naturaleza de la plantilla de metal permite la fácil manipulación de formas de espuma (es decir, rollos o películas) y para la preparación de los andamios de diferentes tamaños de poro para diferentes estudios de células mientras que preserva el interconexionested naturaleza porosa de la plantilla. El proceso de grabado no afecta a la química de los elastómeros, preservando su naturaleza biocompatible y biodegradable. Se demuestra que estos LCE esmécticas, cuando se cultiva durante períodos de tiempo extensos, permiten el estudio de construcciones de tejido clínicamente relevantes y complejos mientras que la promoción del crecimiento y proliferación de las células.

Introducción

Hay varios ejemplos de materiales sintéticos biológicos y biocompatibles diseñado para su aplicación en estudios de células y para la regeneración de tejidos con el objetivo de fijación y proliferación ^{1, 2, 3, 4, 5} de la célula. Ha habido unos pocos ejemplos de materiales biocompatibles, conocidos como elastómeros de cristal líquido (LCE), que podrían responder a los estímulos externos con anisotrópico molecular ordenar ^{6, 7.} LCE son materiales estímulos-respuesta que combinan las propiedades mecánicas y elásticas de los elastómeros con la funcionalidad óptica y ordenamiento molecular de los cristales líquidos ^{8, 9.} LCE pueden experimentar cambios de forma, la deformación mecánica, comportamiento elástico, y propiedades ópticas en respuesta a stim externosuli (es decir., calor, estrés, luz, etc.) ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Estudios anteriores han demostrado que los cristales líquidos (CL) pueden detectar el crecimiento y la orientación de células ^{4, 17.} Es posible entonces asumir que las LCE pueden ser adecuados para aplicaciones biológica y médicamente relevantes, incluyendo andamiaje celular y alineación. Hemos informado anteriormente de la preparación de esmécticas películas biocompatibles, biodegradables, moldeados a presión, y LCE delgadas que ofrece un "tipo de queso suizo" morfología porosa ^{6, 18.} También preparamos LCE biocompatibles nemáticos con morfología globular como andamios para el crecimiento celular ^{19 20. Nuestro trabajo se ha dirigido a la sintonía de las propiedades mecánicas de los materiales para que coincida con las del tejido de interés 21. Además, estos estudios se centran en la comprensión de las interacciones célula-elastómero, así como la respuesta celular cuando los elastómeros están sujetos a los estímulos externos.}

Los principales retos fueron en parte para adaptar la porosidad de las LCE para permitir la unión celular y permeación a través de la matriz de elastómero y para un mejor transporte de masa. La porosidad de estas películas delgadas ⁶ permitido para la permeación celular a través de la mayor parte de la matriz, pero no todos los poros eran totalmente interconectada o tenía un tamaño más regular (homogénea) poro. a continuación, se informó sobre biocompatibles elastómeros LCE nemáticos con morfologías globulares. Estos elastómeros nemáticos permitidos para la fijación y proliferación de células, pero el tamaño de poro variaron solamente a partir de 10-30 micras, lo que impidió o limitado el uso de estoselastómeros con una amplia variedad de líneas de células de ^{19, 20.}

El trabajo previo de Kung et al. relativa a la formación de espumas de grafeno utilizando una plantilla de metal "sacrificial" mostró que la espuma de grafeno obtenido tenía una morfología porosa muy regular dictada por la plantilla de metal elegido ^22. Esta metodología ofrece un control total de la porosidad y tamaño de poro. Al mismo tiempo, la maleabilidad y flexibilidad de la plantilla de metal permiten la formación de una plantilla diferente da forma antes de la preparación de espuma. Otras técnicas, tales como la lixiviación de la materia ^23, de plantillas gas ^24, o fibras electro-hilado ^{25, 26} también ofrecen el potencial para la preparación de materiales porosos, pero son más tiempo y, en algunos casos, el tamaño de poro está limitado a sólo unos pocos micrómetros. Espuma-como las LCE 3D prepararon usando plantillas de metal permiten una carga de la célula superior; una tasa de proliferación mejorada; co-cultivo; y, por último pero no menos importante, una mejor gestión de transporte de masa (es decir, los nutrientes, gases y desechos) para asegurar el desarrollo del tejido completo ^27. LCE 3D similares a espuma también parecen mejorar la alineación de celdas; esto es más probable en relación con los colgantes LC detección de crecimiento celular y la orientación de la celda. La presencia de restos de LC en el LCE parece mejorar la alineación de células con respecto a la localización de células dentro del andamio LCE. Las células se alinean dentro de los puntales de la LCE, mientras que no se observa ninguna orientación clara donde los puntales se unen (uniones) ^27.

En general, nuestra plataforma de andamio celular LCE como un medio de soporte celular ofrece oportunidades para sintonizar la morfología de elastómero y las propiedades elásticas y dirigir específicamente la alineación de los tipos de células (individuales) para crear un pedido, arreglos espaciales océlulas F similares a los sistemas vivos. Además de proporcionar un andamio capaz de sostener y dirigir el crecimiento celular a largo plazo y la proliferación, las LCE también permiten para los experimentos dinámicos, donde la orientación de células y las interacciones pueden ser modificados sobre la marcha.

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Protocolo

NOTA: Los siguientes pasos para la preparación de espuma como LCE 3D utilizando el copolímero de bloques en estrella 3-brazo se muestran en la Figura 1. Para la caracterización por resonancia magnética nuclear (RMN), los espectros se registran en cloroformo deuterado _(CDCl3) a temperatura ambiente en un espectrómetro Bruker DMX instrumento 400-MHz e internamente referencia picos residuales a 7,26. Transformada de Fourier de infrarrojos espectros (FT-IR) se registran usando un espectrómetro 33 FT-IR de Bruker Vector usando el modo de reflectancia total atenuada. Para cada paso de la siguiente protocolo, es importante usar ropa de protección personal adecuado (PPE).

1. Síntesis de α-cloro-ε-caprolactona (monómero) (según el procedimiento en Jérôme et al. ²⁸⁾

1. Antes de iniciar la síntesis, purificar 27 g de ácido 3-cloroperbenzoico como sigue:
   1. En 800 ml de agua destilada, añadir 1,28 g de sodiofosfato monobásico monohidrato y 8,24 g de fosfato dibásico de sodio heptahidrato. Ajustar el pH a 7,4 (usando hidróxido sódico o ácido clorhídrico) y reserva 30 ml de esta solución; esta es la solución tampón.
   2. Usando un embudo de separación, se disuelve ácido 3-cloroperbenzoico en 35 ml de éter dietílico. Se lava la solución orgánica con 10 ml de solución tampón (preparado en la etapa 1.1.1.). Repita el lavado tres veces.
   3. Añadir 3 g de sulfato de sodio directamente a la solución orgánica; este agente de secado absorbe el agua de la solución orgánica.
   4. Se filtra la solución para eliminar el agente de secado. Se concentra el filtrado a presión reducida usando un evaporador rotatorio a 850 mbar y 40 ° C.
2. Solubilizar 18,5 g de ácido 3-cloroperbenzoico purificada en 150 ml de diclorometano seco mediante agitación en un baño de ultrasonidos; este proceso típicamente tarda 20 min. Coloque la solución dentro de un embudo de separación.
3. Dentro de una de dos bocas, de fondo redondo,disolver 13,1 g de 2-clorociclohexanona en 15 ml de diclorometano seco usando un agitador magnético en atmósfera de gas nitrógeno. Mantener la agitación.
4. Montar el embudo separador que contenía solución de ácido 3-cloroperbenzoico (del paso 1.2) al matraz de dos bocas en el paso 1.3. Enjuague el sistema con gas nitrógeno. Ajustar la apertura del embudo de separación de modo que la solución de ácido cloroperbenzoico cae gota a gota en la solución de 2-clorociclohexanona (1 gota cada dos segundos) y continuar agitando la mezcla bajo gas nitrógeno durante 96 h.
5. Se enfría la mezcla de reacción a -20 ° C durante 1 h para precipitar el subproducto ácido m-clorobenzoico (m -CBA).
6. Filtrar el ácido clorobenzoico m (m -CBA) y lavar la solución remanente con soluciones saturadas de tiosulfato de sodio, bicarbonato de sodio, y cloruro de sodio.
7. Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio a 850 mbar y 40 ° C. Se purifica el amarillo jabón l pálido, viscosoIdentificación por destilación a presión reducida a 2,3 Torr y 96 ° C.
8. Monitorear el éxito de la síntesis, usando los siguientes ¹ picos H RMN. ¹ H RMN (400 MHz, _CDCl3, δ [ppm]): 4,75-4,68 (m, 1H, C H ClCO), 4,37-4,26 (m, 1H, C H ₂ O), 4.18 a 4.5 (m, 1H , C H ₂ O), y 2,06-1,58 (m, 6H, -C H ₂ -) ^{6, 27.}

2. Síntesis de α-Three-brazo de la estrella de Copolímero de Bloque (SBC-αCl) por Ring Copolimerización de apertura (Sharma et al. ⁶ y Amsden et al. ²⁹⁾

1. Antes de la síntesis, silanizar una ampolla de 20 ml llenándolo con un (v / v) de solución al 2% de 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctiltrietoxisilano en tolueno y de agitar durante aproximadamente 24 h. Enjuague con alcohol isopropílico y se seca colocándolo en un horno a 140 ° C durante 30 min.
2. Añadir 30,64 g de agua destilada ε-caprolactona, 0,5 g de α-cloro-ε-caprolactona, y 0,25 ml de glicerol a la ampolla. Mezclar utilizando un vortex durante 1 min.
3. Añadir 4,90 g de D, L-lactida a la ampolla y purgar con nitrógeno. Coloque la ampolla en un horno a 120 ° C para fundir la D, L-lactida; Este proceso generalmente dura aproximadamente 2 h. Mezclar de nuevo usando un vórtice para asegurarse de que todos los contenidos se mezclan bien y añadir 66 l de estaño (II) 2-etilhexanoato (Sn (Oct) ₂₎ a la ampolla.
   NOTA: D, L-lactida se enfriará durante este proceso y tendrá que ser re-calentado en el horno para fundir.
4. Mezclar vigorosamente por última vez usando el vórtice y enjuague con nitrógeno.
5. Cierre la ampolla con un tapón de goma. Coloque una aguja conectada a un tubo de vacío (el vacío de la casa es generalmente suficiente) a través del tapón de goma. A su vez en el vacío y, usando una llama, fundir el cuello largo del cristal, torciendo lentamente hasta que la glass colapsa sobre sí misma. Tenga cuidado de no fundir el tapón de goma. Una vez que la ampolla es de llama sellado, colocarlo en un baño de arena, un horno, o elemento de calentamiento adecuado a 140 ° C durante 48 h.
6. Sacar la ampolla y dejar que se enfríe a temperatura ambiente.
7. Romper la ampolla en la marca de sellado y se disuelve el líquido altamente viscoso mediante la adición de 10 ml de diclorometano. Transferir la solución a un embudo de decantación.
8. Preparar un matraz que contenía 100 ml de metanol frío (enfriado utilizando un baño de hielo seco / acetona a una temperatura alrededor de -78 ° C). Fijar el embudo de separación (etapa 2.7) en la parte superior del matraz. Ajustar la apertura del embudo de separación de manera que aproximadamente dos gotas caen cada otro segundo (gota a gota).
9. Recoger el precipitado blanco por filtración (usando un filtro de papel) y se seca en una estufa de vacío entre 50 y 60 ° C.
10. Monitorear el éxito de la síntesis, usando los siguientes ¹ H RMN y FT-IR picos. ¹ H RMN (400 MHz, _CDCl3, Δ [ppm]): 5.29 a 5.3 (m, COC H C H _3), 4,43-4,25 (m, C H Cl), 4.24 a 4.12 (m, C H ₂ O), 4.11 a 4.3 (t, J = 4,6 Hz, C H ₂ O), 3,80-3,68 (m, C H C H _2), 3,09-2,64 (ancho, S, O H), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, H α-), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, H α-), y 1,77-1,25 (m, C H _2, C H _3); FT-IR (1 / λ [cm ^-1]): 2932 (s), 2869 (m), 1741 (s), 961 (s), 866, y 735 (m) ^{6, 27.}
    Nota: Para preparar un LCE 3D más hidrófilo, preparar un copolímero de bloque lineal (LBC) en lugar de un SBC, siguiendo el procedimiento de apertura del anillo de copolimerización (ROP) descrito anteriormente.
    1. Añadir 0,3 g de polietilenglicol (PEG), 3,15 g ε-caprolactona, 1,0 g de α-cloro-ε-caprolactona, y 5,0 g de D, L-lactida a la mezcla vial silanizado.

3. Modificación sintético de α-Cl de tres brazos SBC a αN ₃ -Tres Arm SBC (SBC-αN ₃₎ (Según Sharma et al. ⁶⁾

1. En un matraz de fondo redondo y en atmósfera de nitrógeno, se disuelven 5 g de SBC-αCl en 30 ml de seco N, N'-dimetilformamida.
2. Añadir 0,22 g de azida de sodio y se deja reaccionar durante la noche a temperatura ambiente.
   Precaución: La azida sódica es tóxica; usar ropa de protección personal (EPP) apropiado.
3. Eliminar la N, N'-dimetilformamida bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio a 11 mbar y 40 ° C. Disolver la mezcla en 30 ml de tolueno. Centrifugar la solución tres veces a 2.800 xg durante 15 min para eliminar la sal formada. Se evapora el tolueno a presión reducida usando un evaporador rotatorio a 77 mbar y 40 ° C.
4. Monitorear el éxito de la sustitución de azida usando ¹ H RMN y FT-IR picos.
   NOTA: ^{Espectro de RMN 1H fue similar al padre SBC-αCl, con la excepción de la aparición de un pico a 3,90 ppm en relación con el grupo azida; FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2928, 2108 (s, azida), 1754 (s), 1450 (s), 960 (m), 865 (s), 733 (s), y 696 (metro).}

4. Síntesis de colesterilo 5-Hexynoate (LC Resto) (Según Sharma et al. ⁶ y Donaldson et al. ³⁰⁾

1. En un matraz de fondo redondo, la mezcla 3 g de ácido 5-hexinoico y 130 ml de diclorometano. Enfriar a 0 ° C usando un baño de hielo.
2. En otro matraz de fondo redondo, mezclar 8,28 g de N, N'-diciclohexilcarbodiimida N', 10,3 g de colesterol y 0,2 g de 4-dimetilaminopiridina.
3. Transferir la solución de ácido gota a gota 5-hexinoico al matraz que contiene la mezcla de colesterol y mantener la mezcla final a 0 ° C durante 1 h.
4. Dejar que la mezcla se caliente a la temperatura ambiente durante la noche.
5. Eliminar la diciclohexilurea precipitado resultante por filtración usando un filtro de papel de grado 415 y descartarlo.
6. Se concentra el filtrado a presión reducida usando un evaporador rotatorio a 850 mbar y 40 ° C. Disolver el residuo recogido en 150 ml de hexano.
7. Se evapora el disolvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio a 335 mbar y 40 ° C. Añadir 350 ml de etanol al residuo oleoso para recoger el producto final. Lavar el sólido formado con etanol y se seca el producto sólido bajo vacío a 50 ° C de color blanquecino.
8. Monitorear la síntesis, usando los siguientes ¹ H RMN y FT-IR picos. ¹ H RMN (400 MHz, _CDCl3, δ [ppm]): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1H, C H = C), 4,70-4,58 (m, 1H, C H OCO), 2,44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, C H ₂ CO), 2,34 (m, 2H, C H ₂ -C H =), 2,31 (m, 2H, C H ₂ C H ₂ -COO), 2,28 (s, 1H, MARIDOC≡C), 2,27 (d, J = 2,3 Hz, 2H, ≡CC H _2), 2.7 hasta 1.6 (m, 2H, C H _2, C H), 0,94 (s, 3H, C H _3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3H, C H ₃ C H), y 0,88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, C H ₃ -C H), 0,67 (s, 3H, C H _3). FT-IR (1 / λ [cm ^-1]): 2,830-2,990 (amplio y pico fuerte), 2104 (m), 1695 (s), 1428 (m), 1135 (m), 999 (s), 798 (s), y 667 (s).

5. modificación sintética de α-N ₃ -Tres Arm SBC a alfa-colesterilo de tres brazos SBC (SBC-αCLC) mediante una reacción de azida-alquino Huisgen Ciclo-adición ( "Click" Reaction) para obtener SBC-Chol (Según Sharma et al. ⁶⁾

1. En un matraz de fondo redondo, se disuelven 1 equivalente molar de SBC-αN ₃ (1,5 g) en 100 ml de tetrahidrofurano recién destilado (THF). Añadir 1,2 equivalenciadet molarest de colesterilo 5-hexynoate (1,94 g), 0,1 equivalente molar de cobre (I) yoduro (0.06 g), y 0,1 equivalente molar de trietilamina (0,03 g). Se agita la mezcla durante la noche a 35 ° C en atmósfera de nitrógeno.
2. Se evapora el disolvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio a 357 mbar y 40 ° C.
3. Disolver la mezcla residual en 80 ml de diclorometano y se centrifuga durante 5 min a 2800 xg a temperatura ambiente para eliminar los materiales sin reaccionar y los productos secundarios.
4. Monitorear la síntesis, usando los siguientes ¹ H RMN y FT-IR picos. ¹ H RMN (400 MHz, _CDCl3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH = C-triazol), 5,43-5,34 (m, C = CH colesterol), 5.10 a 5.6 (m, COCHCH _3), 4,68 -4,55 (m, O-CH colesterol), 4.24 a 4.19 (m, CH ₂ O), 4.18 a 4.13 (t, J = 5,0 Hz, CH ₂ O), 4.11 a 4.5 (t, J = 4,4 Hz, CH ₂ O), 2,47-2,41 (t, J = 4,9 Hz, COCH _2), 2.31 a 2.25 (m, COCH _2), 2.7 a 1.2 (m, CH ₂ , _CH3), 01.05 a 01.03 (s, CH _2, CH _3), 0,96 a 0,92 (d, J = 3,3 Hz, CH _2, CH _3), 0,91-0,87 (dd, J = 1,9 Hz, J = 1,8 Hz, CH _3), y 0,71 a 0,68 (s, _CH3). FT-IR (1 / λ [cm ^-1]): 3260 (s), 2920 (s), 1710 (s), 1460 (s), 1370 (s), 1240 (m), 1190 (s), 733 (s), y 668 (s).

6. Síntesis de 2,2-Bis (1-caprolactona-4-il) propano (Crosslinker, BCP) (De acuerdo con Gao et al. ²⁷ y Albertsson et al. ³¹⁾

1. En un matraz de fondo redondo, preparar una solución que contiene 10,8 g de 2-bis (4-hidroxi-ciclohexil) propano y 52 ml de ácido acético.
2. Preparar una solución que contiene 11 g de trióxido de cromo en 50 ml de ácido acético y 8 ml de agua destilada. Añadir esta solución gota a gota a la solución preparada en el paso 6.1, manteniendo la temperatura de la mezcla entre 17 y 20 ° C (por ejemplo, en unabaño de agua); este proceso gota a gota tarda 2 h. Una vez que el proceso se ha completado, permitir que la solución en agitación durante aproximadamente 30 min.
3. Añadir 50 ml de 2-propanol. Se agita la solución durante la noche a temperatura ambiente.
4. Se concentra la solución de color púrpura oscuro bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio a 137 mbar y 40 ° C. Añadir 300 ml de agua destilada para precipitar; el precipitado debe ser ligero de color púrpura.
5. Filtrado el producto bruto usando un filtro de papel de grado 415. Se lava el material sólido con ~ 250 ml de agua destilada o hasta que el sólido se convierte en blanco.
6. Se disuelve el material sólido en 15 ml de benceno a 40 ° C y se deja recristalizar a 25 ° C.
7. Añadir 8,34 g de dicetona seco se disolvió en diclorometano seco y una solución que contiene 6,0 g de ácido 3-cloroperbenzoico en 75 ml de diclorometano al matraz.
8. Se calienta a reflujo la solución a 40 ° C durante 24 h.
9. Se enfría la mezcla de reacción a -20 ° C durante 10 min para precipitar el m subproducto ácido clorobenzoico.
10. Retire m ácido clorobenzoico mediante filtración (usando un filtro de papel) y se concentra la solución a presión reducida.
11. Se lava el producto en bruto de viscosa con 200 ml de 2-heptanona y secar el precipitado a vacío a 50 ° C durante la noche.
12. Monitorear la síntesis, usando los siguientes ¹ H RMN y FT-IR picos. ¹ H RMN (400 MHz, _CDCl3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, C H ₂ OC = O), 04/21 a 04/15 (t, 2H, J = 11,3 Hz, C H ₂ OC = O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2H, C H ₂ COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, C H ₂ COO), 2,04-1,93 (m, 4H, -C H ₂ CH ₂ OC = O), 1,70-1,56 (m, 4H, -C H ₂ C H ₂ COO), 1,48-1,38 (m, 2H, - C H C _{(CH3) 2),} y 0,84 (s, 6H, C H ₃ C-).

7. Creación de Porous 3D Elastómero Andamios Utilizando cualquiera de diisocianato de hexametileno (HDI) o 2,2-Bis (1-caprolactona-4-il) propano (BCP) ²⁷ como reticulantes (Según Gao et al. ²⁷⁾

1. Preparar la mezcla de elastómero de tres brazos usando 0,75 g de SBC-αCLC mediante la adición de 0,25 ml de HDI (o 0,45 mL de BCP) y 0,24 ml de monómero de ε-caprolactona destilada. Añadir 60 l de Sn (Oct) _2. Si se utiliza BCP en lugar de HDI, mezclar SBC-αCLC y BCP utilizando un vórtice y colocarlos en un horno a 140 ° C hasta que la BCP se funde y se disuelve completamente (este paso puede tardar hasta 2 h). Una vez que el BCP se ha disuelto, se saca del horno y, el Sn (Oct) _2, y vórtice.
2. Preparar una plantilla de espuma de níquel "sacrificial" cortando un trozo cm de metal 1 x 4. Rodar desde uno de los extremos cortos de modo que el rollo final es aproximadamente una pieza de metal 1 x 1 cm (véase la figura 4).
3. Ponga la espuma de níquel en un paquete de la hoja vial de vidrio o aluminio y verter la mezcla preparada en la etapa 7.1 para cubrir totalmente la espuma de 2 min. Eliminar el exceso de mezcla con una pipeta Pasteur. Dejarlo en una noche horno a 80 ° C.
4. Desprenda la lámina de aluminio o romper el vidrio. Utilizando una hoja de afeitar, afeitar el elastómero alrededor de la espuma metálica para exponer el metal de níquel.
5. Preparar M de hierro (III) cloruro de 1 (FeCl ₃₎ solución en 100 ml de agua. Coloque la espuma en un matraz y añadir 70 ml de solución de _FeCl3. Agitar durante tres días a temperatura ambiente y cambiar la solución de _FeCl3 todos los días. Antes de cada cambio, se agita la espuma con el agua ionizada durante 0,5 h.
   NOTA: El proceso de grabado se completa generalmente después de tres días. Para asegurar que el proceso de grabado se ha completado, realizar pruebas de compresión táctiles hasta las espumas sienten suaves. resistencia de la espuma a ensayos de compresión táctiles indica la presencia de una plantilla de metal residual.
6. Enjuague el ELASTespuma Omer con etanol y colocar en un horno de vacío durante la noche a 40 ° C.
7. Caracterizar los materiales usando microscopía electrónica de barrido (SEM), calorimetría diferencial de barrido (DSC), pruebas de compresión mecánica, y el análisis termogravimétrico (TGA) ^27.
   NOTA: Para la preparación de un LCE 3D más hidrófilo, reemplace la SBC con LBC (asegurándose de que la LBC también contiene un resto LC) siguiendo los pasos descritos en el paso 7.5.

8. La siembra de elastómero Andamios con células SH-SY5Y neuroblastoma y de cultivo utilizando técnicas estériles

1. Esterilizar el elastómero por lavado dos veces con 1 ml de etanol al 70%. Realizar la irradiación UV durante 10 min y se lava con 1 ml de etanol al 70%. Enjuague dos veces con 1 ml de agua estéril y 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Coloque los elastómeros en placas de cultivo de 24 pocillos.
2. Preparar medio de crecimiento celular para SH-SY5Y que contiene 90% Dulbecco Modificado suplem medio Eagle (DMEM)entados con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep).
3. Después de contar las células usando un hematocitómetro, la obtención de 1.5 x 10 ⁵ células SH-SY5Y en suspensión en 100 l de medio de crecimiento (solución de semillas). Añadir la solución en la parte superior de los elastómeros, asegurándose para formar una gota.
4. Incubar los elastómeros sembraron a 37 ° C y 5% de _CO2 durante 2 h para promover la adhesión celular. Añadir 0,5 ml de medio de crecimiento. Incubar de nuevo a 37 ° C con 5% de _CO2.
5. Cambiar el medio cada dos días después de lavado con 1 ml de PBS.

9. Imaging microscópico de Elastómero Construct

1. Fijar las células cultivadas en elastómeros con 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS durante 15 min. Enjuague con 3 ml de PBS tres veces durante 5 min cada uno y colocar el elastómero con las células fijadas en una placa de cultivo con un cubreobjetos adjunto.
   Precaución: PFA es tóxico. Use ropa de protección personal (EPP) apropiado.
2. Staen las muestras fijadas con 0,1% de 4' , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en 500 l de PBS durante 10 min y enjuague dos veces con 1 ml de PBS durante 5 min.
3. Inmediatamente los elastómeros imagen utilizando microscopía confocal de fluorescencia con DAPI, la adquisición de pilas de imágenes que abarcan la muestra.
   NOTA: En este caso, las pilas de imágenes fueron adquiridas utilizando un objetivo de 20x y un objetivo de 60X.
4. Analizar las pilas de imágenes confocal óptica usando ImageJ ^32.

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Resultados

Este informe muestra el método de preparación de un LCE 3D poroso como un andamio para el cultivo celular utilizando una plantilla de metal de níquel. El LCE 3D obtenida demuestra una compleja red interconectada de canal que permite la infiltración de células fácil, así como el transporte de masa más adecuado ^27. Se encontró que las células son capaces de penetrar completamente la red de canales interconectados y también son capaces de alinear dentro de...

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Discusión

elastómeros cristalinas líquidas han sido recientemente estudiado como andamios celulares biocompatibles debido a su capacidad de respuesta estímulos. Ellos han demostrado ser plataformas ideales como andamios celulares. Sin embargo, un factor importante a tener en cuenta en la preparación y el diseño de un nuevo andamiaje LCE es la porosidad. La incorporación de los sólidos lixiviables ²³ o gases no siempre resulta en la porosidad homogénea o poros totalmente interconectados. El uso de u...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Reagent
2-chlorohexanone	Alfa Aesar	A18613	Reagent
2-heptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagent
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Nuclear Stain
5-hexynoic acid	Alfa Aesar	B25132-06	Reagent
Acetic acid	VWR	36289	Solvent
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagent
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolactone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagent
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagent
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagent
Copper(I) iodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagent
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Diethyl ether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixative
Fetal bovine serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe	VWR	28320	Filtration
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Iron(III) chloride	Alfa Aesar	12357	Etching agent
Isopropyl alcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nickel metal template	American Elements	Ni-860	Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cell line
Penicillin streptomycin	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagent
Sodium azide	VWR	97064-646	Reagent
Sodium bicarbonate	AMRESCO	865	Drying salt
Sodium chloride	BDH	BDH9286	Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Scientific	S-374	Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma Aldrich	S9638	Drying salt
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313	Drying salt
Tetrahydrofuran	Alfa Aesar	41819	Solvent
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate	Aldrich	S3252	Reagent
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent
Trypsin	HyClone	SH30042.01	Cell Detachment
Olympus FV1000