Un método versátil de Patterning proteínas y células

Resumen

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Resumen

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Introducción

En la ingeniería de tejidos y biosensores, la capacidad de controlar la organización espacial de las proteínas y células en una escala de micras, se ha convertido cada vez más importante en los últimos cuatro décadas ^{1, 2, 3.} Organización espacial precisa de las proteínas y células ha permitido a los investigadores examinar la interacción entre las células y sustratos que contienen tipos similares o diferentes de células, para guiar el crecimiento celular, y para inmovilizar biomoléculas para la fabricación de biosensores ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Los métodos actuales de proteínas de modelado incluyen photopatterning y la impresión por microcontacto. Photopatterning utiliza material sensible a la luz que se entrecruza con la exposición a ultruna violeta (UV). Luz UV dirigida a una fotomáscara (que consta de zonas transparentes con regiones más oscuras para prevenir la transmisión de luz UV) provoca reticulación en regiones específicas que luego se pueden utilizar para la unión subsiguiente de los biomateriales o células ^{10, 11.} Aunque este esquema es muy precisa y permite un control preciso de la topografía de la superficie de cultivo, que se limita a biomoléculas sensibles a UV que pueden ser modeladas por la radiación UV ^12. La impresión por microcontacto es otro método popular de proteínas específicas modelando ^{13, 14.} En este método, un siloxano (PDMS) sello de poli-dimetil se trata con una variedad de reactivos de modificación de la superficie antes de ser sumergida en una solución del sustrato biomolecular elegido. A continuación, se presiona suavemente sobre un cubreobjetos de vidrio u otra superficie de este modo el "sacrificio" de la biomolécula sobre la superficie de cultivo. HoWever, estampado se limita al tipo de material que puede ser transferida, así como la humectabilidad de las biomoléculas a la superficie de los PDMS sello ^15.

Patrón directa de las células puede ser más difícil y se basa en métodos complejos tales como sustratos conmutables, métodos basados en la plantilla, o patrones con las moléculas de adhesión celular específicos ^{16, 17.} Estos métodos están limitados en su capacidad de células de patrón debido a la falta de sustratos de adhesión celular compatibles, incompatibilidad de que el proceso funcione con células sensibles biológicos y limitaciones, la inconsistencia en la reproducción del patrón, y la complejidad del procedimiento. Por ejemplo, con sustratos conmutables, sustratos personalizados necesitan ser diseñadas para cada tipo de célula, para cambiar su adhesión a tipos celulares específicos sin la degradación a la exposición a la luz UV y calor usado en proceso ^17, < SUP = "xref"> ^{18, 19, 20.} procedimientos de modelado en base de la plantilla son versátiles en su capacidad de células de patrón; sin embargo, es difícil de fabricar plantillas de PDMS en los espesores adecuados para uso ^{16, 21.} La inyección directa de células en los canales de microfluidos PDMS tiene algunas ventajas, tales como: 1) la facilidad de fabricación de canales de microfluidos y 2) de idoneidad para muchas células y sustratos diferentes. Sin embargo, el problema frecuente de la captura de burbujas de aire durante el proceso de inyección debido a la hidrofobicidad de PDMS sin el uso de limpieza de plasma, u otros métodos para reducir las burbujas de aire, hace que sea difícil crear consistentemente células modelados en el vidrio o de plástico superficies ^21.

Este trabajo amplía micromoldeo capilar ^{22, 23,}lass = "xref"> ^{24, 25, 26} y reporta un método para inyectar proteínas celulares y suspensiones en microcanales. El método utilizado aquí demuestra el patrón de sustratos y ambos patrones directa e indirecta de determinados tipos de células. Esta técnica supera la alta hidrofobicidad de PDMS y elimina la presencia de burbujas durante la inyección de cualquiera de los sustratos o las células mediante el aprovechamiento de la permeabilidad al gas de PDMS ^27. Este documento muestra el uso de la técnica con varios sustratos diferentes y tipos de células. El artículo también destaca la fabricación de moldes para la litografía blanda usando fotolitografía convencional, así como un adhesivo simple y de bajo costo método de la cinta útil en entornos con recursos limitados ^{28, 29.}

Protocolo

NOTA: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. Algunos de los productos químicos utilizados en este protocolo son tóxicos y cancerígenos. Por favor, use todas las prácticas de seguridad apropiadas (campana de humos, guantera) y equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados) cuando se utilizan materiales tóxicos o ácido / base.

1. La fabricación de moldes maestros para litografía blanda usando fotolitografía

1. Dibuje el trazado de los microcanales utilizando una herramienta de dibujo de diseño asistido por ordenador (CAD).
2. Imprimir el diseño en una placa de máscara en blanco utilizando el escritor máscara láser.
3. Enjuagar una oblea de silicio de 4 pulgadas con acetona seguido por isopropanol y secar con una pistola de aire de nitrógeno para asegurar que ningún disolvente se deja en la oblea.
4. Deshidratar la oblea por cocción en una placa caliente a 200 ° C durante 5 min.
5. Seleccionar un fotorresistente negativo diseñado para la altura deseada de los microcanales. Fo ejemplo, utilizar fotoprotector negativo SU-8 50 para obtener microcanales con una altura de 50 m.
6. Deje que la oblea se enfríe a temperatura ambiente, y luego alinear la oblea en el plato de una recubridora de rotación.
7. Dispensar 4 ml (1 ml de diámetro / pulgada de la oblea) de resina fotosensible negativa sobre el centro de la oblea.
8. Girar la capa de la oblea con un ciclo de centrifugado en dos fases utilizando una ruleta. En primer lugar, aplicar un ciclo de propagación de 500 rpm con una aceleración de 100 rpm / s durante 10 s. A continuación, aplicar un ciclo de centrifugado de 2000 rpm con una aceleración de 300 rpm / s ² durante 30 s para obtener un revestimiento 50 micras de material fotorresistente sobre una oblea.
9. hornear la oblea suave en dos pasos en un plato caliente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para un recubrimiento de 50 micras de resina fotosensible, primera pre-hornear la oblea a 65 ° C durante 6 minutos y luego la rampa inmediatamente la temperatura de la placa caliente a la post-hornear la oblea a 95 ° C durante 20 minutos.
10. Deje que la oblea se enfríe a temperatura ambiente y después cargue ella oblea en el escenario litografía.
11. Alinear la máscara sobre la oblea usando alineador de máscara y exponer la oblea a la luz UV (según las instrucciones del fabricante) a una intensidad de 1,5 mW / cm ² para 146 s para aplicar la dosis total de UV de 220 mJ / cm ² requerida para una 50 m de espesor de capa de resina fotosensible.
12. Aplicar horneado posterior a la exposición a la oblea en dos pasos sobre una placa caliente. Para un recubrimiento de 50 micras de resina fotosensible, primera pre-hornear la oblea a 65 ° C durante 1 min e inmediatamente la rampa encima de la temperatura de la placa caliente a la post-hornear a 95 ° C durante 5 min.
13. Desarrollar la oblea en sumergiendo la oblea en el SU-8 desarrollador y agitando suavemente hasta que las funciones se aclaran en la oblea. Desarrollar la oblea de ~ 6 min para la fotoprotección de espesor de 50 micras.
14. Enjuague el exceso de revelador con isopropanol y etanol, y luego secar la oblea con una pistola de aire de nitrógeno.
15. Duro hornear la oblea de silicio sobre una placa caliente a 150 ° C durante 15 min.
16. Colocar eloblea en un desecador con 25 l de agente de silanización tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-triclorosilano.
    NOTA: El agente de silanización es corrosivo, por lo tanto se debe utilizar en una campana de extracción ácido / base, con el equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, cerrado-dedo del pie zapatos).
17. Aplicar el vacío durante 5 min y exponer la oblea a los vapores de silano durante 30 min sin liberar el vacío.
18. La transferencia de la oblea en una placa de Petri de tamaño adecuado.

2. La fabricación de moldes maestros para litografía suave con cinta adhesiva

1. Dibuje el trazado de los microcanales utilizando una herramienta de dibujo CAD e imprimir el dibujo sobre papel blanco.
2. Limpiar un portaobjetos de vidrio lo suficientemente grande para acomodar el diseño con isopropanol y luego secar el portaobjetos con una pistola de aire.
3. Pegue cinta adhesiva sobre el portaobjetos de vidrio limpia. Tenga cuidado no para atrapar las burbujas de aire.
4. Cinta de los lados de la glass deslice sobre el papel con el diseño, con la cinta hacia arriba.
5. Utilizar un bisturí para cortar la cinta en el portaobjetos de vidrio utilizando el diseño de papel como referencia y luego pelar la cinta de áreas no deseadas de la lámina de vidrio.
6. Enjuague el portaobjetos de vidrio con isopropanol y luego se seca con una pistola de aire. Hornear el portaobjetos de vidrio en un horno a 65 ° C durante 30 min.
7. rodar suavemente sobre la cinta con un rodillo de goma para eliminar las burbujas de aire y permitir que la corredera se enfríe a temperatura ambiente.

3. Fabricación suave Litografía de los dispositivos PDMS

1. Mezclar PDMS elastómero y su agente de curado en una relación de 10: 1 (w: w), se agita la mezcla vigorosamente, y luego desgasificar la mezcla colocándolo en una cámara de vacío hasta que no aparecen burbujas de aire en la mezcla.
2. Verter la mezcla en un molde de silicona del molde silanizado o cinta adhesiva en una placa de Petri para obtener un ~ 2 gruesa capa de PDMS y desgasificar mm hasta que todo el aire de las burbujas desaparecen.
3. Curar el PDMS en un hornoa 65 ° C durante 2 h.
4. Utilizar un bisturí para cortar la capa de PDMS al menos 5 mm de distancia de las características y luego pelar el PDMS curado fuera del molde usando pinzas.
5. Perforar un único orificio de entrada con una biopsia de 1 mm está en cualquier parte del microcanal, preferiblemente en el extremo de una red de microcanales como se ve en la Figura 2a y 4b.
6. Limpiar el PDMS emitidos con cinta adhesiva para eliminar las partículas de polvo adsorbidos en el dispositivo. Esterilizar el dispositivo de microcanales PDMS (PDMS fundido) de un enjuague con una solución de etanol al 70% seguido de agua desionizada estéril (DI), y exponer a los rayos UV durante 30 min.
7. Mantenga el dispositivo PDMS estéril en una placa de Petri estéril hasta su uso.

4. Sustrato Patrones

1. Coloque el PDMS estériles emitidos con unas pinzas sobre un cubreobjetos de vidrio estéril o placa de Petri y aplicar una suave presión con la punta de las pinzas.
   NOTA: El molde de PDMS realiza una conformación sello pero reversible con el glcubreobjetos culo o placa de Petri que forma microcanales sin el uso de ningún adhesivo.
2. Colocar una gota (20 - 40 l) de la solución de sustrato en la entrada que cubre completamente el orificio de entrada. Modelo de poli-D-lisina (PDL) mediante la colocación de una gota de 20 l de PDL en tampón de tetraborato de sodio en la entrada de los microcanales.
3. Poner la placa de Petri en un vacío de ~ 254 mmHgA (equivalente a vacío de la casa en laboratorios biológicos) durante 10 min, y observar aire que sale del canal en forma de burbujas.
4. Liberar el vacío y observar la solución de sustrato que fluye en el microcanal.
5. Incubar el plato en las condiciones apropiadas para la adhesión sustrato. Ver las Tablas 1 y 2 para las condiciones de incubación (estos varían dependiendo del sustrato). Para PDL patrón, se incuba durante 1 hora a 37 ° C.
6. cuidadosamente retire el sello de PDMS con unas pinzas estériles y se lava el patrón sobre cubreobjetos tres veces con agua DI.
7. Añadir una solución de 1% de albúmina de suero bovino (BSA) a la placa de Petri para cubrir el plato o el cubreobjetos de vidrio y se incuba durante la noche a 37 ° C.
   NOTA: Esto reducirá la adherencia no específica en las regiones no recubiertas.
8. Aspirar la solución de BSA al 1%, y el sustrato modelado ya está listo para usar.

5. Patrones indirecta de células

1. Preparar la suspensión de células en medio de cultivo libre de suero. El tipo de célula y la densidad celular se enumeran en la Tabla 1.
2. Añadir la suspensión de células a la placa de Petri con dibujos y sumergir completamente la región modelada en suspensión de células.
3. Incubar la placa de Petri a 37 ° C en una incubadora durante 15 minutos para permitir que las células se unan al sustrato modelado.
4. Aspirar el exceso de suspensión de células de la placa de Petri y se lavan las células con dibujos tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), mientras agitando suavemente durante 10 s para eliminar las células no unidas.
5. Añadir la unamedio de cultivo apropiadas, con a los cultivos celulares con dibujos y se incuban las células con dibujos a 37 ° C en una incubadora de CO _2.

6. Patrones directa de las células

NOTA: Esta técnica es una alternativa a los patrones de células indirecto descrito en la etapa 5. Sin embargo, a diferencia de en el paso 5, en esta técnica las células se modelan en las superficies de cultivo de tejidos con o sin recubrimiento de sustrato.

1. Esterilizar el dispositivo microfluídico de un enjuague con una solución de 70% de etanol seguido de agua DI.
2. Remojar el dispositivo durante la noche en una solución de 1% de BSA para evitar la adhesión celular a los PDMS.
3. Secar el dispositivo a temperatura ambiente y adjuntarlo a la parte inferior de la placa de Petri tratada con cultivo de tejidos.
4. Preparar la suspensión de células en medio de cultivo libre de suero. El tipo de célula y la densidad celular se enumeran en la Tabla 2.
5. Colocar una gota (4-8 l) de la suspensión celular, suficiente para llenar elmicrocanales, en la entrada que cubre por completo el orificio de entrada.
6. Poner la placa de Petri en un vacío de 10 min y observar aire que sale del canal en forma de burbujas. Liberar el vacío y observar la suspensión de células que fluye en el microcanal.
7. Incubar la placa de Petri en una incubadora para promover la adhesión de células como por las condiciones de incubación (dependerá de tipo de célula de modelado) mencionados en la Tabla 2. Añadir PBS a la placa de Petri sumergir el dispositivo de PDMS.
8. Pelar el PDMS con cuidado la placa de Petri con pinzas y lavar el patrón con PBS. Añadir medio de cultivo celular a la placa de Petri y colocar el cultivo de células en la incubadora.

Resultados

Este método permite que el patrón de proteínas y patrones indirecta de células usando sin salida canales de microfluidos con dimensiones tan pequeñas como 10 micras y equipo disponible en casi todos los laboratorios biológicos una vez que se hizo el molde maestro. Esta técnica se puede utilizar con los canales de microfluidos PDMS creados usando fotolitografía tradicional suave, o con canales de microfluidos PDMS creadas con cinta adhesiva de fabricación (Figura 1)

Discusión

Mientras que la fotolitografía convencional es una técnica bien establecida para la realización de moldes de litografía blanda, el equipo, los materiales y las habilidades necesarias para utilizar la fotolitografía convencional no están fácilmente disponibles para la mayoría de los laboratorios. Para los laboratorios que no tienen acceso a estos recursos, hemos presentado la fabricación de cinta adhesiva como un método de creación de moldes con características relativamente simples para dispositivos de micro...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS